全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（2）：221–228
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–12–07；修回日期：2010–01–25
基金项目：国家‘十一五’科技支撑计划项目（2008BADB1B02）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项；国家自然科学基金项
目（30700543）；国家‘863’计划项目（2007AA10Z174，2006AA100108）；农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室项目
* 通信作者 Author for correspondence (E-mail: zhuangmu@mail.caas.net.cn)
甘蓝 EST-SSR 标记的开发与应用
陈 琛 1,2，庄 木 1,*，李康宁 3，刘玉梅 1，杨丽梅 1，张扬勇 1，程 斐 2，
孙培田 1，方智远 1
（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 青岛农业大学，山东青岛 266109；3 内蒙古农业大学，呼和浩特
010081）
摘 要：从 NCBI 数据库下载 62 567 条甘蓝相关 EST，处理后得到 19 611 条无冗余的 EST，对其进行 SSR
搜索，共得到 1 219 条 SSR，分布在 1 176 条 EST 上，分布密度为 1/11.48 kb，包括 273 种重复基元。在甘
蓝EST-SSR中，二核苷酸（353个SSR）和三核苷酸(423个SSR)占主导地位，所占比例分别为28.96%和34.70%；
出现最多的重复基元是 AG/CT，占总数的 25.59%，其次为 AAG/CTT（94 个，占 7.71%）。针对 1 176 条含
有 SSR 的 EST 设计合成了 978 对引物。用两份甘蓝自交系对 978 对引物进行初筛，897 对引物有扩增产物，
共扩增出 1 026 条扩增带；128 对引物表现出多态性，共有 258 条多态性带（占总带数的 25.15%）。利用 4
对多态性引物，初步构建了中甘 11、8398、中甘 15、中甘 21 杂交新品种及其亲本的指纹图谱。以上结果说
明从甘蓝相关 EST 数据库中开发的 SSR 引物有较好的可用性。
关键词：甘蓝；EST-SSR；标记开发；指纹图谱
中图分类号：S 635 文献标识码：A 文章编号：0513-353X(2010)02-0221-08

Development and Utility of EST-SSR Marker in Cabbage
CHEN Chen1,2， ZHUANG Mu1,*，LI Kang-ning3， LIU Yu-mei1，YANG Li-mei1，ZHANG Yang-yong1，
CHENG Fei2，SUN Pei-tian1，and FANG Zhi-yuan1
(1Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2Qingdao Agricultural
University，Qingdao，Shandong 266109，China；3Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010081，China)
Abstract：A total of 62 567 ESTs in Brassica oleracea were downloaded from NCBI for the identifica-
tion and development of SSR marker. In total, 1 219 SSRs distributed in 1 176 ESTs were identified from 19
611 non-redundant ESTs, with an average of one SSR per 11.48 kb, and included 273 SSR motifs．Analysis
of SSR motifs revealed that the dinucleotides (353 SSR) and tricleotides (423 SSR) were major motifs,
accounted for 28.96% and 34.70% respectively. The AG/CT was the most frequent motifs and accounted for
25.59%，followed by AAG/CTT (94 SSR，7.71%). Based on the 1 176 SSR-containing ESTs, a total of 978
primer pairs were successfully designed and assessed validation of the amplification using two cabbage
inbreed lines (397 and 20-2-5). The results showed that 897 primer pairs yielded 1 026 amplification bands, of
which 128 primer pairs exhibited polymorphism with 258 polymorphic bands accounted for 25.15%. SSR
fingerprint was obtained for 4 cabbage F1, Zhonggan 11, 8398, Zhonggan 15 and Zhonggan 21, and their

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parents，and all the above materials could be discriminated by four specific EST-SSR primer pairs. The results
indicated that the developed SSRs from ESTs of Brassica oleracea were validate and practicable.
Key words：cabbage；EST-SSR；marker development；fingerprinting

简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）标记技术自 1989 年建立以来，由于多态性高，检
测容易，数量丰富，共显性和特异性等特点（Powell et al.，1996），已被广泛用于遗传图谱绘制、重要
农艺性状的基因定位、生物遗传多样性、遗传进化、品种鉴定等诸多方面（韦祖生 等，2008）。构建
DNA 指纹图谱是 SSR 分子标记技术利用的一个重要方面，目前在油菜 (许鲲 等，2008)、马铃薯
(Provan et al.，1996)、番茄 (栾雨时 等，1999)、大白菜 (李丽 等，2009) 等多种作物已有报道。根据
SSR 标记的序列性质不同，SSR 标记可分为基因组 SSR（genomic SSR，gSSR）和表达序列标签 SSR
（expressed sequence tag SSR，EST-SSR）。由于 gSSR 分子标记开发需要构建基因组文库、制备探针
和分子杂交等过程，制约了其发展和应用。随着 GenBank 中许多重要物种的 EST 急剧增加，使其成
为一种新的和有效的 SSR 标记来源（Cordeiro et al.，2001）。EST-SSR 来自基因的转录区，与功能基
因有紧密的连锁，且在物种间有较高的通用性，其开发与应用已在小麦、棉花、大豆、花生、番茄、
油菜和大白菜等作物中报道。
鉴于目前公开报道可利用的甘蓝 SSR 标记有限（http://www.brassica.info），本研究中基于 NCBI
公共数据库公开报道的 6 万余条甘蓝相关 EST，开发 EST-SSR 标记并分析其多态性，为甘蓝类蔬菜作
物及其它芸薹属蔬菜的种质资源分析、指纹图谱、遗传作图和分子标记辅助育种等提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料和模板 DNA 的提取
以早熟圆球的 01-20 和晚熟扁圆球的 20-2-5 两份甘蓝自交系为初筛引物材料，检测引物的扩增与
多态性。以北早（02-12）、中甘 11、金早生（01-88）、084、中甘 15、01-20、8398、79-156、87-534、
中甘 21、99Z521-12 等 11 份甘蓝材料（编号依次为 1 ~ 11），构建甘蓝杂交新品种中甘 11、8398、中
甘 15 和中甘 21 的 DNA 指纹图谱。中甘 11 的亲本是北早（02-12）（来自中国地方品种）和金早生（01-88）
（来自加拿大），其叶球近圆形，外叶色深绿，从定植到成熟约 45 d；中甘 15 的亲本是 01-20（来自
北京早熟的自交系）和 084（来自 Golden Arce），其叶球近圆形，外叶色绿，从定植到成熟约 55 d；
8398 的亲本是 01-20（来自北京早熟的自交系）和 79-156（来自丹麦），其叶球近圆形，外叶色绿，从
定植到成熟约 50 d；中甘 21 的亲本是 99Z521-12（来自北京早熟的显性不育系）和 87-534（来自德国），
其叶球圆球形，外叶色绿，从定植到成熟约 50 d。所有试验材料均由中国农业科学院蔬菜花卉所甘蓝
组提供，于2008年春季种植于本所试验田，在定植缓苗后苗期取幼嫩叶片采用改良CTAB法提取DNA。
1.2 甘蓝 EST 来源及 EST-SSR 的发掘
甘蓝相关 EST 来自 NCBI（美国国家生物技术信息中心）数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST），
共计 62 567 条（截止 2008 年 6 月）。
从数据库直接获取的 EST 中包含一些低质量片段（<100 bp），同时存在着带有少量载体序列及末
端存在 polyA/T“尾巴”的序列，影响相关信息的分析，需要进行前处理，除去 5′端或 3′端 50 bp
的 polyT 或 polyA，直到在 50 bp 大小窗口看到的 5′端和 3′端 polyA 和 ployT 不超过 (T)5或 (A)5，
得到高质量的 EST。
EST 是随机选取测序的，因此导致同一基因重复测序的冗余现象不可避免。前处理后的 EST 通过
2 期 陈 琛等：甘蓝 EST-SSR 标记的开发与应用 223

软件 Phrap 进行片段重叠群分析和聚类。拼接时设定的初始装配参数为：最小匹配碱基数（minmatch）
为 20，最小分值（minscore）为 40。
利用 SSRIT 在线分析软件（http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool）对聚类后的无冗余 EST 序
列进行 SSR 搜索。SSR 筛选标准为：单核苷酸，二、三、四、五和六核苷酸的最少重复次数分别为
18 次、9 次、6 次、5 次、4 次、3 次以上，所有重复类型的总核苷酸数不能少于 18 个。
1.3 EST-SSR 的引物设计
利用 DNAstar 的 Primer select 程序对含有 SSR 的 EST 设计引物，并由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成。引物设计的主要参数：引物长度控制在 17 ~ 24 bp，预期产物长度控制在 150 ~ 350 bp。
1.4 SSR 分析
PCR 反应体系为 20 μL，其中包括：200 mol · L-1 dNTPs，上链和下链引物各 4 pmol，1.0 U Taq
酶，1 × Buffer（内含 1.5 mmol · L-1 MgCl2），50 ng DNA 模板，所用试剂均购自博迈德公司。PCR 扩
增反应条件是：94 oC 预变性 4 min；94 oC 变性 30 s，合适温度退火 30 s，72 oC 延伸 1 min，30 个循
环；72 oC 延伸 7 min。各引物的合适退火温度根据引物合成报告单而定。8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
PCR 产物，160 V 恒压。快速银染法染色。在相同迁移率位置上，有带记为 1，无带记为 0，缺失记为
9。为保证数据准确、可靠，每块胶板均由两人独立记录，然后比对，有争议的数据作缺失处理。
2 结果与分析
2.1 甘蓝 EST-SSR 出现的频率和特点
从 NCBI 下载 62 567 条甘蓝类作物 EST，经过处理后得到 19 611 条无冗余 EST，总长度为 1.4×107
bp，经搜索共挖掘到 1 219 个 SSR，分布在 1 176 条无冗余的 EST 上，发生频率 6.0%（含有 SSR 的
EST 与无冗余 EST 数之比），平均分布距离为 11.5 kb。
表 1 甘蓝 EST 中 SSR 出现频率
Table 1 Occurrence of SSRs in ESTs of Brassica oleracea
重复类型
Type of repeat
基元种数
Number of motif type
占总数的比例/%
Proportion in all motifs
SSR 数
SSR number
占全部 SSR 比例/%
Proportion in all SSRs
平均距离/bp
Mean distance
单核苷酸 Mononucleotide 2 0.73 106 8.70 1.32×105
二核苷酸 Dinucleotide 4 1.47 353 28.96 4.00×104
三核苷酸 Trinucleotide 18 6.59 423 34.70 3.31×104
四核苷酸 Tetranucleotide 17 6.23 24 1.97 5.83×105
五核苷酸 Pentanucleotide 20 7.33 24 1.97 5.83×105
六核苷酸 Hexanucleotide 182 66.67 251 20.59 5.58×104
七核苷酸 Seven nucleotide 22 8.06 29 2.38 4.83×105
八核苷酸 Eight nucleotide 6 2.20 7 0.57 2.00×106
九核苷酸 Nine nucleotide 2 0.73 2 0.16 7.00×106
合计 Total 273 100 1219 100 1.15×104
注：平均距离=无冗余 EST 总长度／SSR 数量。
Note: Mean distance = Total length of non-redundant ESTs／SSR numbers．

从表 1 可以看出，在所有甘蓝 EST-SSR 中，二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型，共占 EST-SSR
总数的 63.66%，三核苷酸重复类型所占的比例最大（423 个，占 SSR 总数的 34.70%），二核苷酸重复
类型次之（353 个，占 28.96%），其余重复类型按所占比例高低依次为六核苷酸重复（20.59%）、单核
苷酸重复（8.70%）、七核苷酸重复（2.38%），四核苷酸重复和其它重复类型所占比例均小于 2%。
224 园 艺 学 报 37 卷

表 3 甘蓝 EST-SSR 基元重复长度
Table 3 The repeat length of SSRs in ESTs of Brassica leracea． /bp
表 2 甘蓝 EST 中主要重复基元
Table 2 The major repeat motifs in ESTs of Brassica oleracea
注：比例小于 1%的基元未列出。
Note: The repeat motifs with the percentage less than 1% were not listed
here.
从 SSR 分布的密度来看，甘蓝 EST 中平均每
11.5 kb 就出现一个 SSR，不同重复类型的 SSR
覆盖的平均距离不一样，SSR 数越多其覆盖的平
均距离越小（表 1）。
共观察到273种重复基元（表2为比例大于
1%的重复基元），出现最多的重复基元是AG/CT
（312个，占总数的25.59%），其次是AAG/CTT
（94个，占7.71%）和A/T（90个，占7.38%），其
余重复类型所占比例较小（均不足5%）。
二至六核苷酸平均基元长度变化范围差异很
大，二核苷酸的长度变化范围最大（18～102 bp），
五核苷酸长度范围最小（20～30 bp）；从平均长
度看，二核苷酸最长（24.13 bp），其次是五核苷
酸（23.83 bp）、四核苷酸（22.67 bp）、六核苷酸
的（21.25 bp）、三核苷酸（20.96 bp）（表 3）。
2.2 甘蓝 EST-SSR 标记的扩增分析
对搜索得到的1 219个甘蓝类作物EST-SSR，
应用 DNAStar 中的 Primer select 程序设计并合成
了 978 对引物（命名为 BoE001 ~ 978），以两份
熟性和球形不同的甘蓝材料（397 和 20-2-5）对
所获得引物检测。结果表明：（1）81 对引物没有
扩增产物，可能是由于模板 DNA 来自基因组包
含内含子，或所设计的引物跨越 mRNA 剪切位点
等原因造成的;（2）897 对引物有扩增带，占总引物的 91.82%，共扩增出 1 026 条带，其中 128 对引
物有多态性，共产生 258 条多态性带，多态性引物占总引物的 13.09%，表明这套引物对甘蓝材料扩增
是有效的。
2.3 4 个甘蓝新品种 SSR 指纹图谱的构建
从两份甘蓝材料（397 和 20-2-5）表现多态性的 128 对引物中，选择 55 对条带清晰、非特异扩增
带较少的引物，对中甘 11、8398、中甘 15、中甘 21 及各自的亲本等 11 份甘蓝材料进行扩增检测。结
果获得 BoE002、BoE222、BoE225 和 BoE916 等 4 对多态性较好的引物（表 4），扩增产物条带 3 ~ 5
表 4 构建甘蓝指纹图谱的 4 对 EST-SSR 引物
Table 4 4 EST-SSR primers used for fingerprinting in cabbage
引物
Primer
重复基元
Repeat motifs
EST 编号
EST code
上链引物 (5′-3′)
Forward primer (5′-3′)
下链引物 (5′-3′)
Reverse primer (5′-3′)
退火温度/
℃ Tm
产物大小/bp
Product size
BoE002 (TCA)7 150909620 CGTCACGGTGGCGCTTTATTTT TAGCGGCAGCGACGTGGAGAAC 60.0 284
BoE222 (CGATGA)3 150914869 TTGCTGAAGAAGTTGGGATTGAGG CGGCTTTTCTTTTCCTTCTGC 55.0 184
BoE225 (ATC)7 150918267 ATCTGATGTGGAGCCTGTTGTT CCTTACGATCTGGGAGTGAAAA 50.0 171
BoE916 (TCTCAT)3 75973414 AACTGAGACTGAAAAAGACAAACA TTCAGCATCAATCAACTTATCAAT 49.3 166
重复类型
Repeat type
重复基元
Repeat motif
数量
Number
发生频率/%
Frequency
所占比例/%
Proportion
A/T 90 0.46 7.38单核苷酸
Mononucleotide C/G 16 0.08 1.31
AC/GT 16 0.08 1.31
AG/CT 312 1.59 25.59
二核苷酸
Dinucleotide
AT/TA 24 0.12 1.97
三核苷酸 AAC/GTT 29 0.15 2.38
Trinucleotide AAG/CTT 94 0.48 7.71
ACC/GGT 18 0.09 1.48
AGA/TCT 50 0.25 4.10
AGC/GCT 23 0.12 1.89
AGG/CCT 43 0.22 3.53
AGT 21 0.11 1.72
ATC/GAT 31 0.16 2.54
ATG/CAT 17 0.09 1.39
CAG/CTG 17 0.09 1.39
重复类型 Repeat type 变化范围 Variation 平均长度 Average
二核苷酸 Dinucleotide 18 ~ 102 24.13
三核苷酸 Trinucleotide 18 ~ 75 20.96
四核苷酸 Tetranucleotide 20 ~ 36 22.67
五核苷酸 Pentanucleotide 20 ~ 30 23.83
六核苷酸 Hexanucleotide 18 ~ 42 21.25
2 期 陈 琛等：甘蓝 EST-SSR 标记的开发与应用 225

不等，分子量 140 ~ 280 bp，共扩增出多态性带 16 条，扩增重复性好（图 1）。利用这 4 对引物初步构
建了中甘 11、8398、中甘 15 和中甘 21 等 4 个甘蓝新品种的 SSR 指纹图谱（图 2）。

图 1 4 个 SSR 引物对 4 个甘蓝杂交新品种及其亲本的扩增多态性结果
1 ~ 11 依次为甘蓝材料北早，中甘 11、金早生、084、中甘 15、01-20、8398、79-156、
87-534、中甘 21 和 99Z521-12。
Fig.1 Amplified bands of four polymorphic primers in 4 cabbage hybrids and their parents
1–11 are cabbage samples Beizao，Zhonggan 11，Jinzaosheng，084，Zhonggan 15，
01-20，8398，79-156，87-534，Zhonggan 21 and 99Z521-12 respectively.

图2 4个甘蓝杂交种及其亲本的SSR指纹图谱
＋表示有泳带；－ 表示无泳带；1 ~ 11分别对应甘蓝材料北早、中甘11、金早生、084、中甘15、
01-20、8398、79-156、87-534、中甘21和99Z521-12。
Fig. 2 SSR Fingerprint of 4 cabbage hybrids and their parents
＋：bands；－：No bands；Lanes 1–11 represent the cabbage samples Beizao，Zhonggan 11，
Jinzaosheng，084，Zhonggan 15，01-20，8398，79-156，87-534，
Zhonggan 21 and 99Z521-12 respectively.
226 园 艺 学 报 37 卷

3 讨论
3.1 甘蓝 EST-SSR 的分布特征
对 19 611 条无冗余甘蓝相关 EST 进行搜索，在 1 176 条 EST 上挖掘到 1 219 个 SSR，含 SSR 序
列占无冗余 EST 序列总数的 6.0%，高于大白菜 10.4%（葛佳 等，2005），与 EST 文库中大约高达 2%
至 11%的 EST 序列中含有 SSR 的推测相符合（Cordeiro et al.，2001）。甘蓝 EST-SSR 的基元类型丰富
（273 种），频率高，密度较大（平均距离 11.48 kb），高于拟南芥（14.9 kb）、小麦（15.6 kb）、棉花（20.0
kb）（李永强 等，2004），水稻（11.8 kb）、玉米（28.3 kb）和大豆（23.8 kb）(Gao et al.，2003)，但低
于大白菜（10.3 kb）和油菜（4.34 kb）（葛佳 等，2005；李小白 等，2007）。这种差异与物种的真实
SSR 信息（本研究中近半数 EST 来自甘蓝类蔬菜中的芥蓝）、EST 的数量、搜索 SSR 软件的算法与参
数设定等多种因素有关。
在甘蓝 EST-SSR 中，最多的重复类型是三核苷酸（423 个 SSR），占总数的 34.70%，这与已报道
的甘蔗、棉花、水稻、玉米、小麦、大白菜、番茄和拟南芥的结果（Cardle et al.，2000；王静毅等，
2008）一致。AAG/CTT（94 个，占 EST-SSR 总数的 7.71%）是甘蓝三核苷酸重复中出现频率最高的
类型，这与大白菜（葛佳 等，2005）、油菜（李小白 等，2007）、拟南芥（Cardle et al.，2000）、大豆
（Gao et al.，2003）等中的情形相一致，本研究结果进一步验证了在双子叶植物中 AAG/CTT 重复丰
度很高的推测（Gao et al.，2003）。
在甘蓝 EST-SSR 所有的基元重复类型中，AG/CT（312 个，占总数的 25.59%）所占比例最高。这
与大白菜（84.2%）、大麦 (52%) 和小麦 (45%) 的结果（Thiel et al.，2003；Nicot et al.，2004）近似，
也与 Morgante 等（2002）对多种不同植物综合分析后所报道的结果相符，但与猕猴桃中频率最高的二
核苷酸重复序列为 CT (Fraser et al.，2004)和番茄中 AT 为频率最高 (Areshchenkova & Ganal，2002) 的
结果不一致。GC 重复基元在多数植物中很难见到或稀有，在甘蓝二核苷酸重复中 GC 仅出现了一次，
在大白菜二核苷酸重复中无 GC（葛佳 等，2005），小麦的报道中也得到了类似的结果（Nicot et al.，
2004）。
3.2 甘蓝 EST-SSR 标记的应用性
本研究对获得的 978 对甘蓝 EST-SSR 引物，用 397 和 20-2-5 进行扩增初筛时，91.82%的引物有
扩增带，其中 13.09%的引物在 397 和 20-2-5 间表现多态性。EST 的高度保守性是导致其多态性较低
的重要因素（Zhang et al.，2005），对无多态性的 EST-SSR 扩增产物可先用不同的限制性内切酶处理，
然后电泳分离酶切产物，利用 SSR-CAPs 方法来提高 EST-SSR 引物的多态性 (McCallum et al.，2001；
Iwata et al.，2001)。
以SSR分子标记技术构建的DNA指纹图谱已广泛的应用于玉米 (Smith，1997)、小麦 (李根英 等，
2006)、油菜 (许鲲 等，2008)、马铃薯 (Provan et al.，1996)、番茄 (栾雨时 等，1999)、大白菜 (李
丽 等，2009)等多种作物。中甘 11、8398、中甘 15 和中甘 21 是我国当前春甘蓝栽培中广泛应用的主
栽品种，本研究通过对多态性甘蓝 EST-SSR 引物的扩增筛选，仅用 4 对引物就能区分这 4 个甘蓝新品
种及其各自的亲本，初步建立了它们的 EST-SSR 指纹图谱。引物的多态性信息量（PIC）是衡量引物
适合程度的重要指标，反映引物揭示信息量的多少，越高包含的信息量越大（许鲲 等，2008）。构建
甘蓝新品种指纹图谱的引物 PIC 值由高到低的顺序为 BoE225 (0.69)、BoE916 (0.65)、BoE0002 (0.57)、
BoE222 (0.48)，平均 PIC 值为 0.60，进一步表明这套引物是有效的。
EST-SSR 来自基因的编码区，与功能基因有紧密的连锁，这有可能对决定重要表型性状的等位基
因进行直接鉴定（Chen et al.，2001）。此外，EST 的高度保守性使得 EST-SSR 且在物种间有较高的通
2 期 陈 琛等：甘蓝 EST-SSR 标记的开发与应用 227

用性（Gupta et al.，2003；忻雅 等，2006）。本研究开发的甘蓝 EST-SSR 标记，已用于大白菜重要性
状的遗传连锁图谱构建（汪骞 等，2009），其在甘蓝类蔬菜作物及其它芸薹属蔬菜的种质资源分析、
遗传作图和分子标记辅助育种等应用研究正在进行中。

References
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