全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（12）：2349–2356 http：// www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail：yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–08–18；修回日期：2011–11–29
基金项目：国家自然科学基金项目（30970134，30811140157，30771403）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：sfli@ippcaas.cn）
致谢：本研究中的大部分菊花样品由中国农业大学农学与生物技术学院园林植物与观赏园艺系洪波老师提供。洪波老师还为文章的写
作提出了宝贵建议，在此谨致谢意！
菊花矮化类病毒的分子检测与序列分析
张志想 1，葛蓓孛 1,2，潘 嵩 1，赵 哲 1,2，王红清 2，李世访 1,*
（1 中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；2中国农业大学农学与生物
技术学院果树系，北京 100193）
摘 要：菊花矮化病由菊花矮化类病毒（Chrysanthemum stunt viroid，CSVd）引起。从北京、海南万
宁、合肥和哈尔滨共采集了 122 个野生及商业种植的菊花样品，使用改进的 CTAB 法提取菊花总 RNA 后，
通过斑点杂交检测 CSVd，应用 RT-PCR 对阳性样品进行克隆、测序。斑点杂交结果表明，在检测的 122
个样品中有 14 个样品感染了 CSVd，感染率为 11.5%；除哈尔滨外的其余 3 个地区均有 CSVd 的发生。序
列比较分析结果表明，中国的 CSVd 分离物与韩国和日本分离物的序列最为接近，对其二级结构进行分析
发现，与 CSVd 的参考序列（NC002015）相比，所获得的中国 CSVd 分离物的序列中虽然有 21 个碱基发
生了突变（大多位于二级结构上的致病区内），但并未影响其折叠成稳定的拟棒状结构。
关键词：菊花；菊花矮化类病毒；斑点杂交；RT-PCR；序列分析
中图分类号：S 682.1+1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）12-2349-08

Molecular Detection and Sequences Analysis of Chrysanthemum stunt viroid
ZHANG Zhi-xiang1，GE Bei-bei1,2，PAN Song1，ZHAO Zhe1,2，WANG Hong-qing2，and LI Shi-fang1,*
（1State Key Laboratory of Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of
Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2Department of Fruit Science，College of Agronomy and Biotechnology，
China Agricultural University，Beijing 100193，China）
Abstract：The chrysanthemum stunt disease，caused by Chrysanthemum stunt viroid（CSVd），is a
serious threat to chrysanthemum production. To survey the occurrence and epidemic of CSVd and analyze
the molecular characterization of CSVd isolates of China. In total of 122 samples，including both wild and
commercial cultivars，were collected from Beijing，Wanning in Hainan，Harbin and Hefei in China. The
total RNA of chrysanthemum samples were extracted by modified CTAB method and then detected by
dot-blot hybridization using cRNA probe of CSVd. The positive samples tested by dot-blot hybridization
were further detected by RT-PCR. cDNA of CSVd was cloned and sequenced. The results of dot-blot
hybridization showed that 14 samples were positive for CSVd，which occurred in all the regions except for
Harbin at infection ratio of 11.5%. Sequences analysis indicated that CSVd isolates of China shared the
most close relationship with CSVd isolates of Korea and Japan. Compared with reference sequence of
CSVd（NC002015），there were 21 mutations for CSVd isolates of China. The prediction of secondary

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structure showed the mutations，most of which happened in pathogenicity region，have no impact on
folding into stable rod-like structure.
Key words：chrysanthemum；Chrysanthemum stunt viroid；dot-blot hybridization；RT-PCR；sequence
analysis

菊花矮化类病毒（Chrysanthemum stunt viroid，CSVd）侵染菊花栽培品种，引起植株矮化，花
色改变等（Diener & Lawson，1973；Hadidi et al.，2003），且会扰乱开花的光周期（Hosokawa et al.，
2004），严重影响菊花的观赏和经济价值。CSVd 感染植株后，潜伏期长，且易传播。早期对繁殖材
料进行快速、灵敏的诊断是控制病害蔓延的重要手段。正反向电泳（Mosch et al.，1978；陈炜 等，
1981；李世访 等，2002），斑点杂交（Candresse et al.，1988，1990），组织印记杂交（Hooftman et al.，
1996），RT-PCR（Nakahara et al.，1999）及 Real-time PCR（Mumford et al.，2000）等技术被广泛应
用于 CSVd 的检测。
CSVd 广泛分布于世界各国的菊花种植区（Hadidi et al.，2003）。近年来韩国和日本均有菊花矮
化病害流行的报道（Chung & Pak，2008；Matsushita & Penmetcha，2009）。中国于 20 世纪八、九
十年代报道了 CSVd 的发生（陈炜 等，1981；朱水芳和舒秀珍，1991）。2010 年，作者在海南万宁
菊花种植区监测到菊花矮化病害的流行。然而到目前为止，对 CSVd 的引入途径和中国 CSVd 分离
物的分子特征等问题仍缺少研究。本研究中使用斑点杂交和 RT-PCR 等技术调查中国不同地区 CSVd
的发生，通过序列分析探明中国 CSVd 分离物的分子特征，以期为监测和防控菊花矮化病在中国的
流行和发展奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
2010 年 11 月从北京、海南万宁、合肥和哈尔滨 4 个地区采集 122 个菊花叶片样品（表 1），于
2010 年 12 月，在中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室进行样品检测。
1.2 核酸提取
菊花样品的总 RNA 的提取参考文献（Li et al.，2008）中的 CTAB 法，并略有改进：提高了提
取缓冲液中 NaCl 和 β–巯基乙醇的浓度，并且将氯仿换为酚︰氯仿（1︰1）进行抽提。具体为：加
液氮研磨 0.1 g 幼嫩叶片，将其转入 1.5 mL 离心管内，加 1 mL 65 ℃提前预热的 CTAB 提取缓冲液
（100 mmol · L-1 Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol · L-1EDTA；2.0 mol · L-1 NaC1；2% CTAB；2% PVP；
使用前加 2% β–巯基乙醇）。65 ℃温育 15 min，13 000 r · min-1 离心 5 min。取上清液，加等体积的
酚︰氯仿（1︰1），振荡混匀后，13 000 r · min-1 离心 10 min，重复 1 次。取上清液，加 0.6 倍体积的
异丙醇，13 000 r · min-1 离心 10 min，弃上清液，用 70%乙醇洗涤沉淀 2 次。最后，将沉淀溶于 30
μL 灭菌水中。吸取 3 ~ 5 μL 进行琼脂糖凝胶电泳检测，并且测 OD 值，检验核酸的质量。
1.3 引物设计与合成
对 GenBank 中已经登录的 CSVd 的序列进行比对，然后根据参考序列（NC002015）在保守区
内设计一对引物。反向引物：CSVd-207R（5′-AGAGGAAGGAAACTAAAGGA-3′，与 188 ~ 201 位
置处的序列互补；正向引物：CSVd-208F（5′-CCTGGAGAGGTCTTCTG-3′，与 208 ~ 224 位置处的
序列同源，预期目的片段大小为 356 bp。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。
12 期 张志想等：菊花矮化类病毒的分子检测与序列分析 2351

1.4 RT-PCR、克隆及测序
反转录：20 μL 的 RT 反应体系中，加入模板 2 μL，M-MLV 5 × buffer 4 μL，2.5 mmol · L-1 dNTPs
4 μL，2 U · μL-1 RNA 酶抑制剂 1 μL，反向引物（20 μmol · L-1）1 μL，M-MLV 反转录酶（10 U · μL-1）
1 μL，加 ddH2O 至 20 μL，混匀。42 ℃温育 1 h，冰浴 2 min，–20 ℃ 保存备用。PCR：50 μL 反应
体系中，加入 2 × Long Taq PCR Master Mix 25 μL，正、反向引物（20 μmol · L-1）各 1 μL，RT 产物
3 μL，补 ddH2O 至 50 μL，混匀。PCR 反应程序为 94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 变性 30 s，53 ℃ 退
火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，30 个循环；最后 72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。
PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测、采集图片后，用 Axygen 琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的
片段，并将其连接至 pGEM-T（Promega）载体上，然后转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞。挑取克隆
摇菌后，用菌液 PCR 鉴定阳性克隆，最后送至华大基因有限公司进行序列测定。
1.5 斑点杂交
1.5.1 cRNA探针制备
通过酶切，将含有 CSVd 的全长 cDNA 片段的重组质粒（pGEM-T/CSVd）线性化。纯化后，以
CSVd 序列同源的正链 cDNA 为模板，使用 RNA 聚合酶（T7 或者 SP6），在地高辛标记的 UTP
（dig-UTP）存在的反应条件下，体外转录出地高辛标记的 CSVd 的负链 RNA。反应体系（20 μL）
为：纯化的线性重组质粒 > 1 μg；5 × 反转录缓冲液，4 μL；5 × NTPmix（含 dig-UTP）4 μL；RNA
酶抑制剂 2 μL；RNA 聚合酶（20 U · μL-1）2 μL；补 ddH2O 至 20 μL。混匀后，42 ℃温育 2 h。反
应结束后，加入 2 μL DNaseⅠ，37 ℃温育 15 min，消化模板。最后，加入 2 μL 0.2 mol · L-1 EDTA
（pH 8.0）终止反应，–80 ℃保存。
1.5.2 斑点杂交
在使用斑点杂交进行田间菊花样品的检测前，首先通过浓度梯度稀释来确定探针检测的灵敏度。
各取 5 μg CSVd 阳性和阴性样品的总 RNA，依次进行 5 × 浓度梯度稀释，通过杂交确定探针检测的
灵敏度。进行田间菊花样品检测时，取 1 μg 总 RNA，加到尼龙膜上。待自然干燥后，紫外交联
固定（1 200 × 100 μJ · cm-2）。加入杂交液（Roche），68 ℃预杂交至少 1 h；加探针（20 ~ 100 ng · mL-1
杂交液），68 ℃杂交过夜。杂交结束后，弃杂交液，用 2 × SSC、0.1% SDS 室温洗膜 2 次，每次 5 min；
再用 0.1 × SSC、0.1% SDS 68 ℃洗膜 2 次，每次 15 min；接着用 1%封闭液室温封闭 30 min；加入
Anti-DIG-AP 抗体 37 ℃温育 1 h；之后用检测液平衡 3 ~ 5 min；最后，往膜上加 CSPD 进行化学发
光成像或胶片曝光。
1.6 序列测定与分析
将所测序的序列在 GenBank 中进行 BLAST 检索，确认序列是否与 CSVd 同源。然后用 Cluxtalx
1.83 进行多序列比对分析。使用 Mfold（Zuker，2003）预测 CSVd RNA 的二级结构（http：// mfold.
rna. albany. edu/），然后用 RnaViz 2.0 进行编辑。
2 结果与分析
2.1 症状观察
田间调查发现，有些菊花品种感染 CSVd 后并不表现明显症状，有些则症状明显，并且不同感
病品种所表现的症状不同。CSVd 侵染能在一种未知菊花品种上引起明显的斑点症状（图 1，B）。
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感染 CSVd 的‘夏黄’菊花沿叶片主叶脉会出现褪绿黄化症状（图 1，C）。‘黄金’菊花感染 CSVd
后，植株明显矮化（图 1，D）；病株节间缩短；病叶变小，无褪绿或者斑点症状。



图 1 CSVd 在菊花上引起的症状
A：健康菊花；B：感染 CSVd 的未知品种菊花表现出的斑点症状；C：菊花‘夏黄’感染后沿叶脉褪绿黄化；
D：菊花‘黄金’感染后的植株矮化。
Fig. 1 The symptoms of CSVd infection in chrysanthemum
A：Healthy plant；B：Chrysanthemum of unknown cultivar infected by CSVd showed speckle symptoms；C：Diseased chrysanthemum
of‘Summer Yellow’showed yellowing along leaf veins；D：CSVd infection caused chrysanthemum of
‘Golden’showed dwarf symptoms.
2.2 核酸提取
使用改进的 CTAB 法提取样品总 RNA 后测定其 OD 值，结果显示所得 RNA 样品的 A260/A280
为 1.9 ~ 2.1，RNA 浓度均大于 500 ng · μL-1。这表明改进的 CTAB 法适合于菊花样品的总 RNA 提取。
2.3 探针灵敏度测定
斑点杂交结果表明检测的极限点为 0.32 ng 总 RNA（图 2）。考虑到组织中 CSVd 的含量在不同
季节、不同品种上可能存在的差别，为尽可能避免假阴性结果的产生，在实际检测中吸取不少于 1 μg
总 RNA 用于 CSVd 的斑点杂交检测。

图 2 菊花样品的 CSVd 斑点杂交检测灵敏度测定
A：感病菊花样品；B：健康对照。
Fig. 2 The sensitivity analysis of dot-blot hybridization detection of CSVd
A：Chrysanthemum infected with CSVd；B：Health control.
2.4 田间菊花样品的检测
应用斑点杂交对采集的 122 个菊花样品进行检测，结果表明：‘黄金’、‘夏黄’、‘13 号’和采
自合肥的一个未知品种中的共 14 个样品为 CSVd 阳性，感染率为 11.5%。其中，‘夏黄’和‘13 号’
品种的各 5 个样品均被 CSVd 侵染，而‘黄金’和未知品种中各有 2 个样品感染了 CSVd（表 1）。
12 期 张志想等：菊花矮化类病毒的分子检测与序列分析 2353

图 3 菊花样品中 CSVd 的 RT-PCR 检测
M：D2000 plus DNA marker；1：水对照；2：健康对照；
3：‘黄金’菊花样品；4：阳性对照。
Fig. 3 RT-PCR analysis of CSVd in chrysanthemum
M：D2000 plus DNA marker；1：Water control；2：Health control；
3：Chrysanthemum‘Golden’；4：Positive control.
表 1 供试菊花样品及斑点杂交检测的感染率
Table 1 Chrysanthemum samples used for this study and infection ratio of CSVd detected by dot-blot hybridization
品种
Cultivar
地区
Region
阳性样品数/被测样品数
No. of positive samples/
No. of detected samples
品种
Cultivar
地区 Region
阳性样品数/被测样品数
No. of positive samples/
No. of detected samples
13 号 北京 5/5 绿牡丹 北京 0/5
Thirteenth Beijing Green Peony Single Beijing
多头菊 北京 0/5 风车紫 北京 0/5
Deliflame Beijing Pinwheel Purple Beijing
勒芒阳光 北京 0/5 金风车 北京 0/5
Le Mans Sunny Beijing Pinwheel Golden Beijing
斯皮内利 北京 0/5 夏黄 北京 5/5
Spinelli Beijing Summer Yellow Beijing
Athos 北京 0/5 特秀 北京 0/5
Beijing Texiu Beijing
秋艳 哈尔滨 0/5 食用菌 北京 0/5
Fall Color Harbin Edible fungi Beijing
橙色 北京 0/5 神马 海南万宁 0/15
Orange Beijing Jinba Wanning，Hainan
桂黄 哈尔滨 0/5 黄金 海南万宁 2/18
Yellow Osmanthus Harbin Golden Wanning，Hainan
草莓 北京 0/5 未知 合肥 2/4
Strawberry Beijing Unknown Hefei
单白 北京 0/5 单瓣深红 北京 0/5
Single White Beijing Single Red Petal Beijing

2.5 RT-PCR、克隆和测序
对斑点杂交呈阳性的‘黄金’、‘夏黄’和
‘13 号’品种的菊花样品进行 RT-PCR 检测，
PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分析，阳性样
品均出现预期大小为 356 bp 的片段（图 3 为代
表性结果），水对照和健康对照均未出现目的片
段。将目的片段回收、纯化后，连接至 pGEM-T
载体，并转化 DH5α 大肠杆菌。每个品种的每
个样品随机选取 2 ~ 3 个阳性克隆进行序列测
定。
将测序得到的序列在 GenBank 中进行
BLAST 检索，最后共得到 22 条序列（表 2）。大小为 353 ~ 354 bp，与 CSVd 参考序列的相似性均
大于 90%，说明成功获得了 CSVd 的序列。其中，从‘黄金’分离物中得到 9 条序列中，有 6 条序
列完全一致；‘13 号’分离物的 8 条序列中有 3 条序列一致；5 条‘夏黄’分离物的序列中，有 3
条序列相同（表 2），表明 CSVd 的种群结构符合“准种”的模式。
2.6 序列比较分析
将所获得的 22 条序列与 GenBank 中已登录的 CSVd 序列进行比对。发现中国的 CSVd 分离物
的序列与韩国和日本的分离物最为接近（表 2）。‘13 号’分离物中的 8 条序列均与日本分离物 CSVd
25 最为接近；‘夏黄’分离物的 5 条序列以及‘黄金’分离物中除 HN5-1 和 5 之外的 6 条序列则最
接近于韩国分离物 CSVd11，并且‘夏黄’和‘黄金’分离物的优势变体与韩国分离物 CSVd11 的
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序列完全一致。这表明 CSVd 可能会通过繁殖材料的引入在中国与韩国和日本之间扩散。

表 2 CSVd 中国分离物的序列比较和变异分析
Table 2 Sequence and mutation analysis of CSVd isolates of China
品种
Cultivar
克隆编号
Name of clones
大小/bp
Size
最接近的序列
The closet CSVd sequence
与最接近序列的碱基变化
Nucleotide differences
with closest sequence
黄金 HN5-2，4，6，7，8，9 354 CSVd11*韩国分离物 没有突变 No mutation
Golden HN5-3 354 Korea isolate U101C；
HN5-1 354 CSVd17 日本分离物 C195U；A298U
HN5-5 354 Japan isolate A298U
夏黄 X-5，6，8 354 CSVd11 韩国分离物 没有突变 No mutation
Xiahuang X-3 354 Korea isolate G122C；
X-10 354 A336G
13 号 13-3，7，12 354 CSVd25 日本分离物 A169G；U190C
Thirteenth 13-4 354 Japan isolate A169G；U190C；U195C
13-8 354 A169G；U190C；A327G
13-10 353 A169G；U190；U295-；U305C
13-11 354 A169G；U190C；A181U
13-14 353 A169G；U190C；C207-
* CSVd 的序号参照亚病毒 RNA 数据库（Subviral RNA Database，http：//subviral.med.uottawa.ca/）。
* The numbers of CSVd refer to Subviral RNA Database，http：//subviral.med.uottawa.ca/.
2.7 二级结构预测
通过 Mfold 对获得的 22 条 CSVd 序列进行二级结构预测。与 CSVd 的参考序列（NC002015）
相比，所获得的 CSVd 分离物的序列中虽然有 21 个碱基发生了突变，但并未影响其折叠成稳定的拟
棒状结构（图 4）。


图 4 CSVd 的二级结构预测及序列变异分析
A：CSVd 的二级结构图；B：HPI 的结构图。TL：左末端区；P：致病区；C：保守区；V：可变区；TR：右末端区；HPI：发夹结构 I；
RY：类病毒 RNA 与寄主蛋白相互作用的结构基序。红色标记的是马铃薯纺锤块茎类病毒属（Pospiviroid）内保守的 Loop 6 结构基序；
绿色标记的碱基为 Pospiviroid 内保守 RY 结构基序；箭头标记的代表能够形成发夹结构的序列；实心方框标记的是本研究中的
分离物特有的碱基突变；空心方框内代表的是本研究中的分离物序列与 GenBank 中登录的序列共有的碱基突变；
实线指示的是反向引物序列，虚线标示的是正向引物序列。
Fig. 4 The predicted secondary structure of CSVd and analysis of mutation
A：Secondary structure of CSVd；B：Structure of HPI. TL：Terminal left；P：Pathogenicity region；C：Conserved region；V：Variable region；
TR：Terminal right；HPI：Hairpin I；RY：The structure motif mediated interaction between viroid RNA and host proteins. The red character is
Loop 6 conserved for Pospiviroid. The green base is the structure motif RY conserved for Pospiviroid. The arrows indicate the bases that can fold
into HPI. Solid square frames represent special mutation in this study. Blank square frames represent common mutation both in isolates of this study
and the sequence deposited in GenBank. Solid line indicates sequence of reverse primer and dash line
indicates sequence of forward primer.
12 期 张志想等：菊花矮化类病毒的分子检测与序列分析 2355

从二级结构图可知大多数突变位于致病区内（图 4，A）。在与类病毒的复制、剪切和移动等生
物学功能的实现相关的结构基序（Baumstark et al.，1997；Zhong et al.，2008；Takeda et al.，2011）
内则极少发生突变。值得注意的是，有一条序列的保守区内第 103 位的 U 变为了 C，这改变了与类
病毒复制过程中的剪切密切相关的发夹结构 I（Hairpin I，HPI）的结构（图 4，B）；在与类病毒在
寄主体内的移动有关的 Loop 6 基序内，这 21 条序列的第 320 位的 C 均变为了 U。
3 讨论
本研究中使用斑点杂交和 RT-PCR 法对海南万宁菊花种植区内患有矮化病害的菊花样品进行了
检测与鉴定，确定其病原为 CSVd。进一步调查发现，在中国北京地区的‘神马’品种的菊花上和
安徽地区的一种未知品种的菊花上也有 CSVd 的发生。对中国 CSVd 分离物进行了克隆和测序，序
列分析表明中国 CSVd 分离物的序列与日本、韩国的 CSVd 的分离物序列最为相似。此外，还对中
国 CSVd 分离物的序列进行了二级结构预测，所获得的 22 条 CSVd 分离物序列均能够折叠成稳定的
拟棒状结构（图 4）。
植物组织具有较多的次级代谢产物，想要获得高质量的植物总 RNA 较为困难。目前，普遍使
用昂贵的试剂盒提取植物总 RNA。本研究使用改进的 CTAB 法成功提取到了高质量的菊花总 RNA，
而且只需要 0.1 g 新鲜叶片就可以得到至少 15 μg 的总 RNA。所得总 RNA 能够满足斑点杂交和
RT-PCR 检测的要求。改进的 CTAB 法成本不仅很低，而且操作简便。因此，可以用于大批量样品
的检测。
明确病害的传播途径是控制病害的前提。本研究中发现中国 CSVd 分离物与韩国和日本 CSVd
分离物的最为接近，而且‘黄金’和‘夏黄’菊花分离物中的优势变体的序列与韩国分离物序列完
全一致。值得提出的是，‘黄金’是近几年中国从日本引入的用于鲜切花生产的主要品种。由此可推
知，在从日本引进繁殖材料的过程中，CSVd 可能也被引入中国境内，并且随着种植规模的扩大迅
速蔓延。本研究结果虽然为研究 CSVd 在中国和日本、韩国间的流行传播提供了线索，但仍缺乏直
接证据的支持，而且没有对中国 CSVd 分离物的生物学特性进行更深入的研究。
菊花的生产方式和品种多样性决定了 CSVd 在不同国家呈现不同的流行态势。中国虽然早在 30
年前就报道了 CSVd 的发生（陈炜 等，1981），可此后菊花矮化病并未流行。只是近两年，在生产
鲜切花的菊花种植区才开始出现流行的势头。然而早在 20 世纪，CSVd 就在美国、日本和欧洲一些
发达国家大面积流行，并且给当地的菊花产业造成了严重的损失（Hadidi et al.，2003），相对落后的
以小规模家庭式生产为主的生产方式是限制 CSVd 在中国流行的的重要因素。然而，近年来中国鲜
切花菊花的种植面积和生产规模快速增长。品种逐渐的单一化和繁殖材料的商业化为 CSVd 的流行
提供了有利的条件。因此，今后在菊花品种的引进和种苗的生产中要加强 CSVd 的检疫和检测。此
外，中国是菊花的原产地，具有丰富的遗传资源。因此，有必要对中国不同菊花品种对 CSVd 的抗
性进行评价，以期为抗病品种的培育提供可利用的遗传资源。

References
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