全 文 ：园 艺 学 报 2009, 36 (3) : 333 - 340
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 11 - 18; 修回日期 : 2009 - 02 - 18
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30871679) ; 山东省农业良种产业化工程项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: chenxs@ sdau1edu1cn)
新疆野生樱桃李 S2RN ase基因分离与鉴定的初步
研究
刘崇琪 1, 2 , 陈晓流 1 , 张艳敏 1 , 林 群 1 , 王金政 3 , 张 红 1 , 张春雨 1 ,
陈学森 13
(1 山东农业大学作物生物学国家重点实验室 , 山东泰安 271018; 2 山东省农业广播电视学校章丘市分校 , 山东章丘
250200; 3 山东省果树研究所 , 山东泰安 271000)
摘 要 : 从 4对已报道的李属树种 S2RN ase基因引物组合中筛选出扩增效果较好的 PruC2和 PruC4R组
合 , 对新疆野生樱桃李 ( P runus cerasifera Ehrh. ) 的 45个株系的基因组 DNA进行 S 2RN ase基因特异性 PCR
扩增 , 并对其 PCR产物进行克隆测序。这些核酸序列及其相应的氨基酸序列在 GenBank中进行比对 , 皆与
李属的 S 2RN ase基因有最大同源性 , 为新疆野生樱桃李的 4种 S 2RN ase基因 , 分别命名为 S1 (511 bp )、S2
(787 bp)、S3 (1 859 bp) 和 S4 ( 464 bp ) , 在 GenBank的登录号分别为 EF638726、EF641276、EF661873
和 EF661874。45个株系中 , 43个株系的 S基因型分别为 S1 S2、S1 S3、S2 S3、S2 S4和 S3 S4 , 而 10号和 15号
株系分别只鉴定了 1种 S2RN ase基因 , 其 S基因型组成有待于进一步研究。
关键词 : 樱桃李 ( Prunus cerasifera Ehrh. ) ; 自交不亲和性 ; S2RN ase基因 ; S基因型
中图分类号 : S 662 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2009) 0320333208
Pr imary Study on Iden tif ica tion of S 2RN ase Genes in W ild M yroba lan Plum
( P runus cerasife ra Ehrh. )
L IU Chong2qi1, 2 , CHEN Xiao2liu1 , ZHANG Yan2m in1 , L IN Qun1 , WANG J in2zheng3 , ZHANG hong1 ,
ZHANG Chun2yu1 , and CHEN Xue2sen13
(1 S ta te Key Laboratory of C rop B iology, Shandong A gricu ltura l U niversity, Taipian, Shandong 271018, China; 2 Zhangqiu A gri2
cu ltura l B roadcasting and Television School, Zhangqiu, Shandong 250200, China; 3 Shandong Institu te of Pom ology, Ta ipian,
Shandong 271000, China)
Abstract: On fourty2five strains of wild myrobalan p lum ( P runus cerasifera Ehrh. ) , the PCR amp lifica2
tion was carried out with the p rimer pair PruC2 /PruC4R designed according to the conserved sequence of am i2
no acid of Prunus S 2RN ase. The PCR bands were cloned and sequenced. The sequences were blasted in Gen2
Bank which showed them having the maximum identity with P runus S 2RN ases, and four S 2RN ase alleles were
identified and named as S1 (511 bp) , S2 (787 bp) , S3 (1 859 bp) and S4 (464 bp) alleles respectively.
Their accession numbers in GenBank are EF638726, EF641276, EF661873 and EF661874 . The S 2genotypes
of 43 strains were S1 S2 , S1 S3 , S2 S3 , S2 S4 and S3 S4. However, only one S 2RN ase allele was identified as
S3 2RN ase on strain 10 and S4 2RN ase on strain 15, the S 2genotypes of strain 10 and 15 remain to be further
studied.
Key words: myrobalan p lum; P runus cerasifera Ehrh. ; self2incompatibility; S 2RN ase; S 2genotype
果树 S 2RN ase基因的克隆、序列分析、遗传及 S基因型的鉴定等是植物自交不亲和性分子机理研
究的重要内容 , 对于果树自交亲和品种的选育及授粉树选配等具有重要意义 (陈晓流 等 , 2004)。蔷
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园 艺 学 报 36卷
薇科植物的自交不亲和性 ( self2incompatibility, SI) 由 S位点 (S 2locus) 复等位基因控制 ( Certal et
al. , 1999)。目前自交不亲和性的研究表明 , S位点 (S 2locus) 中参与 SI反应的基因至少有两种 , 一
种在花柱特异表达 , 即 S 2RN ase基因 , 一种在花粉特异表达 , 是编码 F2box蛋白的 F2box基因 ( S 2
locus F2box p rotein gene: SLF或 SFB ) , 称之为花粉 S决定子基因 (pollen S 2locus determ inant gene)。
花粉 F2box蛋白参与了花柱 S 2RN ase介导的 GSI系统 (Lai et al. , 2002; U shijima et al. , 2003; Q iao
et al. , 2004)。
国内外有关甜樱桃 ( P runus avim L. ) ( Tao et al. , 1999; 陈晓流 等 , 2004)、杏 ( Prunus arm e2
n iaca L. ) (Romero et al. , 2005; 吴燕 等 , 2005; 张立杰 等 , 2007)、扁桃 [ P runus du lcis (M ill. )
D1A1W ebb ] (马艳和马荣才 , 2006; O rtega et al. , 2006) 等核果类果树自交不亲和性研究的报道甚
多。樱桃李 ( P runus cerasifera Ehrh. ) 作为典型的配子体自交不亲和核果类树种 ( Sassa et al. ,
1996) , 目前尚未见有关其 S 2RN ase基因及自交不亲和性方面的研究报道。作者在已建立野生樱桃李
叶片再生体系及表型性状遗传多样性评价 (刘崇琪 等 , 2008a, 2008b) 的基础上 , 进一步以新疆野
生樱桃李为试材 , 对其 45个株系的 S 2RN ase基因进行了克隆测序 , 获得了 4个 S 2RN ase基因 , 初步确
定了新疆野樱桃李林群体的 S基因型有 5种类型 , 旨在为新疆野生樱桃李资源的有效保护与合理利用
提供科学依据 , 并为进一步开展樱桃李自交不亲和性机理研究奠定基础。
1 材料与方法
111 材料
试验于 2005—2007年在山东农业大学作物生物学国家重点实验室进行。试验材料为分布在新疆
伊犁地区霍城县大西沟乡的野生樱桃李。为保证试材具有足够的代表性 , 在野生樱桃李林中每隔 50
～300 m随机选取实生株系 , 共选取 45个实生株系 , 使其覆盖野生樱桃李林的 95%以上。从每个株
系上采取幼嫩叶片 , 放于硅胶中干燥保存备用。
112 方法
11211 基因组 DNA提取
取嫩叶 015 g左右 , 基因组 DNA的提取采用吴树敬和陈学森 (2003) 的改良 CTAB法 , 经 112%
的琼脂糖电泳检测后 , 于 - 20 ℃贮存备用。
11212 供试引物
本试验选用的 4个蔷薇科李属通用引物组合 , 其序列详见表 1。
表 1 扩增樱桃李 S基因的引物组合及其序列
Table 1 Sequences of con sen sus pr im ers used to am plify S 2a lleles of m yroba lan plum
序号
No.
引物组合
Primer combination
序列 (5′→3′)
Sequence
文献
Reference
1 PruC2 CTA TGG CCA AGT AAT TAT TCA AAC C Tao et al. , 1999
PruC4R GGA TGT GGT ACG ATT GAA GCG
2 PruC2 CTA TGG CCA AGT AAT TAT TCA AAC C Tsukamoto et al. , 2006
PCE2R TGT TTG TTC CAT TCG CYT TCC C
3 PruC2 CTA TGG CCA AGT AAT TAT TCA AAC C Tao et al. , 1999
PruC5 TAC CAC TTC ATG TAA CAA CTG AG
4 EM2PC2consFD TCA CMA TYC ATG GCC TAT GG Sutherland et al. , 2004
EM2PC3consRD AW S TRC CRT GYT TGT TCC ATT C
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3期 刘崇琪等 : 新疆野生樱桃李 S2RN ase基因分离与鉴定的初步研究
11213 基因组 DNA S 2RN ase基因的特异性扩增
以各实生株系 DNA为模板 , PCR扩增程序为 : 94 ℃预变性 4 m in, 94 ℃变性 30 s, 50 ℃退火 2
m in, 68 ℃延伸 2 m in, 10个循环后再 94 ℃变性 10 s, 56 ℃退火 2 m in, 68 ℃延伸 130 s, 25个循环
后再延伸 5 m in。反应体系 25μL, 包括 10 ×PCR Buffer 215μL、210 mmol·L - 1 MgCl2、012 mmol·
L - 1 dNTP、Taq酶 1125 U、各引物 012μmol·L - 1、50 ng模板。
反应结束后 , 用 114%的琼脂糖凝胶电泳 1 h, 溴化乙锭 ( EB ) 染色法检测 PCR产物的有无和片
段大小。
11214 扩增效果的评价
扩增效果的评价主要依据张立杰等 (2007) 应用的指标 : 扩增系数 ( % ) =实际扩增出的条带总
数 /应扩增出的理论条带总数 ×100; 扩增效率 ( % ) =两条带的株系数 /参试株系数 ×100。
11215 S 2RN ase基因目的片段的测序
取 PCR产物直接与克隆载体 pGEM 2T easy Vector ( Promega公司产品 ) 连接或经回收后再连接 ,
连接产物转化感受态大肠杆菌 , 涂布于含有 IPTG、X2gal、Amp (100 mg·mL - 1 ) 的 LB固体培养基
上 37 ℃过夜。挑取白色单菌落置于 3 mL LB液体培养基中 , 37 ℃摇菌过夜 , 然后取 1μL菌液做
PCR, 用 114%的琼脂糖电泳检测 PCR产物 , 菌液 PCR片段由上海生工生物工程服务有限公司测序。
11216 DNA序列分析及 S基因型确定
将测序结果在 GenBank中利用 B last进行序列比对 , 根据最大同源性确定该基因的种类 , 并予以
命名 , 并确定被检测樱桃李株系的 S基因型。用 DNAMAN软件对所测核酸序列相应的氨基酸序列进
行同源性比较。
2 结果与分析
211 不同引物组合对樱桃李株系的扩增效果
4对引物组合 (表 1) 对部分参试樱桃李株系的扩增结果见图 1和表 2。
从图 1可以看出 , 在 PCR反应体系与琼脂糖凝胶电泳等条件一致的情况下 , 引物组合 PruC2 +
PruC4R扩增带的亮度明显优于引物组合 PruC2 + PCE2R、 PruC2 + PruC5 和 EM 2PC2consFD + EM 2
PC3consRD。
图 1 不同引物组合对部分樱桃李品种基因组 D NA的 S等位基因扩增图
M. DL2000 marker; 5、14、4、13为表 2对应樱桃李株系。
F ig. 1 S2a llele am plif ica tion w ith d ifferen t pr im er com b ina tion s in partia l m yroba lan plum stra in s
M. DL2000 marker; 5, 14, 4, 13 stand for myrobalan p lum strains in Table 2.
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从表 2可以看出 , 不同的引物组合对参试的 15个樱桃李株系的扩增系数和扩增效率差异很大 ,
其中引物组合 PruC2 + PruC4R扩增系数和扩增效率均为最高 (9313%和 8617% ) , 故扩增效果最好 ,
其次为引物组合 PruC2 + PCE2R (7313%和 6617% ) 和引物组合 PruC2 + PruC5 (5313%和 2617% ) ,
引物组合 EM 2PC2consFD + EM 2PC3consRD的扩增系数及扩增效率均为最低 (20%和 0) , 扩增效果最
差。
表 2 不同引物组合对参试樱桃李株系基因组 D NA的 S等位基因扩增结果
Table 2 Am plif ica tion of S2a lleles in m yroba lan plum stra in s using d ifferen t con sen sus pr im er com b ina tion s
株系 Strain PruC2 + PruC4R PruC2 + PCE2R PruC2 + PruC5 EM2PC2consFD + EM2PC3consRD
1 + + + + +
2 + + + + + + -
3 + + + + +
4 + + + + + + -
5 + + + + + + -
6 + + + + + +
7 + + - - -
8 + + - - +
9 + + + + + + -
10 + - - -
11 + + + + + +
12 + + + + + -
13 + + + + + -
14 + + + + + -
15 + + + + +
扩增系数 /% 9313 7313 5313 20
Coefficient of amp lification
扩增效率 /% 8617 6617 2617 0
Efficiency of amp lification
注 : + +. 扩增出两条带 ; +. 扩增出一条带 ; - . 未扩增出带。
Note: + +. Two alleles were amp lified; +. Only one allele was amp lified; - . No allele was amp lified.
212 樱桃李株系 S 2RN ase基因的扩增及克隆测序
用本试验筛选出的最佳引物组合 PruC2 + PruC4R分别对株系 1～45号基因组 DNA进行特异性
PCR扩增 , 并对其 PCR产物进行克隆测序 , 1～15号株系的扩增结果见图 2。16～45号株系的扩增带
型、测序结果与图 2中 (1～15号株系 ) 的相应带型、测序结果重复 , 因此未列出。
图 2 引物组合 PruC2 + PruC4R对 15个樱桃李株系基因组 D NA的 S等位基因扩增图
M. DL2000 marker; 1～15为表 2对应樱桃李株系。
F ig. 2 S2a llele am plif ica tion w ith pr im er PruC2 + PruC4R in 15 m yroba lan plum stra in s
M. DL2000 marker; 1 - 15 stand for myrobalan p lum strains in Table 2.
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3期 刘崇琪等 : 新疆野生樱桃李 S2RN ase基因分离与鉴定的初步研究
从图 2可以看出 , 除 10号和 15号株系扩增出 1条带外 , 其他 13个株系均扩增出了 2条带。将
上述片段进行克隆测序 , 结果显示 , 15个樱桃李株系共包含 4种核苷酸序列 , 分别为 511、787、
1 859和 464 bp。
从 GenBank中 megaB lastn显示 , 与这 4种核苷酸序列同源的前 50个基因均为蔷薇科李属的 S 2
RN ase基因 , 并从 GenBank数据库中分别找到与 4种核苷酸序列及其相应的氨基酸序列的同源性最高
的 S 2RN ase基因序列。4个片段的核酸序列最大同源性基因分别为 : 511 bp序列与梅 ( P1m um e) S15 2
RN ase基因 (注册号 DQ903312, 98147% ) , 464 bp序列与甜樱桃 ( P. avium ) S19 2RN ase基因 (注册
号 AJ862658, 94138% ) , 1 859 bp 序列与扁桃 ( P. du lcis) S53 2RN ase基因 (注册号 AY613340,
8919% ) 及 787 bp序列与日本樱桃 ( P. speciosa) S3 2RN ase基因 (注册号 AB289860, 8611% )。
4个片段所推导的氨基酸序列的最大同源性基因分别为 : 511 bp序列与梅 ( P. m um e) S15 2RN ase
基因 (注册号 DQ903312) , 相似性为 98% ; 1 859 bp序列与扁桃 ( P. du lcis) Sc 2RN ase基因 (注册
号 AB011470) , 相似性为 95% ; 464 bp序列与梅
( P. m um e) S10 2RN ase基因 (注册号 EU020117) ,
相似性为 87% ; 787 bp序列与中国李 ( P. sa lici2
na) S8 2RN ase基因 (注册号 DQ512913) , 相似性
为 84%。
进一步分析显示出所有相似的片段都位于该
类基因保守的外显子区 , 将这些核苷酸序列命名
并在 GenBank中注册 (表 3)。
表 3 新疆野生樱桃李 4个 S2RN ase基因
Table 3 Four new S genes of w ild m yroba lan plum
S基因
S2gene 片段长度 / bpFragment of length GenBank登录号GenBank accesion No.
S1 511 EF638726
S2 787 EF641276
S3 1 859 EF661873
S4 464 EF661874
213 樱桃李株系 S 2RN ase基因的氨基酸序列分析
把已报道的李属 S 2RN ase基因 cDNA序列与本研究克隆的基因组序列比对 , 根据内含子 ‘GT/
AG’剪接法则分别对 4个 S 2RN ase基因去除各自的内含子 (分别为 230、506、1 578和 183 bp ) 后 ,
4个 S 2RN ase基因都得到大小为 281 bp的核苷酸序列 , 并对其推导的氨基酸序列进行分析比较 (图
3) , 4个氨基酸序列含有李属 S 2RN ases的 3个高度保守的结构域 (C2、C3和 RC4) , 许多位点落在高
变区 (RHV )。
图 3 S1 ～S4 2RN ase基因的部分氨基酸序列比较
灰色阴影及星号代表相同的氨基酸 , □表示 S 2RN ases基因结构域。
F ig. 3 Partia l deduced am ino ac id sequence a lignm en t correspond ing to cloned S1 - S4 a lleles in th is work
The black shadowes alphabets and asterisks ( 3 ) stand for the same am ino acid sequence.
□: Structural area of S 2RN ases.
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利用 DNAMAN软件对推导出的氨基酸序列进行比较 , 其中 S1与 S4、S2与 S3及 S2与 S4的相似系数
最高 , 均为 79179, S1与 S2及 S1与 S3的相似系数最低 , 均为 75153。
214 樱桃李株系 S基因型的鉴定
根据测序结果 , 对图 2中具有 2条带的 13个
株系 S基因型进行了鉴定 , 13个樱桃李株系共鉴
定出 5 种 S 基因型组成 , 分别为 S1 S2、 S1 S3、
S2 S3、S2 S4、S3 S4 ; 对 43个株系 S基因型进行鉴
定和统计 , 结果见表 4。由表 4可以看出 , 43个
株系共鉴定出 5种 S基因型 , 但各基因型的比率
存在较大差异 , 其中 S1 S2基因型的比率最高 , 达
2719% , 而 S1 S3基因型比率最低 , 占 1410%。
株系 10号和株系 15号 S基因 PCR条带出现
了 1条 , 在克隆测序时分别挑取 10个克隆进行 S 2 表 4 新疆野生樱桃李 43个株系 S2RN ase基因型及其比率Table 4 S genotypes and the ir ra tes of 43 stra in sin w ild m yroba lan plum序号No. S基因型Genotype of S 株数Number of strain比率 /%Rate1 S1 S2 12 27192 S1 S3 6 14103 S2 S3 8 18164 S2 S4 8 18165 S3 S4 9 2019
RN ase基因的分离与鉴定 , 分别只鉴定出了一种 S 2RN ase基因 , 株系 10号为 S3 2RN ase基因 , 株系 15
号为 S4 2RN ase基因。因此 , 对株系 10号和株系 15号的 S基因型还有待于进一步研究。
3 讨论
311 关于野生樱桃李 S 2RN ase基因与 S基因型鉴定所利用引物组合的筛选问题
设计或选用合适的引物组合是利用 S等位基因专一性 PCR扩增法进行果树 S基因型鉴定的关键
环节 (张立杰 等 , 2007)。Suetherland等 (2004) 利用引物组合 EM 2PC2consFD + EM 2PC3consRD检
测出了樱桃的 S2和 S5、扁桃的 S4和 S5以及杏的 S2、S6和 Sc这些不能被 PruC2 + PruC4R和 PruC2 +
PruC5等引物组合检测的基因 ; 张立杰等 ( 2007) 的研究结果表明 , 引物组合 EM 2PC2consFD + EM 2
PC3consRD对杏品种 S基因的扩增效果明显优于引物组合 PruC2 + PruC4R和 PruC2 + PruC5。本试验
结果表明 , 引物组合 PruC2 + PruC4R对樱桃李株系 S基因扩增系数和扩增效率最高 , 分别为 9313%
和 8617% , 扩增效果最好 ; 而引物组合 EM 2PC2consFD + EM 2PC3consRD扩增系数和扩增效率最低 ,
分别为 20%和 0, 扩增效果最差 , 说明李属不同种间的 S基因存在较大差异。因此 , 在进行 S基因扩
增时要设计或选择与 S基因相匹配的引物组合。
Tao等 (2000) 利用引物组合 PruC2 + PruC4R在梅的自交不亲和品种 Baigo和自交亲和品种 Ken2
saki上均只扩增出一条带 ; Wünsch和 Hormaza (2004) 利用不同的引物组合对甜樱桃品种进行了 S基
因鉴定 , 认为引物序列与品种序列的不匹配是一些 S基因不能被检测的原因之一。
本研究中利用引物组合 PruC2 + PruC4R, 对 43个樱桃李株系扩增出了 2条带 , 在株系 10号和株
系 15号中只扩增出 1条带 , 其原因可能是这两个株系的 S基因保守区同其它 43个樱桃李株系的 S基
因保守区之间存在差异 , 引物组合 PruC2 + PruC4R不能与之完全匹配造成的 , 这尚有待于进一步的
研究。
因此 , 要对不同樱桃李株系 S基因型进行全面、准确的鉴定 , 不仅需要从已报道的引物组合中选
用不同的引物组合 , 而且还需要根据樱桃李的 S基因序列进一步开发、设计新的专用引物。
312 关于新疆野生樱桃李群体 S 2RN ase基因多态性及 S基因型组成的问题
野生樱桃李在我国仅分布于新疆伊犁地区霍城县婆罗科努山的大、小西沟 (林培钧和崔乃然 ,
2000) , 早在 1984年就被国务院环境保护委员会列入国家极重点保护植物名录。由于掠夺式的资源开
发及农田开垦等因素而导致野生樱桃李果树资源破坏严重 , 野果林面积急剧减少 , 濒临灭绝 (冯涛
等 , 2006)。
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3期 刘崇琪等 : 新疆野生樱桃李 S2RN ase基因分离与鉴定的初步研究
本试验首次从 45个樱桃李株系中分离并鉴定了 4个 S 2RN ase基因 , 并在 GenBank中注册 , 分别
为 S1 ( EF638726)、S2 ( EF641276)、S3 ( EF661873) 和 S4 ( EF661874) ; 与甜樱桃、杏、扁桃等核
果类果树已鉴定出的 S 2RN ase基因数量相比 , 野生樱桃李 S 2RN ase基因数量较少 , 多态性较差 , 造成
这一结果的原因可能与野生樱桃李分布单一、变异不丰富有关 , 这与新疆野生樱桃李果实形态性状、
可溶性固形物与矿质元素含量以及挥发性化合物组分等表型性状遗传多样性分析的研究结果 (刘崇
琪 等 , 2008b) 相一致。
进一步从 GenBank中 megaB lastn发现 , 与野生樱桃李 S1 2RN ase～S4 2RN ase基因核苷酸序列同源性
最高的 S 2RN ase基因序列分别是梅 S15 2RN ase、甜樱桃 S19 2RN ase、日本樱桃 S53 2RN ase及扁桃 S3 2RN ase
基因 , 表明核果类果树李属内 S 2RN ase基因存在着相似的进化机制 , 可能是一个共同的祖先。
按照孟德尔遗传规律 , 4个 S 基因可以组合成 6种 S 基因型 (S1 S2、S1 S3、S1 S4、S2 S3、S2 S4、
S3 S4 ) , 从本试验的结果中可以看出 , 参试樱桃李株系的 S基因型组成经鉴定有 5种 (S1 S2、S1 S3、
S2 S3、S2 S4、S3 S4 ) , 造成这一结果的原因可能是基因型组成为 S1 S4的株系已被破坏灭绝 , 因此需要在
继续大量采样的基础上进一步分析验证。
References
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