全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（7）：1251–1258 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–02–20；修回日期：2011–05–21
基金项目：国家自然科学基金项目（30872039）；北京市自然科学基金项目（6082004）；北京市科技新星计划项目（2007B031）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：qinling@bac.edu.cn）
板栗赤霉素缺陷型短雄花序芽变的初步鉴定及
CmGID1 基因的表达分析
李兴亮 1，郭献平 1,3，沈元月 1，曹庆芹 2，冯永庆 1，秦 岭 1,*
（1 农业应用新技术北京市重点实验室，北京农学院植物科学技术学院，北京 102206；2 北京农学院生物技术系，
北京 102206；3新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052）
摘 要：利用赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯利和吲哚乙酸分别涂抹板栗短雄花序，结果显示
仅赤霉素能够抑制短雄花序顶端的细胞程序性死亡，并在一定程度上恢复短雄花序的伸长生长。通过
RT-PCR 扩增方法，从板栗短雄花序芽变和正常雄花序 cDNA 中克隆出赤霉素受体基因 GID1 部分序列。
测序及序列分析结果表明：克隆的 cDNA 片段为 786 bp，所推导的氨基酸序列与杨毛果 GID1 氨基酸序列
有 91%的同源性，与陆地棉、蓖麻 GID1 均有 85%的氨基酸序列同源性。经氨基酸序列功能分析，推测该
GID1 序列是板栗有编码功能的赤霉素受体基因，命名为 CmGID1（GenBank 登录号为 HQ651231）。实时
荧光定量 PCR 结果显示，从花序萌发至花药萌发前期，除其中一个时期（5 月 23 日）外，芽变短雄花序
CmGID1 的表达量均高于正常雄花序；在花序的快速生长期，芽变短雄花序 CmGID1 表达量显著高于正
常雄花序（P < 0.01）；且赤霉素处理后恢复生长的短雄花序 CmGID1 表达量显著降低（P < 0.01）。综合
试验结果，初步揭示了该短雄花序为一个赤霉素缺陷型突变体。
关键词：板栗；短雄花序；GID1；GA 缺陷型突变体；实时定量 PCR
中图分类号：S 664.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）07-1251-08

Preliminary Identification of GAs-deficient Short Male Catkin Mutant and
Expression Analysis of CmGID1 in Castanea mollissima
LI Xing-liang1，GUO Xian-ping1,3，SHEN Yuan-yue1，CAO Qing-qin2，FENG Yong-qing1，and QIN Ling1,*
（1Key Laboratory of New Technology in Agriculture Applicaion of Beijing，College of Plant Science and Technology，
Beijing 102206，China；2College of Biotechnology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；3College
of Forestry and Horticulture，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）
Abstract：GAs，CTK，ABA，Ethephon and IAA were used separately in feeding experiments，the
result showed only the application of GAs can inhibit programmed cell death（PCD）in the top of
short-male catkin and recover elongation growth to some extent. On the other hand，the partial cDNA
sequnences encoding gibberellins receptor GID1 was isolated from the normal and mutant catkin of the
Castanea mollissima by reverse transcription polymerse chain reaction（RT-PCR）. The results showed that
the GID1 partial cDNA is 786 bp，putative amino acids have 91% similarity with GID1 in Populus
trichocarpa and 85% in Ricinus communis and Gossypium hirsutum. According to the function analysis of

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putative animal acid sequnence，the GID1 is a functional GAs receptor gene in Castanea mollissima，and
named CmGID1（accession numbers HQ651231）. Real-time PCR indicated that from primordia formation
phase to early germina-tion of anther，the expressions of CmGID1 gene in mutant catkins are higher than
that in normal catkins except the phase of May 23. Moreover，in the fast-growing phase，the expression
of CmGID1 gene in mutant catkins are significantly higher than that in normal catkins（P < 0.01），while in
growth recovered short male catkin treated after GAs，the expression of CmGID1 gene significantly
decreased（P < 0.01）. In conclusion，it was preliminarily revealed that the short-catkin chestnut bud
mutation is a GAs-deficient mutant.
Key words：Castanea mollissima；short male catkin；GID1；GAs-deficient mutant；Real-time
quantitative PCR

板栗（Castanea mollissima Blume）雄花序为圆柱状葇荑花序，正常的雄、雌单花比例为 2 400 ~
4 000︰1，雄花量极大，消耗树体贮存营养的 20% ~ 40%，是造成板栗低产的重要原因之一（封志强
等，1995；Liu et al.，1999；王永宏 等，2001）。有报道称，在花序发育早期除去 90% ~ 95%的雄
花序可使板栗产量提高 47%，并使成熟期提前 7 ~ 15 d（封志强 等，1995；Zhao & Liu，2009）。因
此，选育雌花多，雄花数量少，雄花序退化或早期脱落的丰产优质品种是板栗育种的一个重要方向。
作者所在课题组在北京市密云县板栗产区发现 1 株雄花序短缩的变异类型‘短花云丰’（新品种保护
权：20090015），主要表现为雄花序短小，平均长度 2.2 cm，只有一般板栗雄花序长度的 1/6 ~ 1/8。
其雄花序在生长发育进程中顶端发生细胞程序性死亡（张婧 等，2007），由变黄到弯曲至脱落死亡，
基部留下的花序短小，雄花簇和雌花及花粉发育与对照无差异（冯永庆 等，2005）。经过多年观察
并嫁接繁殖，发现其芽变遗传性状稳定。
自然界多种植物体中均存在矮化突变，许多矮化突变与赤霉素（Gibberellins，GAs）有关。而
由赤霉素导致的矮化突变又可分为 GA 缺陷型突变和 GA 应答型突变。目前已在拟南芥、水稻、玉
米、小麦、大麦等植物体中发现多种 GA 合成或应答通路突变导致的矮化突变体，如小麦 Rht1、玉
米 d8、拟南芥 gai 与 ga2 等矮化突变体（Peng et al.，1997，1999），以及水稻 gid1 突变体（Miyako
et al.，2005）。植物 GAs 合成与信号传递存在的突变都可能导致矮化性状，不同的是 GA 应答突变
体对外施活性赤霉素（如 GA1、GA3、GA4、GA7）不敏感，而赤霉素缺陷型突变体在连续外施活性
赤霉素后可恢复到野生型表型（Sakamoto et al.，2004；Davidson et al.，2006）。
GID1 为赤霉素可溶性受体，通过与活性 GAs 特异性结合介导负调控因子 DELLA 蛋白的降解
或对其活性的抑制而激活赤霉素应答系统（Ariizumi et al.，2008；Hirano et al.，2008），GID1 与 GAs
的结合是 GAs 信号诱发一系列下游反应所必需的（Ueguchi-Tanaka et al.，2005）。在植物体内，GAs
应答系统与活性 GAs 水平间存在着反馈和前馈调控关系，如 GID1 功能缺失突变能够诱导 GAs 的大
量合成和积累（King et al.，2001）；DELLA 蛋白的功能缺失使得 GAs 合成下调（Sasaki et al.，2003）；
而高含量的内源 GAs 又可以反馈抑制 GA 信号的接受与传递，表现为 GID1 及其同源基因表达水平
的明显下调（董静 等，2009）；因此，GAs 合成、应答及植物表型间存在着直接或间接的动态平衡
联系，处在同一复杂而有序的调控之中。
为进一步验证板栗短雄花序变异品种中赤霉素应答是否存在突变（或功能部分缺失），在结合
外源植物激素涂抹试验的基础上，作者从赤霉素受体基因 GID1 的角度探讨 GAs 合成及其信号通路，
以板栗正常雄花序和芽变品种‘短花云丰’短雄花序为试材，采用实时荧光定量 PCR 技术对不同时
期的 GID1 基因表达量进行检测，分析 GAs 合成及其信号传导途径与短雄花序形成的相关性，为进
一步研究板栗短雄花序突变的分子机制奠定基础。
7 期 李兴亮等：板栗赤霉素缺陷型短雄花序芽变的初步鉴定及 CmGID1 基因的表达分析 1253

1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
板栗正常雄花序（‘燕红’品种）及芽变品种‘短花云丰’短雄花序来源于北京市密云板栗产
区。从 2010 年 5 月 11 日花序萌发开始，到 5 月 29 日花药萌发为止，共采样 9 次，液氮速冻后于
–80 ℃冰箱保存。
赤霉素（GAs）、乙烯利（Ethephon）、脱落酸（ABA）、吲哚乙酸（IAA）、芸苔素（BR）、细胞
分裂素（CTK）购自生工生物工程（上海）有限公司。
以‘短花云丰’4 年生嫁接树为试材，选取相同朝向、相同高度的相邻枝条进行试验。在短雄
花序发育初期，按照高、中、低 3 个浓度（表 1）分别涂抹 GAs、Ethephon、ABA、IAA、BR、CTK
等，每种物质浓度组及对照组分别选择 30 个短雄花序，其中对照组为用蒸馏水代替植物生长调节物
质。为避免见光分解，喷涂时间为傍晚，每天涂抹 1 次，连续 3 周。最后测量雄花序长度，利用 SPSS13.0
进行方差分析。
1.2 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成
用 EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司）提取短雄花序和正常
雄花序的总 RNA，用 RNA 纯化试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司）进行纯化，最后用 Reverse
Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒（TaKaRa）进行 cDNA 第一链的合成。
1.3 板栗 GID1 基因序列的克隆及其氨基酸序列进化分析
根据 GenBank 中公布的杨毛果（XM002319540.1）、葡萄（XM002265728.1）、陆地棉（FJ790129.1）
和蓖麻（XM002512264.1）等植物 GID1 基因保守序列区域设计 1 对兼并引物 GID1-s1：
5′-GATGGGGTKTTCTCMTTTGATGT-3′和 GID1-a1：5′-CTCRTCCATRACAGTAT RGAAGTG-3′，以
正常雄花序 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 产物经回收、纯化，与 pMD19-T Vector（TaKaRa）
连接，转化 DH5α 感受态细胞，蓝白斑筛选后测序[生工生物工程（上海）有限公司]。利用 BLAST
软件（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST）、DNAMAN5.2.2 及 MEGA4.0 软件进行核酸、氨基
酸序列比对和进化树的构建。
1.4 实时荧光定量 PCR 分析
使用 Primer5.0 软件设计荧光定量引物为 GID1-s2：5′-ACCGAGATTGGTATTGGAGAGC-3′；
GID1-a2：5′-TGCCAGTCCTGAGTAAGGTC-3′，产物长度 155 bp。以 actin（ev253704）为内参基因
设计引物，A-s：5′-TTGACTATGAGCAGGAACTT-3′；A-a：5′-TTGTAGGTGGTCTCGTGAAT-3′，
产物长度 178 bp。按照 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（TaKaRa）操作指导，对反转录所得的 cDNA
分别进行 5 倍梯度稀释（1、1/10、1/100、1/1 000、1/10 000），实施荧光定量反应，绘制相对标准
曲线。GID1 基因 RT-qPCR 反应体系为 10 μL，包括：5 μL SYBR premix Ex Taq 混合液、1 μL cDNA、
0.25 μL GID1-s2（10 μmol · L-1）、0.25 μL GID1-a2（10 μmol · L-1）、3.5 μL ddH2O。反应程序为：95 ℃
预变性 3 min，94 ℃变性 20 s，54 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 20 s，40 次循环；每次循环第 3 步进行荧
光采集，最后退火至 65 ℃，每隔 30 s 上升 0.5 ℃至 95 ℃变性 1 min。检测其荧光值，绘制溶解曲线。
内参基因 actin PCR 扩增反应体系及反应程序与 GID1 基因相同。PCR 反应于 Bio-RAD C1000TM
Thermal Cycler 上进行，使用 CFX96TM系统进行荧光采集。cDNA 标样和待测样均设置 3 次重复。
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表 1 不同浓度植物激素处理后短雄花序生长长度
Table 1 The catkin length after different concentrations plant
hormone treatment
图 1 赤霉素涂抹处理后短雄花序长度变化
A：GAs 150 mg · L-1 ；B：对照。
Fig. 1 The length change of short-male catkin after GAs treatment
A：GAs 150 mg · L-1；B：Control.
2 结果与分析
2.1 植物生长调节剂涂抹后花序长度
Ethephon、ABA、IAA、BR、CTK 分别按照
高、中、低浓度连续 3 周涂抹板栗短雄花序，最
终，处理后的短雄花序未能恢复伸长生长（表 1），
且这 5 种外源激素处理均不能消除短雄花序顶端
的细胞程序性死亡过程，表型与对照无显著性差
别。
用赤霉素连续涂抹 3 周后，低、中浓度处理
不能明显恢复短雄花序的伸长生长，而 150
mg · L-1 赤霉素处理能够使短雄花序恢复伸长生
长。恢复生长的短雄花序最长 12.1 cm，最短 6.0
cm，平均 8.41 cm；而对照组短雄花序最长 2.6 cm，
最短 0.4 cm，平均长度 0.92 cm；高浓度处理的短
雄花序要显著长于对照（表 1）。更为明显的性状
变化是处理后的短雄花序顶端不发生死亡脱落，
细胞程序性死亡现象消失，恢复了野生表型（图
1）。
赤霉素合成缺陷能够导致细胞程序性死亡的
发生（Bianka & Margret，2005），外源赤霉素处
理弥补了内源赤霉素的不足，进而影响细胞程
序性死亡相关基因的调控，初步推断该短雄花
序芽变可能是由于内源赤霉素合成缺陷所引起
的。
2.2 GID1 基因的克隆及其编码产物的同源性
比较
以正常雄花序 RNA 反转录的第一链
cDNA 为模板，扩增出一条 786 bp 的单一特异
性条带。回收纯化产物测序并进行 BLASTX 分
析，发现与 GenBank 中杨毛果（XP002319576.1）
的 GID1 氨基酸序列相似性为 91%，与陆地棉
（ACN86360.1）、蓖麻（XP002512310.1）的
GID1 氨基酸序列相似性均为 85%。因此命名
该 片 段 为 CmGID1 （ GenBank 登 录 号 为
HQ651231）。



外源激素
Hormone
处理浓度/（mg · L-1）
Concentration
花序长度/cm
Catkin length
150 8.41 ± 1.81 A
50 0.99 ± 0.52 B
GAs
10 0.89 ± 0.38 CD
Ethephon 500 0.67 ± 0.22 H
100 0.84 ± 0.54 D
50 0.58 ± 0.25 J
ABA 20 0.64 ± 0.26 HI
5 0.57 ± 0.35 J
1 0.86 ± 0.16 D
IAA 40 0.56 ± 0.29 J
20 0.80 ± 0.29 EF
10 0.60 ± 0.40 IJ
BR 0.10 0.67 ± 0.50 H
0.05 0.73 ± 0.24 G
0.01 0.81 ± 0.34 DE
CTK 50 0.76 ± 0.23 FG
30 0.60 ± 0.40 IJ
10 0.87 ± 0.24 D
对照 Control – 0.92 ± 0.53 C
7 期 李兴亮等：板栗赤霉素缺陷型短雄花序芽变的初步鉴定及 CmGID1 基因的表达分析 1255

对包括板栗在内的 13 种植物的 GID1 氨基酸序列采用 MEGA4.0 软件以邻接法
（Neighbor-Joining）构建进化树，建树模型选用 Poisson correction 距离法（图 2），并进行 1 000 次
置信度检验。
结果显示，不同植物的 GID1 聚集成 3 个不同的组，第一组又可分成多个不同的亚组，其中板
栗 CmGID1 与拟南芥（Arabidopsis thaliana）进化关系最近，同时与杨毛果（Populus trichocarpa）、
陆地棉（Gossypium hirsutum）、葡萄（Vitis vinifera）、蓖麻（Ricinus communis）等聚为同一分枝。
第二组包括小麦（Triticum aestivum）、高粱（Sorghum bicolor）和玉米（Zea mays）。而水稻（Oryza
sativa indica group）单独归为一类。由进化关系看，板栗 CmGID1 氨基酸序列相对比较保守。


图 2 基于 GID1 氨基酸序列构建系统进化树（NJ 树）
节点旁数据为 1 000 次 Bootstrap 检验后置信度值。
Fig. 2 Phylogenetic tree based on GID1 amino acid sequence from thirteen plant species（Neighbour-Joining）
Numbers at nodes represent Bootstrap values（%）with 1 000 replicate.

利用 DNAMAN5.2.2 和 BLAST 软件，对 CmGID1 基因编码的氨基酸序列与其他植物 GID1 氨
基酸序列进行比对分析（图 3），发现 CmGID1 所编码的 262 个氨基酸接近于其他植物 GID1 序列全
长（约 350 个氨基酸），位于 GID1 氨基酸序列的羧基端。
经丙氨酸扫描（Ala scanning）发现的各个 GAs 或 DELLA 蛋白结合位点（从 N 端到 C 端依次
为 TWVLIS、DR、FFHGGSF、HS、IYD、YRR、DGW、GDSSGGNI、GNI、MF、LDGKYF、DWY
和 GFY）中（Hirano et al.，2007），除 TWVLIS 靠近 GID1 氨基端未克隆到外，其它结合位点均能
在 CmGID1 中得到确认（图 3）。
此外，CmGID1 蛋白中还存在激素敏感酯酶（hormone sensitive lipase，HSL）家族保守的 HGG
和 GXSXG 保守域（Hirano et al.，2008），与其他 GIDl 蛋白类似，HSL 催化相关的 3 个氨基酸 S、
D 和 H 中，只有 S 和 D 是保守的，而 H 被 I 代替。这些结果表明 CmGID1 基因很有可能是板栗中
能够编码活性 GAs 受体的基因，参与板栗发育过程中 GAs 信号的识别和传导。

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图 3 CmGID1 编码蛋白与其他物种 GID1 蛋白的同源性比较
右边数字为氨基酸序号。实心线标出 GA 或 DELLA 蛋白结合位点；HSL 家族的 HGG 和 GXSXG 保守域由黑圆点标出；HSL 催化相关的氨
基酸用箭头表示。HQ651231：板栗 CmGID1 编码蛋白；XP002319576.1：杨毛果 GID1 蛋白；ACN86360.1：陆地棉 GID1 蛋白；
NP198084.1：拟南芥 GID1 蛋白；XP002512310.1：蓖麻 GID1 蛋白；XP002265764.1：葡萄 GID1 蛋白。
Fig. 3 The homology of CmGID1-coding protein and GID1 proteins from other plants
The numbers in the right indicate positions of the amino acid sequences. Solid bars indicate the binding sites of GA or DELLA proteins；HGG and
GXSXG conserved domain of HSL family are marked by black dots；Amino acids related to HSL activity are indicated by arrows. HQ651231：Castanea
mollissima CmGID1-coding protein；XP002319576.1：Populus trichocarpa GID1 protein；ACN86360.1：Gossypium hirsutum GID1 protein；
NP198084.1：Arabidopsis thaliana GID1 protein；XP002512310.1：Ricinus communis GID1 protein；XP002265764.1：Vitis vinifera GID1 protein.
2.3 CmGID1 在花序发育不同时期的表达量分析
采用实时荧光定量 PCR 方法，对从芽变枝与正常枝同时采集的 9 个时期花序进行 CmGID1 基
因的相对表达量检测，将 5 月 15 日表达量最高的短雄花序中的 CmGID1 表达量定为“1”，按照相
对定量公式 2-△△Ct 作图（Kenneth & Thomas，2001），结果如图 4 所示，除 5 月 23 日外，短雄花序
CmGID1 表达量均高于正常雄花序。尤其是在 5 月 15—21 日期间，短雄花序 CmGID1 表达量显著
高于正常雄花序（P < 0.01），此时也正是花序快速生长期，推测 CmGID1 表达量升高是由于赤霉素
含量减少反馈调控引起。此外，短雄花序 CmGID1 表达量波动较大，可能与花序顶部死亡、脱落的
进程有关。
7 期 李兴亮等：板栗赤霉素缺陷型短雄花序芽变的初步鉴定及 CmGID1 基因的表达分析 1257

2.4 赤霉素处理后 CmGID1 表达量的检测
对赤霉素涂抹后恢复生长的短雄花序的 CmGID1 的表达量进行检测，发现花序恢复伸长生长后
CmGID1 的表达量下调，介于蒸馏水处理短雄花序与正常雄花序之间；外源赤霉素的处理改变了短
雄花序内源赤霉素与 CmGID1 的平衡关系，低含量赤霉素正调控 CmGID1 的上调表达，而赤霉素含
量增加后 CmGID1 的表达量相应降低（图 5）。




3 讨论
在外源激素涂抹试验中，赤霉素能够抑制短雄花序顶部的细胞程序性死亡过程，一定程度上恢
复了短雄花序的伸长生长。但相对于拟南芥、小麦等 GAs 合成缺陷型突变体，外施 GA 处理后该短
雄花序性状恢复较慢且对外源 GAs 浓度要求较高，其原因可能与木本植物对外施 GA 的吸收及其内
在复杂的调控有关。本研究中首次从板栗中克隆到赤霉素受体基因 CmGID1，通过与其他物种 GID1
氨基酸序列比对和进化分析，发现 CmGID1 序列比较保守。功能位点分析其可能编码有活性的赤霉
素受体后，用荧光定量 PCR 法对其在花序发育过程中的相对表达量进行了检测。从检测结果看，从
花序发育初期，包括短雄花序死亡脱落过程至花药萌发前，短雄花序中 CmGID1 表达量总体高于正
常花序。在 GAs 需求量相对较大的快速生长期，CmGID1 表达量显著高于野生型，暗示着较低含量
的 GAs 诱导了 CmGID1 的上调表达，使得 GAs 信号应答敏感性增强。而 GAs 处理后恢复生长的短
雄花序其 CmGID1 表达下调，进一步暗示着该短雄花序可能是由于内源 GAs 合成不足所导致的。
本试验中获得了两个证据：（1）外施赤霉素，消除了细胞程序性死亡的发生，短雄花序恢复了
伸长生长；（2）短雄花序中赤霉素受体基因 CmGID1 表达量显著高于野生型，外源赤霉素处理后其
表达下调。在对芽变花序 GAs 含量及 GAs 合成途径可能存在的突变进行检测前，初步推断该短雄
花序为 GAs 合成缺陷型突变体。此外，人们在对果树芽变形成机理的研究中一般认为芽变的发生与
反转录转座子插入、DNA 甲基化、基因结构与表达差异等有关（Yao et al.，2001；Kobayashi et al.，
2004；洪柳和邓秀新，2005；Han et al.，2008），但 GAs 导致芽变的现象还鲜有报道。

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图 4 CmGID1 在不同时期正常和芽变雄花序中的表达量
Fig. 4 Comparison of CmGID1 expression between short catkins
and normal catkins at different periods
图 5 赤霉素涂抹处理后 CmGID1 相对表达量变化
1. 正常雄花序；2. 赤霉素处理后恢复生长的短雄花序；
3. 蒸馏水处理的短雄花序。
Fig. 5 CmGID1 relative expression after GA treatment
1. Normal catkin；2. Recovered short-male catkin after GA
treatment；3. Contrast treated with distilled water.
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