全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (12) : 1725 - 1732
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 04 - 14; 修回日期 : 2009 - 10 - 27
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30370999) ; 福建省自然科学基金项目 (2009J01084)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: weichen909@1631com)
‘白核 ’龙眼种子败育不同时期差异蛋白分析
刘　浩 1, 2 , 柳燕贞 1, 2 , 王　静 1, 2 , 郑少泉 3 , 蒋际谋 3 , 陈　伟 1, 23
(1 福建农林大学生命科学学院 , 福州 350002; 2 福建农林大学蛋白质组学研究中心 , 福州 350002; 3 福建省农业科学
院果树研究所 , 福州 350013)
摘　要 : 以 ‘白核 ’龙眼种子为试验材料 , 比较两种蛋白质的提取方法 , 确定了酚抽法提取龙眼种子
蛋白。应用蛋白质组学研究技术 , 分析了龙眼种子败育 4个不同时期的蛋白质组变化 , 共发现 21个差异蛋
白 , 其中 9个上调表达 , 12个下调表达。通过 MALD I/TOF /TOF2MS/MS质谱分析和蛋白质数据库检索 , 共
鉴定出 12个差异蛋白 , 分别为胞质苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、RuB isCO大亚基结
合蛋白α、β亚基、17 kD HSP、抗坏血酸过氧化物酶、胞质抗坏血酸过氧化物酶、半胱氨酸蛋白酶、Des2
sication2related p rotein以及两个未知蛋白。这些鉴定出的差异蛋白质与能量和物质代谢、分子伴侣功能、自
由基清除和抗氧化作用、细胞凋亡等生理过程密切相关 , 可能参与了龙眼种子败育过程。
关键词 : 龙眼 ; 种子 ; 败育 ; 差异蛋白 ; 双向电泳 (22DE) ; 质谱分析
中图分类号 : S 66712　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1221725208
Ana lysis of D ifferen tia lly Expressed Prote in s D ur ing the D ifferen t Stages of
L ongan Seed Abortion
L IU Hao1, 2 , L IU Yan2zhen1, 2 , WANG J ing1, 2 , ZHENG Shao2quan3 , J IANG J i2mou3 , and CHEN W ei1, 23
(1 College of L ife Sciences, Fujian A gricu lture and Forest U niversity, Fuzhou 350002, Ch ina; 2 Proteom ics Research Cen ter, Fu jian
A gricu lture and Forestry U niversity, Fuzhou 350002, Ch ina; 3 Fru it Research Institu te, Fujian A cadem y of A gricu lture Sciences,
Fuzhou 350013, Ch ina)
Abstract: By comparing with two p rotein extraction methods, ensured the op timal method for longan
seed p roteins extraction. Proteom ic app roaches were used to analyze the changes of differentially exp ressed
p roteins during four different stages of longan seed abortion. Twenty2one differentially exp ressed p roteins were
detected on 22DE gels, 9 were up2regulated and 12 were down2regulated. Among these p roteins, 12 p roteins
were identified by MALD I/TOF /TOF2MS/MS and p rotein database searching. They were cytosolic malate de2
hydrogenase, D ihydrolipoam ide adetyltransferase, 2, 32bisphosphoglycerate2independent phosphoglycerate
mutase, RuB isCO large subunit2binding p rotein subunit beta chlorop last p recursor, RuB isCO large subunit2
binding p rotein subunit beta chlorop last p recursor, 17 kD heat shock p rotein, ascorbate peroxidase, cytosolic
ascorbate peroxidase, cysteine p rotease, dessication2related p rotein, and two unknown p rotein. These p roteins
were involved in energy and metabolism, chaperon, antioxidation, apop tosis, which m ight relate to seed abor2
tion of longan.
Key words: longan; seed; abortion; differentially exp ressed p rotein; two2dimensional electrophoresis
(22DE) ; mass spectrometry analysis
龙眼 (D im ocarpus longan Lour. ) 为我国重要和特色的南亚热带果树。焦核龙眼是龙眼中的珍稀
品种 , 具有核小 , 果肉厚等优良性状。福建省农业科学院果树研究所自 20世纪 60年代开展了焦核龙
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眼的选种研究工作 , 收集了多个具有焦核性状的单株 (如 : 闽焦 6421、闽焦 6422、白核龙眼 ) , 为选
育焦核龙眼新品种奠定了基础。然而焦核龙眼焦核率的不稳定性严重影响了该品种的推广种植和经济
效益 , 因此对龙眼焦核机理的研究具有重要的理论与生产实践意义。
郑少泉等 (1996) 解剖观察到焦核龙眼种子 (胚珠 ) 发育前期发育完全正常 , 液态胚乳充满胚
囊。随着种子的发育 , 种子内腔壁或胚体开始出现褐变或坏死。许家辉等 (2005) 认为引起龙眼焦
核的原因有很多方面 , 但最主要是由龙眼单株本身的遗传本质决定 , 即受母本基因型所决定 , 且多基
因参与了龙眼胚珠的败育过程。至今对龙眼焦核机理的研究尚未有较大进展 , 仍停留在形态解剖和生
理生化方面 , 研究的深度还远远不够。
本研究中应用蛋白质组学方法与技术 , 比较龙眼种子败育不同时期蛋白质组的变化 , 寻找和龙眼
种子败育紧密相关的差异蛋白 , 应用 MALD I/TOF /TOF2MS/MS质谱方法鉴定与分析 , 以期阐明其生
物学功能 , 并探索龙眼种子败育的分子机理 , 同时也为龙眼良种培育提供理论依据。
1　材料与方法
111　试验材料
试验于 2007—2008年进行 , 以白核龙眼 (D im dcarpus longana Lour. ‘Baihe’) 为供试材料 , 取自
福建省农业科学院果树研究所。
选用正常挂果果树 3株 , 于盛花期选择开花量较大、花穗健壮的单株挂牌 , 记录雌花开放期。根
据郑少泉等 (1996) 关于白核龙眼在花后约 36 d之前种子发育正常 , 之后 28 d, 胚体出现褐变坏死
的报道。因此分别于花后 26 d (Ⅰ期 )、36 d (Ⅱ期 )、46 d (Ⅲ期 )、56 d (Ⅳ期 ) 取幼果 , 冰上剥
离种子 , 于 - 80 ℃低温保存备用。
试验从材料的选取到双向电泳过程重复 3次。
112　蛋白质提取
TCA—丙酮沉淀法 : 取龙眼种子 1 g在液氮中研磨成粉末 , 将粉末悬浮于 10倍体积的 10%
TCA—丙酮溶液中 (含 0107% β -巯基乙醇 ) , - 20 ℃过夜沉降蛋白。随后 20 000 ×g 4 ℃离心 15
m in, 弃上清液。沉淀用预冷的丙酮溶液 (含 0107% β - 巯基乙醇 ) 清洗残留的 TCA, 重复操作 2
次。沉淀置于 - 20 ℃下冷冻干燥 , 使丙酮完全挥发。
酚抽法 : 参考 Carpentier等 (2005) 的方法。取龙眼种子 1 g在液氮中研磨成粉末 , 加入 4 mL提
取液 (100 mmol·L - 1 Tris, 50 mmol·L - 1抗坏血酸 , 100 mmol·L - 1 KCl, 50 mmol·L - 1硼砂 , 1%
Triton2100, 2%β -巯基乙醇 ) , 加入等体积的 Tris - 饱和酚 (pH 810) , 10 000 ×g 4 ℃离心 10 m in。
取酚层 , 加入 6倍体积的 011 mol·L - 1的乙酸胺甲醇溶液 , - 20 ℃过夜沉降蛋白。20 000 ×g 4 ℃离
心 20 m in, 弃上清。沉淀用预冷的甲醇溶液洗涤 1次 , 再用丙酮 (含 2% β - 巯基乙醇 ) 洗涤 2次。
沉淀置于 - 20 ℃下冷冻干燥 , 使丙酮完全挥发。
准确称取干燥后的干粉 20 mg, 溶解在 015 mL的样品裂解液 (7 mol·L - 1尿素 , 2 mol·L - 1硫
脲 , 4% CHAPS, 2%两性电解质 , pH 4～7, 01002%溴酚蓝 , 40 mmol·L - 1 DTT) 中 , 37 ℃温浴 2
h, 12 000 ×g 4 ℃离心 15 m in, 收集上清液备用。
蛋白定量参考 B radford (1975) 的方法。
113　双向电泳
第一向固相 pH梯度等电聚焦 ( IEF) : 仪器为 Amersham Ettan IPGphor。 IPG干胶条为 24 cm, pH
4～7 (线性 ) , 蛋白上样量为 112 mg, 水化液 ( 7 mol·L - 1尿素 , 2 mol·L - 1硫脲 , 2% CHAPS, 18
mmol·L - 1 DTT, 015% IPG Buffer, 痕量溴酚蓝 ) 与样品溶液终体积为 450μL。电泳参数设定 : 20 ℃,
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　12期 刘 　浩等 : ‘白核 ’龙眼种子败育不同时期差异蛋白分析 　
50μA·trip - 1 , 30 V (12 h) , 500 V (1 h) , 1 000 V (1 h) , 1 000～8 000 V梯度 (30 m in) , 8 000 V
(6 h)。
第二向 SDS2PAGE垂直板电泳 : 等电聚焦完成后胶条用平衡液 Ⅰ ( 50 mmol·L - 1 Tris2HCl, pH
818, 6 mol·L - 1尿素 , 30% 甘油 , 2% SDS, 10 DTT mg·mL - 1 , 痕量溴酚蓝 ) 和平衡液 Ⅱ ( 50
mmol·L - 1 Tris2HCl, pH 818, 6 mol·L - 1尿素 , 30% 甘油 , 2% SDS, 25 mg·mL - 1碘乙酰胺 , 痕量
溴酚蓝 ) 分别平衡 15 m in。配制浓度为 12%的聚丙烯酰胺凝胶 , 待胶凝固后 , 将胶条轻轻推入玻璃
板中 , 然后用 015%琼脂糖 (电极缓冲液配制 ) 封顶。开始电泳 (1 W , 待溴酚蓝前沿移动到凝胶上
加大电流 7 W ) , 直至溴酚蓝前沿跑至离胶底部 015～1 cm处 , 停止电泳。
凝胶染色 : 剥离凝胶 , 置于考马斯亮蓝溶液 ( 01025% 考马斯亮蓝 R2250, 40% 甲醇 , 7% 醋
酸 ) 中固定染色 2～4 h后 , 换脱色液 (7% 醋酸 , 5% 甲醇 ) 脱色 , 直至背景为无色透明 , 蛋白质
点清晰为止。
完成染色的双向电泳凝胶经过扫描保存图像。图像分析采用 ImageMaster 2D p latinum软件进行。
114　质谱鉴定及数据库检索
蛋白质胶内酶解 : 用细玻璃管把差异表达的蛋白点从凝胶上取出来放到 ependoff管中 , 加入
100μL 100 mmol·L - 1的 NH4 HCO3 , 振荡 5 m in, 离心、弃上清液。再加入 100μL 50%的乙腈
(ACN ) , 振荡 10 m in后离心 , 弃上清液。重复上述步骤 2次 , 真空干燥。加入 10μL 1215 ng·
μL - 1胰蛋白酶溶液 , 4 ℃下放置 45 m in。取出后在 37 ℃下作用 12～16 h。酶解产物的抽提 : 加入
20μL 100 mmol·L - 1的 NH4 HCO3 , 超声 10 m in。再加入 20μL 50%的 ACN和 011% TFA , 超声 10
m in后离心 , 取上清液 , 真空干燥。在干燥的样品中加入 10μL 011% TFA , 再用 10μL C18Zip
(M illpore) 脱盐 , 用于质谱鉴定。
质谱分析 : 质谱仪为 AB I公司 4700型 MALD I2TOF2TOF质谱仪 , 采用氮 : 氩激光。波长为 355
nm, 激发时间 3～7 ns, 频率为 200 Hz, 激光强度为 4 000, 加速电压为 20 kV , 使用正离子反射模
式 ; PMF质量扫描范围为 700～3 500 Da, 采用自动获得数据的模式采集数据。使用解释模式自动排
除胰蛋白酶自解峰、常见的角蛋白污染峰 , 选择强度最大的 5个峰作为母离子进行串联质谱分析 ; 母
离子质量分辨率设为 50 FWHM , 碰撞气体为空气 , 压力为 9e ×10 - 7 tor, 激光强度设为 5 100, 采用自
动获得数据的模式采集数据。
数据库检索 : 所得到的结果用 4700型 MALD I2TOF2TOF质谱仪配备的数据库工作站 GPS2MASCOT
进行数据库检索。数据库为 NCB Inr, 检索种属为 all, 数据库检索的方式为 combined, 最大允许漏切
位点为 1, 酶为胰蛋白酶 ; 质量误差范围设置 : PMF 100 ×10 - 6 , MS/MS为 012 Da。
2　结果与分析
211　不同蛋白质提取方法的 22D E图谱比较
比较两种方法提取的龙眼种子蛋白的 22DE图谱 (图 1 ) , 酚抽法的图谱背景清晰 , 蛋白点清
晰易辨 , 分离效果较理想。利用 ImageM aster 2D p latinum 软件进行点的检测和统计分析 , 酚抽法蛋
白点数为 947个 (图 1, A ) , TCA—丙酮方法提取的蛋白点数为 683个 (图 1, B )。
另外 , 由图 2可知 , 两种蛋白提取方法获得的 22DE图谱上显现蛋白点均主要分布在分子量
25～67 kD , pH 5～615之间 , 说明龙眼种子蛋白主要是一些微酸性、中等分子量的蛋白质类群。
在不同分子量 (M r) 和等电点 (p I) 分布范围上 , 两种方法提取的蛋白种类和含量也有明显
的差异 , 酚抽法在小分子量范围以及 pH 6～7之间有较多明显的蛋白点。
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　　综合分析 , 酚抽法更适合于龙眼种子进一步的蛋白质组学研究。
212　龙眼种子蛋白质的 22D E分析
采用窄范围 pH 4～7的线性 IPG干胶条对龙眼种子败育不同时期的蛋白质进行 IEF - SDS - PAGE
分离 , 应用 ImageMaster 2D p latinum软件对电泳图谱进行蛋白点的检测。在在花后 26 d (Ⅰ期 ) 22DE
图谱上共检测到分离的蛋白点 998个 , 在花后 36 d (Ⅱ期 ) 图谱上 957个 , 在花后 46 d (Ⅲ期 ) 图
谱上共 933个 , 在花后 56 d (Ⅳ期 ) 图谱上 964个。4个时期 22DE图谱匹配率分别为 7817% (Ⅰ期
与 Ⅱ期 ) ; 7614% (Ⅰ期与Ⅲ期 ) ; 7419% (Ⅰ期与 Ⅳ期 )。
通过蛋白定量分析 , 共发现差异表达量变化在 2倍以上的差异蛋白 21个 (图 3)。其中 9个 (蛋
白编号为 : 3, 4, 8, 10, 16, 17, 18, 19, 21) 上调表达 , 12个 (蛋白编号为 : 1, 2, 5, 6, 7,
9, 11, 12, 13, 14, 15, 20) 下调表达 (图 4)。
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213　龙眼种子败育相关差异蛋白的 M ALD I/TO F /TO F2M S /M S分析和数据库检索鉴定
对龙眼种子蛋白质双向电泳凝胶上 21个差异表达蛋白点进行 MALD I/TOF /TOF2MS/MS分析和数
据库检索鉴定 , 共鉴定得到 12个差异蛋白 (表 1)。
表 1　龙眼种子败育不同时期差异蛋白质的 M ALD I/TO F / TO F2M S /M S鉴定
Table 1　 Iden tif ica tion of d ifferen tia lly expressed prote in s dur ing the d ifferen t
stages in longan seed abortion by M ALD I/TO F /TO F2M S /M S
蛋白
编号
Spot
No.
蛋白名称
Protein name
登录号
Accession
No.
理论分子量 /
等电点
Measured M r
( kD) /p I
试验分子量 /
等电点
Exp remental M r
( kD) /p I
匹配的
肽段
Matched
Pep tides
蛋白得分 3
Protein
score3 物种Species
2 RuB isCO大亚基结合蛋白α亚基
RuB isCO large subunit2binding p rotein
subunit alpha, chlorop last p recursor (60 kD
chaperonin subunit alpha) (CPN260 alpha) gi | 1351030 5716 /4184 6117 /4178 20 243 B rassica napus
3 抗坏血酸过氧化物酶 A scorbate peroxidase gi | 2997688 2714 /5131 2712 /5104 7 68 Zantedeschia
aeth iopica
4 胞质抗坏血酸过氧化物酶
Cytosolic ascorbate peroxidase
gi | 62910196 2714 /5178 2713 /5117 5 80 Capsicum
annuum
7 Dessication2related p rotein, putative gi | 21593191 3413 /8177 3119 /6120 7 132 A rabidopsis
thaliana
8 胞质苹果酸脱氢酶
Cytosolic malate dehydrogenase
gi | 42521311 3515 / 6132 3211 /6101 8 188 Glycine m ax
10 半胱氨酸蛋白酶
Cysteine p rotease
gi | 58531896 4015 /5163 4418 /6130 10 77 N icotiana
tabacum
11 丙酮酸脱氢酶
D ihydrolipoam ide adetyltransferase
gi | 11994364 5916 /7154 5413 /6134 17 217 A rabidopsis
thaliana
14 17kD热激蛋白
17kD heat shock p rotein
gi | 1552553 1719 / 7174 1615 /5113 10 78 M edicago
sativa
15 磷酸甘油酸变位酶
2, 32bisphosphoglycerate2independent
phosphoglycerate mutase
( Phosphoglyceromutase)
gi | 3914394 6111 /5139 6413 /5184 14 271 M esem bryan2
them um
crysta llinum
16 未知蛋白 O so5g0553000 gi | 115465323 5818 /5195 3912 /5152 13 71 O ryza sativa
19 未知蛋白 O s07g0552800 gi | 115472695 9717 /8194 5413 /5125 14 68 O ryza sativa
20 RuB isCO大亚基结合蛋白β亚基
RuB isCO large subunit2binding p rotein
subunit beta, chlorop last p recursor (60 kD
chaperonin subunit beta) (CPN260 bate) gi | 2506277 6219 /5185 6113 /5102 21 331 Pisum sativum
　　3 通过 Mascot的算法得到的蛋白得分 , 得分达到 66认为这个蛋白质鉴定成功。3 Mascot p rotein score ( based on combined MS and MS/MS) of greater than 66 were considered statistically significant1
鉴定得到的 12个蛋白中与代谢相关的蛋白有胞质苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸甘油酸变
位酶 ; 具有分子伴侣功能的蛋白有 17 kD热激蛋白和 RuB isCO大亚基结合蛋白α、β亚基 ; 与抗氧化
相关的蛋白有抗坏血酸过氧化物酶和胞质抗坏血酸过氧化物酶 ; 与细胞凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶 ;
以及推断的 Dessication2related p rotein和两个未知蛋白。
3　讨论
龙眼属于顽拗植物 , 种子中富含酚和醌类等次生代谢物质 (陈伟 等 , 2001) , 如果样品处理不
当 , 这些物质会严重干扰蛋白质等电聚焦。
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　　TCA—丙酮法最早用于小麦蛋白的提取 (Damerval et al. , 1986) , 是目前植物蛋白提取常用方法
之一 , 虽然该方法可以去除色素等物质的干扰 , 但也会导致一些膜蛋白和疏水性蛋白的丢失 , 且可能
发生蛋白质的降解和修饰而影响蛋白质的鉴定 (王玉琪和彭新湘 , 2006)。酚抽法则被认为适宜于干
扰物质较多的植物样品的蛋白质提取。
本研究中比较了两种提取方法的 22DE图谱效果 , 发现 TCA—丙酮沉淀法检测到的蛋白明显的少
于酚抽法 , 尤其是小分子量蛋白 , 这可能是由于 TCA—丙酮法沉淀蛋白不完全 , 且提取的蛋白再溶
解比较困难 , 导致了更多的蛋白丢失。因此 , 酚抽法提取的蛋白质样品制备质量更好 , 电泳分辨率也
更高。该结果与刘伟霞和潘映红 (2006) 对小麦叶片蛋白质组的样品制备方法上的研究结果一致。
种子败育是内外环境因子引起某些基因的表达变化或者突变的结果 (M iyajima, 2006)。蛋白质是
基因表达的产物 , 因此龙眼种子败育过程中差异表达的蛋白质可能与种子败育有密切的相关。
本研究中鉴定到的差异蛋白胞质苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和磷酸甘油酸变位酶在正常龙眼种
子中 (Ⅰ期 ) 都处于相对高的水平 , 而随着种子败育的进行 , 胞质苹果酸脱氢酶持续下调表达 , 丙
酮酸脱氢酶和磷酸甘油酸变位酶分别在 Ⅳ期和 Ⅱ期明显下调表达 (图 4)。这 3种蛋白的下调表达 ,
将影响龙眼种子有氧呼吸过程中正常的物质和能量代谢 , 因此认为这一结果和龙眼种子的败育有一定
关系。
有证据表明抑制 sHS P基因的表达 , 会导致胚胎败育 (W ehmeyer & V ieding, 2000)。此外 , sHSPs
还具有抑制细胞凋亡、促进细胞骨架形成等功能 (L i et al. , 1999; Low et al. , 2000)。RuB isCO大亚
基结合蛋白 α、β亚基 ( CPN260) 除了有蛋白折叠和保护功能外 , 还可以作为细胞内信号分子 ,
CPN 260基因的突变可能导致细胞死亡 ( Ishikawa et al. , 2003)。在种子败育的不同时期 , HSP17表达
大大下降 , 在第 Ⅳ期基本消失 ; 同时 CPN 260也持续下调表达 , 可能影响了龙眼种子中某些蛋白的正
确装配 , 以及一些蛋白的聚集或者降解 , 而影响到龙眼种子的正常发育。
龙眼种子败育过程中 , 细胞内会积累大量活性氧 (ROS)。为响应 ROS的积累 , 龙眼种子抗坏血
酸过氧化物酶和胞质抗坏血酸过氧化物酶在种子败育不同时期显著上调表达 , 表达量变化分别增加了
6倍和 5倍以上。APX这种上调表达可能是龙眼败育种子响应 ROS积累而清除 ROS的一种应激反应
和对氧化胁迫的调控机制。
半胱氨酸蛋白酶作为一类重要的蛋白酶家族 , 广泛参与植物的各种生理过程。逆境条件下负责受
损或变性蛋白的降解 , 为新蛋白的合成提供肽段或游离的氨基酸 , 在植物自然衰老和胁迫诱导的衰老
过程中 , 均有半胱氨酸蛋白酶的参与 (Beers et al. , 2000)。Northern B lot分析在细胞衰老和细胞凋亡
的过程中 , 半胱氨酸蛋白酶表达增强 (Ueda et al. , 2000)。在我们的研究中 , 半胱氨酸蛋白酶在种
子败育的前期 (Ⅱ、Ⅲ期 ) 上调表达 , 而在种子败育的后期 (Ⅳ期 , 焦核开始形成 ) 开始下调表达
(图 4)。故推测半胱氨酸蛋白酶在种子败育前期上调表达可能参与了龙眼败育种子早期细胞凋亡过
程 , 从而导致龙眼种子从正常发育走向败育过程 , 其具体功能还有待进一步的验证。
综上所述 , 本研究鉴定出龙眼种子败育不同时期的 12个差异蛋白质 , 这些蛋白质分别参与种子
物质和能量代谢、自由基清除和抗氧化作用、分子伴侣、细胞凋亡等生理过程。分析表明这些蛋白的
差异表达可能与龙眼种子的败育有关。本研究结果对揭示龙眼种子败育的分子机制提供了有价值的信
息资料 , 也为今后研究龙眼种子败育的分子调控奠定了试验基础。
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