全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (8) : 1120 - 1126
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 02 - 04; 修回日期 : 2009 - 07 - 02
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2006AA1001082221)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zkc8848@1261com)
桃果实非酸 /酸性状 SCAR标记的转化与验证
吴　俊 1, 3 , 束怀瑞 1 , 张开春 23 , 张晓明 2 , 姜立杰 2
(1山东农业大学园艺科学与工程学院 , 山东泰安 271018; 2北京市农林科学院林业果树研究所 , 北京 100093; 3南京农
业大学园艺学院 , 南京 210095)
摘 　要 : 根据筛选到的与桃果实非酸 /酸性状紧密连锁的 3个 AFLP标记特异片段序列信息 , 设计特异
引物 BFPA1 /A2、BFPB1 /B2和 BFPC1 /C2。3个特异引物在 ‘京玉 ’桃、‘美味 ’油桃及其正反交 F1代 69株
群体中的 PCR检测结果表明 : 引物 BFPB1 /B2在果实性状表现为酸的后代个体中扩增出分子量大小为 158
bp的特异条带 , 且根据特异片段 AT2CTA199不同部位设计的引物都能稳定扩增 , 只是片段大小有所差异 ;
特异扩增检测 F1群体分离结果与原先 AFLPAT/CTA标记完全一致 , 表明 AFLP标记已成功转化为 SCAR标记 ,
该 SCAR BFPB1 /B2标记与 D基因的连锁距离为 2199 cM。利用 SCAR BFPB1 /B2标记对 ‘大久保 ’桃 ב兴津 ’油
桃的 F2群体 60株个体的果实非酸 /酸性状进行检测 , 基因型与表型性状符合率为 9617% , 并且表现为共显
性标记。特异引物 BFPA1 /A2和 BFPC1 /C2的扩增多态性条带在亲本及后代中消失。
关键词 : 桃 ; 非酸 /酸 ; AFLP; SCAR
中图分类号 : S 66211; Q 74　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0821120207
D evelopm en t and Va lida tion of SCAR M arkers L inked to the Non2ac id /ac id
Tra it of Fru it in Peach
WU Jun1, 3 , SHU Huai2rui1 , ZHANG Kai2chun23 , Zhang Xiao2m ing2 , and J IANG L i2jie2
(1 College of Horticu lture Science and Engineering, Shandong A gricu ltura l U niversity, Taipian, Shandong 271018, China;
2 Institu te of Forestry and Pom ology, B eijing A cadem y of A gricu lture and Forestry Sciences, B eijing 100093, Ch ina; 3 College of
Horticulture, N an jing A gricultural U niversity, N anjing 210095, Ch ina)
Abstract: In this paper, specific p rimers of BFPA1 /A2 , BFPB1 /B2 , BFPC1 /C2 were designed respec2
tively according to the sequence of three specific fragments from AFLP markers which linked to non2acid / acid
trait of peach. A 158 bp polymorphic band was amp lified from the DNA of 69 F1 population of the intra2specif2
ic cross between cultivars‘J ingyu’and‘Flavortop’with the p rimer pair BFPB1 /B2. Furthermore, the steady
and specific amp lification can be got with the p rimers designed in different location of the AFLP fragment AT2
CTA199. The SCAR marker had the same segregation pattern as the original AFLPAT/CTA marker with a linkage
distance of 2199 cM and the AFLP marker was converted into SCAR marker successfully. The SCARBFPB 1 /B 2
marker was tested in 60 F2 p rogeny of‘Okubo’and‘Xingjin’nectarine, and the results showed that the ac2
cordance ratio of genotype and phenotype was 9617%. The SCAR marker was a co2dom inantmarker and could
distinguish the heterozygous and homozygous. Polymorphism disappeared in parents and p rogeny with specific
p rimers BFPA1 /A2 and BFPC1 /C2.
Key words: peach; non2acid / acid; AFLP; SCAR
桃果实的甜酸性状是影响其风味品质和经济价值的重要因素 , 也是杂交育种选择的一个重要衡量
标准。桃果实的非酸性状最初起源于中国 , 并且为显性单基因 D 控制 (D irlewanger et al. , 1998a,
　8期 吴 　俊等 : 桃果实非酸 /酸性状 SCAR标记的转化与验证 　
1998b)。早在 60年代 Yoshiba和 Monet就曾对酸与非酸性状进行遗传研究 , 并指出控制桃果实非酸
( non2acid) 性状为一显性单基因 (D irlewanger et al. , 1998a) ; D irlewanger等 (1998b) 的研究也认为
果实的非酸性状符合显性单基因遗传特性 , 并且将控制非酸性状的 D基因定位在其构建的遗传连锁
图上。本研究小组曾以 ‘京玉 ’、‘美味 ’正反交 F1代 69株群体为试材 , 开展了非酸 /酸性状分子标
记的筛选 , 并获得了与 D基因紧密连锁的 AFLP (吴俊 等 , 2004a) 标记。由于 AFLP标记的试验步骤
繁琐 , 成本较高 , 试验条件及操作技术要求严格 , 限制了其在大规模分子辅助选择育种中的应用。因
此 , 将 AFLP标记转化为简单的基于常规 PCR扩增的 SCAR标记 , 对于生产与育种实践具有更重要的
指导意义。本研究中在获得 AFLP连锁标记特异片段序列信息的基础上 (吴俊 等 , 2004b) , 设计特异
引物 , 通过对后代分离群体的检测 , 开展 AFLP标记向 SCAR标记的转化工作 , 旨在为今后桃果实非
酸 /酸性状的分子辅助选择育种提供稳定、可靠的技术手段。
1　材料与方法
111　植物材料
品种 : ‘京玉 ’桃 [ P runus persica (L1) Batsch. ‘J ingyu’]、‘美味 ’油桃 [ P1 persica (L1)
Batsch1 var1 nectarina Maxim‘Flavortop’]、‘大久保 ’桃 [ P1 persica (L1) Batsch1‘Okubo’] 和 ‘兴
津 ’油桃 [ P1 persica (L1) Batsch1var1 nectarina Maxim‘ Xingjin’]。其中 ‘京玉 ’的亲本为 ‘大久
保 ’和 ‘兴津 ’。F1群体 : 1994年利用 ‘京玉 ’、‘美味 ’正反交获得 F1代 69株分离群体。F2群体 :
1996年利用 ‘大久保 ’和 ‘兴津 ’杂交后代 ‘京玉 ’单株自交后获得的 F2代 60 株分离群体。
2000—2003年连续对后代群体果实的非酸 /酸性状进行评价。所用植物材料及试验条件均由北京市农
林科学院林业果树研究所生物技术研究室提供。
112　方法
11211　基因组 DNA提取 　取春梢幼嫩叶片 , 采用 CTAB法 (Maria et al. , 2001)提取各品种及 F1、
F2分离群体单株的基因组 DNA, 并经 RNaseA消化。获得的 DNA经紫外分光光度计检测合格后 , 将
浓度调至 50 ng·μL - 1。
11212　特异引物的设计和合成 　根据 3个回收 AFLP特异片段的序列信息 , 利用 Primer Prem ier 510
软件分别设计 23 bp的特异 PCR引物。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
用合成的特异引物对亲本及杂交后代群体的基因组 DNA进行扩增 , 反应体系为 : temp le DNA
110μL, 10 ×PCR Buffer 210 μL, 25 mmol·L - 1 MgCl2 112 μL, 215 mmol·L - 1 dNTP 116 μL, 10
mmol·L - 1正反向引物 0175μL, 5 U·μL - 1 Taq DNA polymerase 012μL, ddH2 O 1215μL, 总反应体
积 20μL。反应程序为 : 94 ℃ 4 m in; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 60 s, 72 ℃ 60 s, 35个循环 ; 最后 72 ℃延
伸 5 m in。扩增产物在 210%的琼脂糖凝胶上电泳分离 , 凝胶成像系统观察并拍照。
113　数据处理
采用 Mapmaker/Exp310 (L incoln et al. , 1993) 软件对分子标记与目标性状进行连锁分析 , 利用
Kosambi (莫惠栋 , 1996)函数将重组率转化为遗传距离 (Centimorgan, cM )。
2　结果与分析
211　AFL P标记片段的特异引物设计
根据对应于 AFLP选择性碱基组合 E2TA /M 2CTC, E2AT/M 2CTA, E2ACT/M 2CAT产生的特异片
段 , 测序结果表明回收克隆的 3个特异片段 TA2CTC140、AT2CTA199、ACT2CAT408的两端均包含 EcoRⅠ
和 M seⅠ的酶切位点及相应选择性碱基结合位点 , 且长度大小与 AFLP引物扩增的特异片段相符 , 进
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而证明了回收片段的正确性。
设计 SCAR引物的碱基数一般为 20～25 bp , 本研究中根据 3个特异片段的测序结果 , 分别设计
了 23 bp的正向和反向特异引物。考虑到引物设计中 GC的含量 , 设计引物的位置没有从酶切位点序
列开始 , 而是向序列内部移动了一段距离。3个特异引物序列与位置如图 1。
图 1　3个 AFL P标记特异片段的特异引物设计
黑体部分为 AFLP选择性扩增引物位置 , 下划线部分为特异引物位置。
F ig. 1　Spec if ic pr im ers designed ba sed on the spec if ic fragm en t of three AFL P markers
Location of AFLP selective amp lification p rimers were in bold, the p rimers
positions for specific amp lification were underlined.
212　亲本及 F1分离群体的特异引物 PCR扩增
用上述 3对特异引物分别对 ‘京玉 ’、‘美味 ’及其 F1分离后代的基因组 DNA进行 PCR扩增 ,
结果发现引物 BFPB1 /B2在果实性状表现为酸的后代个体中同时扩增出分子量大小为 188 bp和 158 bp
的两条带 , 而非酸个体只有分子量大小约 188 bp的单条带扩增 (图 2) , 可见 158 bp扩增条带是转化
的特异条带。在 ‘京玉 ’中特异引物 BFPB1 /B2扩增出 188 bp和 158 bp的两条带 , 而 ‘美味 ’中只
有 188 bp条带的扩增 (图 2)。从遗传学上看 , ‘京玉 ’ (B dbD ) ב美味 ’ ( bdbd) (B / b代表条带
的显隐性 ; D / d代表基因的显隐性 ) , 产生杂交一代 bD bd (表现为非酸性状 , 只有 188 bp条带的扩
增 ) 和 B dbd (表现为酸性状 , 有 188 bp和 158 bp两条带的扩增 ) , 这与后代中所鉴定性状的结果是
相符合的 , 说明此 AFLPAT/CTA标记已被成功的转换为基于特异引物 PCR扩增的 SCARBFPB 1 /B 2标记。用
转化后的 SCAR标记验证 69株 F1群体 , 检测的结果与 AFLP标记完全符合 , 重组率为 219% , 标记与
D / d基因连锁距离为 2199 cM。
对于特异引物 BFPA1 /A2、BFPC1 /C2 , 其扩增产物在亲本及后代中无差异。针对多态性片段消失
的原因 , 推测其产生多态性的位置可能在酶切位点附近 , 而引物是根据特异片段的内部序列设计的 ;
另外由于设计的引物较长 , 扩增条件严格 , 可能会影响特异条带的扩增。因此在重新设计引物时加上
了酶切位点序列并缩短引物长度 , 但亲本及后代中仍检测不到多态性 , 其原因有待于进一步分析。
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图 2　特异引物 BFPB1 /B2 对 ‘京玉’、‘美味’正反交 F1 后代基因组 D NA的扩增
M1 Marker (pUC19 DNA /M spⅠ) ; 11美味 ; 21京玉 ; 3～91非酸个体 ; 10～181酸个体。
F ig. 2　Am plif ica tion of genom e D NA w ith spec if ic pr im ers BFPB1 /B2 in the progeny from
in tra2spec if ic cross by J ingyu and Flavortop
M1 Marker (pUC19 DNA /M spⅠ) ; 11 Flavortop; 21 J ingyu; 3 - 91 Non2acid individuals;
10 - 181 Acid individuals.
213　SCAR标记的稳定性验证
为了验证已转化的 SCAR BFPB 1 /B 2标记稳定性 , 我们又根据特异片段 AT2CTA199靠近内部的序列设计
另一对特异引物 BFPB3 /B4 , 引物序列 , BFPB3 : 5′2GAGTAATTGGAGTCAGACAGAGT23′; BFPB4 : 5′2
CCATGTGAAGTGGATATTACAGG23′。
利用 BFPB3 /B4引物对亲本及 F1个体基因组 DNA进行检测 , 结果表明与 BFPB1 /B2扩增图谱相似 ,
只是特异扩增片段大小因引物位置变化而有所减小。将两次设计的正反向引物分别组合后 , 同样能检
测差异条带 (图 3) , 且基因型与表型的符合度与 AFLP标记完全相同 , 从而进一步证明了该 SCAR标
记的稳定性。由于扩增产物的片段较小 , 需要使用高分辨率的凝胶 , 4个引物组合中 , BFPB1 /B2组合
扩增的特异片段较大 , 更利于琼脂糖凝胶的检测和分离。
图 3　引物组合 BFPB1 /B2、BFPB3 /B2、BFPB1 /B4、BFPB3 /B4 的扩增图谱比较
M1 Marker (pUC19 DNA /M spⅠ)。1, 21非酸个体 ; 3, 41酸个体。
F ig. 3　Com par ison of am plif ied pa ttern s w ith d ifferen t pr im er pa irs BFPB1 /B2 ,
BFPB3 /B2 , BFPB1 /B4 and BFPB3 /B4
M1 Marker (pUC19 DNA /M spⅠ) . 1, 21 Non2acid individuals; 3, 41 Acid individuals.
214　SCAR标记在 F2分离群体上的验证
利用转化的 SCARBFPB1 /B2标记在 ‘大久保 ’与 ‘兴津 ’油桃的杂交 F2后代中进行检测。扩增结果
表明 , ‘大久保 ’中只有 188 bp条带扩增 , ‘兴津 ’油桃扩增出 188 bp和 158 bp两条带 , 其杂交 F1
代 ‘京玉 ’, 扩增条带为 188 bp和 158 bp两条带 (图 4) , 这与前面的扩增结果是一致的。‘京玉 ’
自花授粉获得的 F2代个体 , 基因型应出现 3种形式 , 即 DD (非酸 )、D d (非酸 )、dd (酸 )。试验结
果表明 , F2代中有 188 bp和 158 bp两条带扩增的个体表现为非酸 , 只有 188 bp条带扩增的也表现为
非酸 , 只有 158 bp条带扩增的表现为酸。这与遗传理论是相吻合的 , 从而进一步证明了该 SCAR标
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记的可靠性。在验证的 60株 F2个体中只有两个为交换型 , 符合率为 9617% , 可见该 SCAR标记的表
型性状预测的正确率很高 , 说明这是检测桃果实非酸 /酸性状的一个十分有效的 SCAR标记 , 并且可
以区分纯合体与杂合体 , 为共显性标记 , 是进行桃的果实性状分子标记辅助选择育种的有效依据。
图 4　SCAR BFPB1 /B2标记在亲本及其 F2 群体中的扩增图谱
11大久保 ; 21兴津 ; 31京玉 ; 4～191不同个体 ; M1 Marker (pUC19 DNA /M spⅠ)。
F ig. 4　Am plif ica tion pa ttern s of SCAR BFPB1 / B2 marker in paren ts and F2 popula tion from O kubo ×X ingjin
11 Okubo; 21 Xingjin; 31 J ingyu; 4 - 191 D ifferent individuals of
F2 p rogeny; M1 Marker (pUC19 DNA /M spⅠ) .
3　讨论
作者在以往的工作中曾成功获得了 3个与桃果实非酸 /酸性状连锁的 AFLP标记 (吴俊 等 ,
2004a) , 但是由于 AFLP标记是受专利保护的技术 , 使用成本较高 , 操作比较烦琐 , 且技术要求严
格 , 从而限制了其在大规模分子辅助选择育种中的应用。与 AFLP标记一次反应检测 50～100个位点
相比 , SCAR标记可直接检测少数差异位点 , 一般情况下 , 电泳结果显示的是条带的有无或者大小差
异 , 非常容易鉴别。因此 , AFLP标记转化为简单的基于常规 PCR扩增的 SCAR标记是极有意义的工
作。
桃基因组大小只有拟南芥基因组的两倍 (Baird et al. , 1994) , 目前已经鉴定的桃 42个单基因性
状中 19个已经定位在桃的分子遗传连锁图上 (D irlewanger et al. , 2004)。但是 , 对于定位的这些性
状 , 很少有能在分子辅助育种中应用 , 控制果实非酸 /酸性状的 D基因就是其中的一个。虽然果实酸
的含量是呈现连续变化的数量特征 , 但是依据 pH值可以将桃的果实分为两类 , 即正常酸 (酸 ) 和低
酸 (非酸 ) 类型。Yoshida 和 Monet的研究认为桃的非酸性状是由显性单基因 ———D 基因控制的
(D irlewanger et al. , 1998a)。此后 , D irlewanger (1998b)等在构建桃的连锁图时 , 最早将 D基因定位
在第 5连锁群上 , 与其连锁的两个 RAPD标记 , 连锁距离分别为 6 cM和 3 cM。2006年该研究小组又
发表了以 F2分离群体构建的连锁图 (D irlewanger et al. , 2006) , 其中 D基因被框定在连锁距离分别为
014 cM和 113 cM的 AFLP标记范围内 , 但是以上标记转化为 SCAR标记的报道尚未见 , 还难以在实
际的分子辅助育种中应用。本研究成功的将 AFLPAT/CTA标记转化为 SCAR标记 , 这也是国际上首次报
道的与桃果实非酸 /酸性状连锁的 SCAR标记。通过不同引物组合的扩增以及 F1、F2分离群体的验证 ,
证明了该标记的稳定性、可靠性与准确性。特别是本研究成功转化的 SCAR标记在 F2分离群体中可以
区分纯合体与杂合体 , 表现共显性标记特征。众所周知 , 与显性标记相比 , 共显性标记不仅可以排除
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PCR反应的失败引起的基因型的误判 ; 而且减低了假阳性产生的可能性 , 因为在 PCR扩增中低水平
的 DNA污染不会与未污染的 DNA模板发生显著的竞争。因此 , AFLPAT/CTA标记向 SCARBFPB 1 /B 2标记的
转化不仅提高了该标记在分子辅助育种中的应用性 , 而且增强了对基因型检测的准确性。遗传连锁分
析 SCARBFPB1 /B 2标记与 D基因的连锁距离为 2199 cM , 特别是在 F2群体中的检测结果表明 , 基因型与
表型性状的符合率为 9617% , 进一步说明该标记在分子辅助育种中具有应用价值。当然获得与 D 基
因连锁距离更近的、位于位点两侧的分子标记将是进一步研究的方向 , 这将为开展染色体步移的图位
克隆奠定基础 , 从而最终实现通过基因的直接调控来改良果实性状。
本研究中两个与桃果实非酸 /酸性状连锁的 AFLPTA /CTC、AFLPACT/ CATA标记均未成功转化为 SCAR
标记。已有的研究报道中 , 也有多个 AFLP标记未成功转化的例子 (Negi et al. , 2000; Evans &
James, 2003; Hong et al. , 2006) 。Shan等 (1999) 克隆了 26个大麦与小麦的 AFLP多态性片段 , 设
计特异引物 PCR扩增 , 只有 6对引物表现出 AFLP标记所揭示的多态性 , 转化效率比较低。分析其原
因可能有以下几个方面 : 一是 AFLP扩增片段比较小 (100～500 bp) , 根据引物设计的原则很难设计
合适的 PCR引物 , 例如考虑适当的 GC含量等 ; 相比较而言 RAPD标记片段较大 ( 500～1 500 bp ) ,
比较容易转化成 SCAR标记 (A rdiel et al. , 2002; Xu et al. , 2004; Singh et al. , 2006; Gutierrez et al. ,
2007)。另外 , 扩增产物片段小 , 尽管在与目标基因连锁区域存在共显性标记 , 在琼脂糖凝胶上也难
以区分。二是 AFLP标记特异性引物产生于标记的序列末端 , AFLP引物的选择性碱基决定 AFLP条带
的染色体特异性 , 根据内部序列设计特异性引物时 , 这种特异性很可能消失。三是与酶切位点有关的
AFLP多态性在根据末端序列设计的引物中也不能被体现出来 , 这也是 AFLP转化为 SCAR标记效率
低的一个原因。针对 AFLP标记多态性消失的情况 , Zeng等 (2008) 获得了与油菜雄性育性恢复基
因的 13个 AFLP标记 , 但是只有 5个标记转化为 SCAR标记 , 其中两个是通过 PCR步行获得相邻序
列信息 , 根据此序列重新设计引物而成功转化的。B radden和 Simon (1998) 则利用反向 PCR技术获
得多态性片段两边的序列 , 成功地转化了一个与控制胡萝卜根系中木质部核心胡萝卜素积累的 Y2座
位连锁的片段。另外 , 对于 PCR多态性消失的情况 , 也有借助于限制性酶切 PCR产物的办法来检测
多态性的例子 (M ienie et al. , 2002; Farinhóet al. , 2007)。对于上述恢复标记多态性的方法 , 可以作
为开展后续研究的有效参考。
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