全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (2) : 245 - 250
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 09 - 09; 修回日期 : 2009 - 01 - 23
基金项目 : 国家林业局 ‘948’项目 (2006242C07) ; 国际竹藤网络中心青年基金项目 (103)3 并列第一作者。3 3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: pengzh@ icbr1ac1cn)
中国水仙 N TMADS1基因表达分析及转化拟南芥研
究
陈段芬 1, 3 , 高志民 13 , 彭镇华 23 3
(1 国际竹藤网络中心 , 国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室 , 北京 100102; 2 中国林业科学院林业研究所 , 北
京 100091; 3 河北农业大学园艺学院 , 河北保定 071001)
摘 　要 : 利用 RT2PCR 技术分析了中国水仙 (N arcissus tazetta var. chinensis) 花器官特征基因 N T2
MADS1在花期不同器官及花不同部位的表达模式。结果表明 , 该基因只在花器官中表达 , 且在雄蕊和副冠
中的表达量高于雌蕊 , 在花瓣中未检测到该基因的表达。将该基因置于 CaMV 35S启动子控制下 , 构建到
载体 pB I121的多克隆位点 , 获得了包含 35S启动子、N TMADS1基因的编码区和 NOS终止区域的植物表达
载体。在农杆菌介导下将该基因转入模式植物拟南芥 (A rabidopsis tha liana) 中 , 获得了卷叶、花期提早和
花形改变的转基因植株。
关键词 : 中国水仙 ; N TMADS1基因 ; 植物表达载体 ; 转化 ; 拟南芥
中图分类号 : S 68212 + 1　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0220245206
Expression Ana lysis of N TM AD S1 Gene in N a rc issus taze tta var . ch inensis
and Study on Its Tran sforma tion in A rabidopsis tha liana
CHEN Duan2fen1, 3 , GAO Zhi2m in13 , and PENG Zhen2hua23 3
(1 In terna tional Cen ter for B am boo and Rattan, SFA Key L abora tory of B am boo and Rattan Science and Technology, B eijing
100102, Ch ina; 2 Research Institu te of Forestry, Chinese A cadem y of Forestry, B eijing 100091, Ch ina; 3 College of Horticulture,
A griculture U niversity of Hebei, B aod ing, Hebei 071001, Ch ina)
Abstract: The exp ression pattern of N TMADS1 gene, a flower organ identity gene from N arcissus tazetta
var. ch inensis, was analyzed by RT2PCR. The results revealed that the transcrip t of N TMADS1 was not
detectable in vegetative tissues, but only in flowers. W ithin open flower organs, transcrip t levels were much
higher in stamen and corana than in p istil and barely detectable in petals. N TMADS1 gene was subcloned into
the multip le cloning sites of pB I121 vector drived by 35S p romoter, and was transferred into A rabidopsis
tha liana by A grobacterium tum efaciens. Ectop ic exp ression of N TMADS1 in transgenic A. tha liana p lants resul2
ted curly leaves, early flowering and shape2changed flowers.
Key words: N arcissus tazetta var. ch inensis; N TMADS1 gene; tissue specific exp ression; transforma2
tion; A rabidopsis tha liana
中国水仙 (N a rcissus tazetta var. ch inensis) 为同源三倍体植物 , 极少产生种子 , 且发生自然突变
的频率极低 , 限制了其实生选种和杂交育种。花器官发育 ABC模型 (Coen & Meyerowitz, 1991) 和
ABCDE模型 ( Theissen et al. , 2000) 的提出 , 为利用植物基因工程创造新花形提供了理论依据。利
用植物基因工程技术已成功创造出多种花形改变的植物 (于静娟 等 , 1989) , 这为中国水仙品种改良
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和创新提供了有益的参考。
作者从中国水仙重瓣品种 ‘玉玲珑 ’中分离了 N TMADS1基因 , 且通过与拟南芥 MADS2box家族
基因的比较分析后将之归为 AG亚族的 C类花发育功能基因 (高志民 等 , 2008)。本文报道应用 RT2
PCR技术研究 N TMADS1基因在中国水仙不同器官及花不同部位的表达模式 , 并构建该基因的植物表
达载体 , 使之在拟南芥中异位表达 , 获得了花形改变以及早花的植株 , 以期为进一步利用植物基因工
程技术手段调控水仙的花形和花期奠定基础。
1　材料与方法
111　植物材料和菌株
中国水仙品种 ‘玉玲珑 ’来自福建漳州。拟南芥为 Col20生态型 , 大肠杆菌 ( Esherich ia coli)
DH5α、农杆菌 (A grobacterium tum efaciens) EHA105和 pB I121双元载体由本实验室保存。
112　N TM AD S1基因的组织表达
以中国水仙 18S rRNA基因设计内参引物 , 上游引物 5′2GACTCCGCCGGCACCTTATGAG 23′; 下游
引物 5′2CGCCGCGATCCGAACACTTC23′, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
用 Trizal法从中国水仙不同器官和花的不同部位提取 RNA, 反转录成 cDNA第一链。调整 cDNA
用量和循环数 , 使内参基因的表达丰度一致。用调整后的 cDNA模板量进行 PCR扩增 , 通过测定 RT2
PCR产物的光密度值来检测目的基因在不同器官和组织中的表达量。
113　N TM AD S1基因表达载体的构建及转化拟南芥
根据作者克隆测序后的 N TMADS1基因序列设计引物 , 上游引物 1的 5′端添加 XbaⅠ酶切位点 ,
下游引物 2的 5′端添加 SacⅠ酶切位点。引物 1: 5′2tctagaATGGGTAGGGGGAAGATAGAG23′; 引物 2:
5′2gagctcTCATCCCAGTTGAGGGGTAGTC23′。上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
以中国水仙 cDNA第一链为模板 , 采用 pyrobest polymerase进行 PCR扩增。反应条件为 : 94 ℃预变性
5 m in; 94 ℃ 1 m in, 58～63 ℃ 1 m in, 72 ℃ 2 m in, 35个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。扩增产物回收并
加 A后与 pGEM 2T easy连接转化大肠杆菌 DH5α, 得到阳性克隆 , 提取质粒后进行质粒 PCR和酶切鉴
定并测序。分别对测序正确的质粒和 pB I121进行 X baⅠ和 S acⅠ双酶切 , 回收所需片段后用 T4连接
酶连接目的载体和基因片段 , 连接后的质粒再次进行 PCR和多酶切检测 , 以确保获得植物表达载体
的正确性。
用蘸花法转化拟南芥 , 具体操作见徐芳等 (2005) 的文献。
114　转基因拟南芥植株的筛选、鉴定和表型调查
采收成熟的种子 , 播于含 011%卡那霉素的固体培养基上进行抗性筛选。挑选抗性幼苗移栽入营
养钵中 , 单株收获种子后进行播种 , 出苗后提取基因组 DNA进行 PCR检测 , 并对检测阳性植株进行
Southern blotting分析 , 调查后代的表型及性状分离情况。
2　结果与分析
211　N TM AD S1基因组织表达分析
RT2PCR结果分析表明 , N TMADS1基因在中国水仙不同器官和花不同部位的表达模式不同。该基
因只在花中被检测到大量表达 , 而在叶片、鳞片和根系中未检测到该基因的转录 (图 1)。
在花器官不同部位中 , N TMADS1基因的表达明显不同 , 在雄蕊中表达量最高 , 其次为副冠 , 在
雌蕊中有微量表达 , 而在花瓣中未检测到表达 (图 2)。
由此推测 , 该基因可能与中国水仙的花器官发育 , 尤其是雄蕊和副冠的发育密切相关。
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　2期 陈段芬等 : 中国水仙 N TMADS1基因表达分析及转化拟南芥研究 　
212　N TM AD S1基因植物表达载体的构建与检测
引物 1和引物 2的 PCR产物电泳检测发现 ,
在 700 bp左右有一条亮带 (图省略 )。测序结果
表明目的片段为 705 bp , 包含了 N TMADS1基因
编码区 ( 693 bp ) 以及添加的酶切位点 X ba Ⅰ
( tctaga) 和 SacⅠ ( gagctc) 12 bp。以切除 GUS
片段后的 pB I121 (X baⅠ和 SacⅠ双酶切 ) 作为载
体 , 将含有 X baⅠ和 SacⅠ酶切位点的 N TMADS1
基因片段作为插入片段 , 连接后转化大肠杆菌
DH5α, 得到阳性克隆 , 质粒提取后酶切鉴定。根
据 N TMADS1 基因序列 ( H ind Ⅲ位于 278 bp;
EcoRⅠ位于 315 bp ) 和 pB I121上的酶切位点预
测 , X baⅠ /SacⅠ酶切带为 017、1012 kb; H ind
Ⅲ /SacⅠ酶切带为 014、111和 914 kb; EcoRⅠ单
酶切带为 016和 1013 kb; X baⅠ / EcoR Ⅰ酶切带
为 013、016和 1010 kb。对载体质粒酶切后电泳
检测 (图 3) , 酶切指纹图谱与预测的完全一致。
图 3　N TMADS1植物表达载体质粒酶切检测
1: XbaⅠ /SacⅠ; 2: H ind Ⅲ /SacⅠ; 3: EcoRⅠ;
4: XbaⅠ /EcoRⅠ; M: 1 kb分子量标记。
F ig. 3　The plan t expression vector of N TMADS1 checked
by restr iction enzym es
1: XbaⅠ /SacⅠ; 2: H ind Ⅲ /SacⅠ; 3: EcoRⅠ;
4: XbaⅠ /EcoRⅠ; M: 1 kb ladder.
PCR结果与预测完全吻合 (图省略 ) , 由此表明获得的 N TMADS1基因植物表达载体 (图 4) 是正确
的。
图 4　N TMADS1基因植物表达载体
F ig. 4　N TMADS1 gene plan t expression vector
213　转 N TM AD S1基因拟南芥 T1 代植株检测与表型分析
将 N TMADS1基因植物表达载体转入农杆菌 , 用蘸花法转化拟南芥。经卡那霉素抗性筛选的植株
用 PCR检测 , 结果 (图 5) 表明 , 6～9泳道的样品植株为阳性 , 5泳道的样品植株为假阳性。
进一步 Southern杂交检测 (图 6) 证实 , 获得了转 N TMADS1基因的拟南芥植株 , 而且有的是单
拷贝 , 有的是两个拷贝。
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　　与野生型幼苗 (图 7, A) 相比 , T1 代转基因植株出现了显著的表型差异。转基因植株长势普遍
较弱 , 莲座叶两侧叶缘向上卷曲 , 且叶片明显变小 , 花期提前 (图 7, B )。有的转基因植株表现为花
瓣全部退化 , 雄蕊和雌蕊全部裸露 , 且雄蕊基部合生呈心皮状 (图 7, D ) ; 有的转基因植株果实较
短 , 果实表面凹凸不平 (图 7, F) ; 有的转基因植株在茎生叶的叶尖可出现心皮状结构 , 心皮状结构
上还着生花药状突起 (图 7, H)。
图 7　拟南芥转基因植株与野生型的表型比较
A: 野生型幼苗 ; B: T1 代幼苗卷叶和早生花序 ; C: 野生型花序 ; D: T1 代花瓣全部缺失 , 雄蕊呈心皮状 ;
E: 野生型果实 ; F: T1 代果实 ; G: 野生型花序茎生叶 ;
H: T1 代茎生叶顶端变为心皮。
F ig. 7　M orphology com par ison between w ild type and tran sgen ic plan ts of A. tha liana
A: W ild type (W T) seedling; B: T1 seedling with curly leaves and early inflorescence; C: Inflorescence of W T;
D: T1 absent petals and carpel2like stamen; E: Fruit of W T; F: Fruit of T1 ;
G: Cauline leaf of W T; J: T1 with carpel2like cauline leaf.
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　2期 陈段芬等 : 中国水仙 N TMADS1基因表达分析及转化拟南芥研究 　
由中国水仙 N TMADS1基因在拟南芥中异位表达导致的表型可以推测 , 该基因可能涉及中国水仙
的花期和花器官发育调控。
3　讨论
不同植物花或果实器官中 AG同源基因的表达存在很大差异。拟南芥 AG基因只在雄蕊和雌蕊中
表达 ( Thomas et al. , 1997) ; 黄瓜的 CMB 1基因在花瓣未见表达 , 但在雄花的雄蕊和雌花的雌蕊中
有 mRNA的积累 , 在雌蕊中水平显著低于雄蕊 (L i et al. , 2000) ; 苦瓜的 BAG基因仅在心皮、雄蕊、
花萼和幼果中表达 , 花瓣中没有表达 , 且在幼果、雄蕊和花萼中有低水平的表达 (彭书明 等 ,
2006) ; 风信子的 HoAGL6基因的在花序芽、花被、心皮和胚珠中表达 , 在雄蕊、叶和鳞片中无表达
(樊金会 等 , 2007) ; 可可花中的 AG基因在花的雄蕊、子房、果壳和果肉中表达 , 萼片和花瓣中几
乎检测不到该基因的转录 ( Tetty et al. , 2006)。不同植物的 AG同源基因虽然表达差异较大 , 但都主
要在雄蕊和雌蕊中表达。
中国水仙的花器官在形态结构上与其它植物不同 , 除正常的四轮花器官外 , 还有一个特殊的副
冠。Kamae (1968) 认为副冠是在花被与雄蕊原基形成的过程中分化的 , 而钟衡 (1984) 则认为副冠
是在心皮形成以后形成的 , 二者均认为副冠与雄蕊为同源器官 , 据此可以判断副冠应属于第三轮花器
官。本研究中 N TMADS1基因只在花中特异表达 , 且在雄蕊中表达量最高 , 副冠中次之 , 而在雌蕊中
微量表达 , 与其他植物 AG同源基因的表达模式是一致的 , 证实了 N TMADS1基因属于 AG亚族的 C
类功能基因 (高志民 等 , 2008)。
根据花发育 ABCDE模型 , 过量表达 AG基因的转基因植株在花的第一轮和第二轮中会表现出同
源异型转化 , 这是由于 C类功能基因对第一和第二轮中 A 类功能基因 (A P2) 的负面影响所致
( Kunst, 1989)。许多植物的 AG同源基因在拟南芥中异位表达经常会出现与拟南芥 AG基因的异位表
达相似的现象 , 表达的强烈程度与该基因在转基因植物中的转录水平正相关 ( Tetty et al. , 2006)。表
达强烈的花中 , 第一轮可能出现心皮状结构 , 第二轮缺失或形成雄蕊状心皮 ; 表达较弱的花具有小的
花瓣等 ; 此外 , 过量异位表达 AG基因的转基因植株还有莲座叶卷曲、花序发育提早终止于心皮状结
构等现象。上述结论在百合、风信子、月季、白桦、黑杉、可可等物种中均得以证实 (Rutledge et
al. , 1998; Benedito et al. , 2004; Kitahara et al. , 2004; Lemmetyinen et al. , 2004; Tetty et al. , 2006;
樊金会 等 , 2007)。
在本研究中 , 转 N TMADS1基因的拟南芥植株出现株型和叶型变小、叶片卷曲、花期提前、花瓣
不同程度缺失、荚果变异及茎生叶部位变为心皮状结构等现象 , 这与其他物种的 AG基因过表达时的
现象基本一致。这有力地支持了 N TMADS1基因是 MADS2box家族 C类花发育功能基因的推测 , 也预
示着 N TMADS1基因可能在中国水仙的花型和花期调控中起着重要作用。
本研究中分析了中国水仙 N TMADS1基因的组织表达模式 , 初步探究了该基因的功能 , 但该基因
在中国水仙中是如何调控花发育的 , 需要通过将 N TMADS1基因转入中国水仙来进一步验证。
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