全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2011 38 8 1579 1588 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–10–18；修回日期：2011–07–14
基金项目：国家自然科学基金—广东省自然科学基金联合项目（u0731006）；广东省植物发育工程重点实验室开放基金项目（200801）；
广东省自然科学基金项目（10451063101005250）
金钗石斛SEP3-like基因的克隆及其在春化过程
中的表达分析
陈敏燕，郭无瑕，刘小如，李洪清，梁 山*
（广东省植物发育工程重点实验室，华南师范大学生命科学学院，广州 510631）
摘 要：通过同源克隆从低温春化处理的金钗石斛腋芽中分离到 1 个 SEP3-like 基因的全长 cDNA。
该 cDNA 含有长度为 684 bp 的开放阅读框，可编码由 227 个氨基酸组成的蛋白质。同源搜索和系统进化
分析表明，该蛋白与拟南芥 AtSEP3 同源，并同属于 MADS-BOX 家族的 SEP 亚家族中的 SEP3 分支，故
将该基因暂定名为 DnSEP3-like。与其它的石斛属的 SEP3 蛋白类似，DnSEP3-like 蛋白缺失 C–末端的部
分基序。DnSEP3-like 基因的表达受春化作用的影响，其转录产物随春化时间延长逐渐积累，在春化 20 d
时达到峰值，暗示该基因可能参与春化调控开花的生物学过程。
关键词：金钗石斛；SEP3；春化作用
中图分类号：S 682.1+9 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）08-1579-10

A SEP3-like Gene in Dendrobium nobile（DnSEP3-like）：Cloning，
Characterization and Vernalization-induced Transcription Patterns
CHEN Min-yan，GUO Wu-xia，LIU Xiao-ru，LI Hong-qing，and LIANG Shan*
（Guangdong Key Lab of Biotechnology for Plant Development，College of Life Science，South China Normal University，
Guangzhou 510631，China）
Abstract：Vernalization is required for floral transition in Dendrobium nobile. From the axillaries of
vernalized D. nobile，a full-length cDNA that predictably encode a peptide in length of 227AA was
identified in this study. BlastX searching indicates it is similar to AtSEP3 and the following phylogenetic
analysis indicates both of them belong to the SEP3 clade in SEP subfamily. Thus，this protein was named
DnSEP3-like. DnSEP3-like protein lacks a certain motif in C-region，which is similar to some other SEP3
proteins in Dendrobium species. Expression of DnSEP3-like gene is up-regulated with the extending of
vernalizaiton，suggesting that it would function in vernalization-induced floral transition.
Key words：Dendrobium nobile；SEP3；vernalization

许多植物需要经历一段时间的低温，即春化作用，才能实现从营养生长到生殖生长的转变。在
双子叶植物拟南芥中，春化作用通过 4 条主要的途径控制成花转变，包括 FLC 途径、AGL24 途径、
AGL19 途径和 MAF2 途径（Alexandre & Hennig，2008；Kim et al.，2009）。而在单子叶植物，如小

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liangsh@scnu.edu.cn）
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麦和大麦，VRN1 途径是目前已经确证的控制开花时间的方式（Kim et al.，2009）。在这些低温控制
开花的调控途径中，主要的组分 FLC、AGL19、AGL24 和小麦 VRN1 都属于 MADS-BOX 蛋白，其
典型的蛋白结构特征是在 N–端有一个保守的 MADS-BOX 结构域，负责这类转录因子与 DNA 的结
合以及蛋白质复合体的形成。
SEP 类基因构成植物 MADS-BOX 基因家族的一个亚家族（Becker & Theissen，2003），该亚家
族成员编码一类 TypeⅡ MADS-BOX 蛋白，包括 SEP1、SEP2、SEP3 和 SEP4 蛋白。典型的 SEP
蛋白除包含保守的 MADS-BOX 结构域外，还包含一个 K-BOX 结构域，位于两者之间的Ⅰ区域以及
C–端的 C–区。Ⅰ区和 K-BOX 域参与蛋白质的多聚化；C-区在不同的 MADS-BOX 蛋白间保守性
较低，可能参与调节靶基因转录活性和复合体的形成等（Egea-Cortimes et al.，1999；de Folter &
Angenent，2006）。SEP 蛋白往往还包含不同的 SEPⅠ或 SEPⅡ基序（Kanno et al.，2006）。SEP 蛋
白参与花器官发育和形成，为花瓣、雄蕊和心皮发育所必需（Pelaz et al.，2000）。另有研究表明，
拟南芥 SEP3 蛋白可能还参与植物的成花诱导过程（Immink & Richard，2009）。然而尚无 SEP 基因
参与春化控制开花的报道。
金钗石斛为单子叶植物，属兰科石斛属，是中医中常见的药用植物，同时也是花卉市场上的热
销兰花品种。自然生长的金钗石斛需要几年时间的营养生长，并经过冬季低温后，在 3—5 月开花。
为了缩短其生长周期，尤其是适应花卉市场的应节需要，生产上往往在 9—10 月人工低温处理 35 ~
40 d 左右，刺激其提前在次年的 1—2 月开花。然而低温诱导金钗石斛提前开花的分子机制是什么，
目前尚一无所知。本研究中以金钗石斛为研究材料，利用同源克隆策略，从金钗石斛腋芽中分离到
SEP3 类的 MADS-BOX 蛋白基因，以期为后续研究金钗石斛开花时间控制的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
金钗石斛由华南师范大学叶庆生教授提供。盆栽金钗石斛培养于温室中，于自然条件下生长。
2009 年 10 月，挑选已经封顶的金钗石斛转移至可控温的培养室中进行低温处理。利用自然光照，
控制日夜温度分别为 15 和 10 ℃进行春化处理。收集低温处理 0、5、10、20 和 30 d 后的金钗石斛
腋芽，立即用液氮冰冻，然后转移于–80 ℃冰箱中长期保存。
1.2 RNA提取和逆转录
利用Fu等（2004）的方法提取金钗石斛花芽总RNA。以总RNA为模板，通过SMARTTM技术
（Clontech）和MMLV逆转录酶（TaKaRa）逆转录获得cDNA第 1 链。理论上，逆转录产物中含有较
高比例的全长cDNA，并且在每个cDNA的 5′端和 3′端具有特定接头序列CDⅢ和SMART ⅣTM
Oligonucleotide，有利于设计引物以分离基因。
1.3 金钗石斛SEP3 基因MADS-BOX区域的克隆
在 GenBank 上查询获得多个蝴蝶兰、石斛兰和水稻、拟南芥的 MADS-BOX 基因序列。经过比
较表明，兰科植物的 MADS-BOX 基因与水稻比较接近。下载兰科植物和水稻等的 MADS-BOX 蛋
白序列，进行序列比对。根据比对结果设计了 6 条简并引物，构成了 3 对巢式引物对，通过巢式 PCR
分离金钗石斛的 MADS-BOX 基因的 MADS-BOX 结构域的部分序列。引物的序列和结合位点见表 1
和图 1。所得 PCR 产物克隆到 T–载体后送华大公司测序。

8 期 陈敏燕等：金钗石斛 SEP3-like 基因的克隆及其在春化过程中的表达分析 1581
表 1 使用的引物和序列
Table 1 Primer sequences used in this study
引物名称 Primer 序列（5′→3′） Sequence 长度/mer Length
MADS-6 ATGGGRAGRGGRAAGATKGARHTNAA 26
MADS-7 AARATHAAYMGNCARGTNAC 20
MADS-8 GGBYTNYTNAARAARGC 17
MADS-R1 TCNARYTGRTCNARYTCYTT 20
MADS-R2 WRTCNARRTCYTCNCC 16
MADS-R3 CAYTTYTGRTANCKYTC 17
3′RACE GSP1 ACGAACTTTCCGTCCTCT 18
3′RACE GSP2 AGCCGAAGTATGTTGAAGAC 20
5′RACE GSP1 CTCCAAAGGGTGGTAGAAGT 20
5′RACE GSP2 CTCCTCCAATCTTGTCCTCA 20
CDⅢ/3′PCR primer* ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N–1N
（N = A，G，C or T；N–1 = A，G or C）
59
SMART ⅣTM Oligonucleotide* AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG 39
5′PCR primer* AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 23
AGL9 FW ACGAACTTTCCGTCCTCT 18
AGL9 RE AATCATCCACTCTAAAAACTTGA 23
AGL9-qF ACATCTCTAGGTGGAAGTTAAG 22
AGL9-qR GTTGTTGTTCAAATCATCCACT 22
18S-F GGTTCGCTGCTCGTGACTCT 20
18S-R CAGGCACCGCTTATTTTTACA 21
注：含*标记的引物根据 CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit User Manual（PT3577-1）提供的序列信息合成（广州英骏）。
Note：* These primers were synthesized following the instruction of the CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit（Clontech）.

1.4 SEP3 基因的全长cDNA序列的扩增
根据 1.3 所得的 MADS-BOX 序列设计基因特异引物，以金钗石斛花芽 cDNA 为模板，采用 3′
和 5′RACE 策略，进行两轮巢式 PCR 反应，分离 MADS-BOX 基因的 cDNA 全长并测序。3′RACE
基因特异引物与逆转录产物 3′端接头的引物（CDⅢ/3′PCR primer）构成引物对，而 5′RACE 基因特
异引物与 5′端接头引物（5′PCR primer）构成引物对（表 1）。为验证 SEP3 转录产物，另设计了 1
对引物（AGL9 FW/AGL9 RE）用于通过 PCR 扩增全长 cDNA。
1.5 定量PCR检测低温处理花芽中的SEP3-like基因的表达
以低温处理的金钗石斛花芽 cDNA为模板，使用金钗石斛SEP3-like基因的特异引物对AGL9-qF/
AGL9-qR（表 1）进行定量PCR反应。18S rRNA基因作为内标基因同时进行定量PCR反应。每 20 μL
的反应体系包含由 5 ~ 7.5 μg总RNA逆转录而得的cDNA，10 μL SYBR Green Premixture（TaKaRa）
and 0.4 μL Rox（TaKaRa）以及 250 nmol · L-1的基因特异引物。PCR反应程序为：95 ℃预变性 30 s，
然后进行 40 循环的 95 ℃，5 s；62 ℃，31 s。为获得较为准确的结果，设置了技术性重复和生物学
重复，即每个PCR反应进行 3 次重复，每个处理也使用 3 个不同批次提取的总RNA样品。当所有定
量PCR反应结束后，使用ABI PRISM1 7300（Applied Biosystems）自带的SDS1.3.0 软件对所有反应
板获得的数据进行合并分析。
1.6 序列分析
通过 ORF Finder 预测分离所得金钗石斛 SEP3-like 全长 cDNA 开放阅读框，并通过 BlastP 和
BlastX 搜索同源蛋白。系统进化分析所使用的序列从 Phytozome v5.0（http：//www.phytozome.net/）

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和 NCBI（http：//www.ncbi.nih.gov）下载。使用 MEGA3.0 进行序列比对和系统进化树构建。
2 结果与分析
2.1 金钗石斛DnSEP3-like基因全长cDNA的克隆
首先利用简并引物（图 1），以金钗石斛腋芽总 RNA 逆转录产物为模板，通过巢式 PCR 的 3 轮
反应（第 1 轮采用 MADS6/MADS-R1 引物对，第 2 轮采用 MADS7/MADS-R2 引物对，第 3 轮采用
MADS8/MADS-R3 引物对）扩增了 MADS-BOX 基因的 MADS-BOX 序列，经克隆测序获得长度约
为 140 bp 的片段（图 2，A）。BlastX 同源搜索表明该片段编码 MADS-BOX 的部分序列。



图 1 简并引物的结合位点示意图
箭头表示引物的结合位点和方向。
Fig. 1 Binding sites of the degenerate primers
The arrows indicate the position and orientation of the primers.

根据这一 MADS-BOX 片段设计了基因特异引物，并通过 RACE 扩增 MADS-BOX 基因全长序
列。3′RACE 扩增获得两条长度分别介于 600 ~ 700 bp 和 500 ~ 600 bp 的 3′末端片段（图 2，B）。较
短片段在后面的验证试验中未获得证实，因此本研究中只考虑较长的片段。将该片段克隆测序，所
得序列与 MADS-BOX 部分序列有约 50 bp 的重叠。两序列拼接获得包括了 3′末端的 cDNA 片段。
根据这一序列设计 5′RACE 的基因特异引物，通过两轮 5′RACE 扩增获得 1 条 600 ~ 700 bp 的 5′末
端片段（图 2，C）。经克隆测序表明，该片段可与 3′RACE 产物拼接得到 905 bp 的 cDNA 序列[不
包括 3′端的 Poly（A）尾]。BlastX 搜索表明该序列编码的蛋白序列与已知的拟南芥 SEP3 同源，氨
基酸序列一致性为 65%，因此将其命名为 DnSEP3-like，其中 Dn 代表金钗石斛（Dendrobium nobile）。
为验证上述结果，根据拼接后的 DnSEP3-like 序列重新设计引物，通过 RT-PCR 扩增包括完整 ORF
的 cDNA 片段。结果证明，在金钗石斛腋芽总 RNA 中确实存在 DnSEP3-like 的转录本（图 2，D）。
8 期 陈敏燕等：金钗石斛 SEP3-like 基因的克隆及其在春化过程中的表达分析 1583
图 2 金钗石斛 DnSEP3-like 全长 cDNA 的分离
A：利用简并引物扩增 MADS-BOX 保守区域；B： DnSEP3-like cDNA 3′末端的扩增，1、2 分别示巢式 PCR
的第 1、2 轮反应；C：DnSEP3-like cDNA5′末端的扩增，1、2 分别示巢式 PCR 的第 1、2 轮反应；
D：DnSEP3-like 转录本的 PCR 验证。箭头指示回收测序的目标条带。
Fig. 2 Isolating the full-length DnSEP3-like cDNA from Dendrobium nobile
A. Amplification of the MADS-BOX region using the degenerate primers；B. 3′RACE for the DnSEP3-like；
C. 5′RACE for the DnSEP3-like；D. Amplification of the full-length DnSEP3-like cDNA by PCR.
The arrows indicate the target bands.
2.2 DnSEP3-like基因序列分析
理论上，通过SMARTTM技术（Clontech）可以合成全长cDNA，但是实际操作中往往仅有少量
的mRNA可以通过逆转录获得全长cDNA。本研究中获得的DnSEP3-like cDNA全长 905 bp[包括
poly(A)序列时，长度为 935 bp]，包括部分 5′UTR区、完整的ORF和 3′UTR区（图 3）。



















图 3 推测的 DnSEP3-like 蛋白的结构特征
框内序列分别为 5′UTR 和 3′UTR 区。下划线标记翻译起始密码和终止密码。
阴影部分表示 poly(A)所在位置。
Fig. 3 The deduced amino acid sequence of DnSEP3-like protein
5′UTR and 3′UTR regions are framed. Initiation codon and stop codon are underlined.
The poly(A) tail is shown in shadow.

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其中 ORF 长 684 bp，编码 1 条含 227 个氨基酸残基的多肽链，含 1 个 MADS-BOX 域和 1 个
K-BOX 域，为典型的 TypeⅡ MADS-BOX 蛋白。5′UTR 区长 24 bp，可能并不完整，需要进一步试
验确定。3′UTR 区长 197 bp，在 mRNA 中，还包括一段 poly(A)尾。
与水稻、拟南芥和小麦的 SEP3 蛋白不同，金钗石斛 DnSEP3-like 蛋白的 C–端只含有 1 个 SEPⅠ
基序，而缺乏 SEPⅡ基序（图 4）。石斛属的其它 SEP3 蛋白的 C–端也出现类似缺失，但具有种间
差异，如 DcSEP1（木石斛 Dendrobium crumenatum，AAZ95252.1）含有 SEPⅠ基序和部分 SEPⅡ基
序（图 4），而 DOMADS1（石斛兰 Dendrobium grex Madame Thong_In，AAF13260.1）则同时缺失
两个基序（Zahn et al.，2005）。石斛属植物 SEP3 蛋白 C–端基序的缺失及其缺失模式暗示 SEP3 蛋
白在石斛属中特异的功能分化。

















图 4 三个石斛属物种的 SEP3 蛋白与其它物种 SEP3 的比对
Fig. 4 Alignment of SEP3 proteins from Dendrobium genius and other organism

2.3 DnSEP3-like蛋白的系统进化分析
为进一步确定 DnSEP3-like 蛋白与其它物种相似蛋白的同源性并分析这些蛋白质之间的进化关
系，以 DnSEP3-like 和 AtSEP3 为查询条件从 Phytozome v5.0 和 NCBI 搜索并下载了同源序列，并用
MEGA3.0 进行序列比对和 NJ 树构建（图 5）。
结果表明，相对于拟南芥 AtSEP1、2、4 而言，DnSEP3-like 与拟南芥 AtSEP3 距离最近，与其
它物种的 SEP3 蛋白构成一枝并与 SEP1/2 和 SEP4 分离。SEP3 分枝中，单子叶植物和双子叶植物的
SEP3 蛋白各自聚集；两个石斛属物种（兰科，单子叶植物）的 SEP3 虽与双子叶植物 SEP3 蛋白聚
集，但独立于双子叶植物的亚枝之外，处于单子叶和双子叶植物之间。
2.4 DnSEP3 基因在金钗石斛花芽中的低温诱导表达模式
金钗石斛需要春化作用诱导开花。通过定量 PCR 检测了金钗石斛侧芽中 DnSEP3-like 基因的转
录在春化处理过程中的变化。
8 期 陈敏燕等：金钗石斛 SEP3-like 基因的克隆及其在春化过程中的表达分析 1585
结果表明，低温处理前期，DnSEP3-like 基因的转录变化较小，只有少量的增强；处理 10 d 后，
DnSEP3-like 基因的转录增强，为未处理状态的 1.46 倍；当低温处理延续至 20 d 时，DnSEP3-like
基因的转录急剧增强，是未处理状态的 3.88 倍；其后，春化时间继续延长至 30 d 后，其转录水平
有所下调，恢复到未处理状态的水平（图 6）。DnSEP3-like 转录在春化过程中的变化可能与其在开
花控制的不同阶段的功能有关。DnSEP3-like 基因在叶片中也有表达，但是相对于腋芽而言，DnSEP3-
like 基因的转录水平很低（图 6）。



图 5 SEP 蛋白的系统进化分析
紧接在物种名后的为蛋白在 GenBank 或 Phytoaome v5.0 上的登记号。
Fig. 5 Phylogenetic analysis of SEP proteins
The accession No. in GenBank or Phytozome v5.0 is next to the scientific names of the organism.

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图 6 DnSEP3-like 基因在春化过程中的表达变化
18S rRNA 基因作为内标基因。相对表达水平为相对于对照的表达变化的倍数。
Fig. 6 Time-course expression of DnSEP3-like during vernalization process
The 18S rRNA gene was used as endogenous control. Expression level of DnSEP3-like gene at each time point during
vernalization or in un-vernalized leaf tissue was calibrated by that in un-vernalized bud.

3 讨论
3.1 DnSEP3-like基因编码SEP3 类MADS-BOX蛋白
ABC 模型认为，植物花器官结构的决定和发育由 A、B、C 等类型的蛋白质负责（Bowman et al.，
1991；Coen & Meyerowitz，1991；Meyerowitz et al.，1991；Weigel & Meyerowitz，1994）。Causier 等
（2010）研究发现，除了这 A、B、C 类蛋白质外，D 类和 E 类蛋白也参与花器官的发育。SEP3 蛋
白属于 E 类（E-class）蛋白，可以与其它的蛋白质（如 B、C 类蛋白）构成复合体影响花器官的形
成（Pelaz et al.，2000；Liu et al.，2009；Bemer & Angenent，2010）。SEP3 蛋白含有典型的 MADS-BOX
蛋白的结构特征，包括位于 N–端的 MADS-BOX 和相对靠近 C–端的 K-BOX 结构域。MADS-BOX
结构域负责蛋白质与 DNA 的结合，而 K-BOX 负责蛋白质与蛋白质之间的相互作用。位于
MADS-BOX 和 K-BOX 之间的区域可能与蛋白质的二聚化有关（Egea-Cortimes et al.，1999；
Shchennikova et al.，2004；de Folter & Angenent，2006）。多数 SEP3 蛋白的 C–端具有一些保守基
序，包括 SEPⅠ和 SEPⅡ基序，这些基序可能参与转录激活或高阶复合体（high order complex）的
形成（Malcomber & Kellogg，2005；Zahn et al.，2005）。
在本研究中通过同源克隆分离到 1 个 SEP 类蛋白的全长 cDNA。系统进化分析和蛋白结构分析
均表明这个 cDNA 编码 SEP3 类蛋白，因此暂时命名为 DnSEP3-like（GenBank 登录号：HQ388352）。
与其它物种的 SEP3 蛋白相比，推测的 DnSEP3-like 蛋白的 C–端只含有 SEPⅠ基序，而缺乏 SEPⅡ
基序。具有类似 C–端结构特征的 SEP3 蛋白还有 LpMADS6（Lolium perenne）、DcSEP1（Dendrobium
crumenatum）、DOMADS1（Dendrobium grex Madame Thong_In）、AOMADS3（Asparagus officinalis）
和 AVMADS3（Asparagus virgatus）（Kanno et al.，2006）。MADS-BOX 蛋白 C–端的被认为与转录
激活、高阶蛋白质复合体的形成、DNA 特异性识别、亚细胞定位和相互作用伙伴的吸引等有关
（Vandenbussche et al.，2003）。因此，SEP3 C–端基序的缺失可能造成转录激活功能的下降或缺陷。
另外，SEP 蛋白 C–端基序的多样性表明了进化中 SEP 蛋白功能的多样化（Malcomber & Kellogg，
2005），其中高度保守的 SEPⅠ基序可能是代表祖先基序的功能，而其它的基序则承担祖先基序的部
分功能或产生新的功能。本研究中比较了 3 个石斛属物种的 SEP3 蛋白的 C–端，发现它们分别有
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不同类型的基序缺失模式并且使石斛属物种的 SEP3 蛋白与其它物种分离开来。广泛调查这些缺失
在石斛属植物中的模式和研究这种缺失对 SEP3 蛋白的功能的影响是非常有趣的课题。
3.2 DnSEP3-like基因的表达受到春化作用的影响
DnSEP3-like 基因在低温处理前后的金钗石斛腋芽中均有表达。随着春化处理的时间延长，
DnSEP3-like 基因在腋芽中的转录逐渐增强，在春化处理 20 d 后达到高峰，表明春化作用影响
DnSEP3-like 基因的表达。这一结果是我们目前能了解到的 SEP3 类基因在春化过程中的表达变化的
首次报道。这个结果为 SEP3 类基因与春化联系起来提供了线索。一般认为，SEP3 基因作为 E 基因
参与花器官结构的形成和发育。然而最近的一些研究表明，SEP3 蛋白可能也参与开花时间控制。比
如，有假说认为，AtSEP3 可能通过与开花促进因子 OC1 和 AGL24 发生蛋白质—蛋白质或蛋白质—
靶基因之间的相互作用而对成花转变过程进行负控制（de Folter et al.，2005；Kaufmann et al.，2009）。
然而，目前为止，没有研究报道春化调控开花的过程中有 SEP3 类基因的参与。SEP3 除了与控制成
花转变的成分发生联系外，还可能在同一种复合体中结合花发育控制的成分，因此有假说认为 SEP3
在这种同时结合了成花转变和花器官发育调控成分的复合体中承担了正、负控制两种功能（de Folter
et al. 2005）。在我们的前期研究中，通过分析春化过程中表达的基因的 EST 数据，发现金钗石斛春
化 20 ~ 30 d 时，与花发育相关的基因表达显著富集，表明该阶段可能为成花诱导至花器官发育的转
折期。如果 de Folter 的假说（de Folter et al.，2005）为真，可以猜想，DnSEP3 在春化过程中的转
录变化，尤其是春化 20 d 后的高表达，可能与成花转变有关蛋白的抑制和后续促进花器官决定有关。
但是以上假说需要更多的直接的试验证据来证实或证伪。

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