全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (10) : 1525 - 1530
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 04 - 14; 修回日期 : 2009 - 07 - 28
基金项目 : 安徽省教育厅重点项目 (2006KJ054A) ; 安徽省教育厅人才基金项目 ; 安徽农业大学稳定和引进人才项目 (wd200621)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lyllllra@mail1hf1ah1cn)
霍山石斛类原球茎诱导及其发育过程研究
金　青 , 马绍鋆 , 蔡永萍 , 何金铃 , 林　毅 3 , 皮　瑞
(安徽农业大学生命科学学院 , 合肥 230036)
摘 　要 : 以霍山石斛试管苗带节茎段为材料 , 诱导产生类原球茎 , 并研究类原球茎发育过程。结果表
明 , 霍山石斛类原球茎诱导的适宜培养基为 Knudson + 2, 42D 011 mg·L - 1 + KT 0105 mg·L - 1 , 诱导率为
25150%。以固体静置、固液双层静置、液体静置、液体振荡 4种不同培养方式进行增殖培养 , 其中液体振
荡培养方式更适于类原球茎快速增殖。类原球茎通过胚状体发生途径形成 , 类似于合子胚的发育 , 即经历
原胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶胚 , 最后发育为成熟胚。类原球茎发育进程大致可分为类原球茎形成期、
类原球茎肥大期、茎叶分化期、茎叶形成期以及茎叶伸长期等阶段。
关键词 : 霍山石斛 ; 类原球茎 ; 胚状体 ; 发育进程
中图分类号 : S 68212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1021525206
Induction of Protocorm 2like Bod ies and ItsD evelopm en t from Stem Segm en ts
of D endrobium huoshanense
J IN Q ing, MA Shao2jun, CA I Yong2p ing, HE J in2ling, L IN Yi3 , and P I Rui
(School of L ife Science, A nhui A gricu ltura l U niversity, Hefei 230036, Ch ina )
Abstract: Stem segments of D end robium huoshanese were used to induce p rotocorm2like bodies ( PLB s)
and the development of PLB s was studied. The results showed that the most suitable medium for PLB s
inducing is Knudson + 2, 42D 011 mg·L - 1 + KT 0105 mg·L - 1 , the induction ratio can reach 25150% on
this medium. Culture methods also affect the p roliferation of PLB s, shaking2bottle liquid cultivation is more
suitable for PLB s p roliferation among the four culture methods, such as solid culture, double layer, static
liquid and shaking2bottle liquid. Anatom ical investigation revealed that the formation of PLB s from D endrobium
huoshanese is similar to zygotic embryo, development from pro2embryo, globular2embyro, heart2shaped embryo,
torpedo2embryo, then from cotyledon to mature embryoid. The development of PLB s can be divided into five
stages: Formation of PLB s, hypertrophy of PLB s, differentiation of stalks and leaves, formation of stalks and
leaves, stretch of stalks and leaves.
Key words: D endrobium huoshanese; p rotocorm 2like bodies; embryoid; formation and development
霍山石斛为兰科石斛属多年生草本植物 , 具有极高的观赏价值和独特的药用价值。其种子繁殖能
力极低 , 生长周期长 , 对生长条件要求极为苛刻 , 近些年来在其主产地安徽霍山已极难发现野生个
体。目前 , 种质资源缺乏限制了药用石斛的可持续利用 , 药用石斛研究主要集中在石斛组培快繁技
术 , 包括以种子离体萌发诱导原球茎 , 茎尖、茎段分生组织直接诱导成苗以及组培苗驯化移栽等方面
(徐红 等 , 2001) , 而从茎段诱导类原球茎并揭示其发育特性的研究鲜见报道。
兰科植物的组织培养中 , 将通过诱导适宜的外植体产生的类似于原球茎的器官称为类原球茎或拟
原球茎 (p rotocorm2like bodies, PLB s) (王凯基 , 1994)。目前 , 植物通过体细胞胚胎发生获得再生植
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
株的报道日益增多 , 但有关石斛属体细胞胚胎发生发育的组织学方面研究极少 (叶秀粦 等 , 1988;
Sheelavanthmath et al. , 2005; 张启香和方炎明 , 2005) , 有关霍山石斛体细胞胚胎发生发育的组织学
研究至今未见报道。
石斛类原球茎实质上是正在生长分化的体细胞胚 (查学强 等 , 2005) , 易于分化成苗 , 不仅是繁
育的重要途径 ( Shashi, 1993; 秦自清 等 , 2008) , 还是研究基因工程改良育种的良好受体 (M ish2
ibak et al. , 2005; 陈之林 等 , 2007)。
作者诱导霍山石斛的类原球茎 , 并研究体细胞胚胎的发生发育过程 , 从而控制其分化趋势 , 摸索
类原球茎适宜增殖的继代周期 , 筛选适于生物反应器大规模增殖培养的类原球茎 , 以期为霍山石斛繁
殖、育种和规模化生产提供理论依据和技术。
1　材料与方法
111　试验材料
试验于 2006年秋在安徽农业大学生命科学学院细胞工程室进行。材料为霍山石斛 (D endrobium
huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng) 种子一年生试管苗 , 由安徽农业大学生命科学学院石斛课题
组提供。
112　类原球茎诱导和增殖
11211　诱导和增殖方法　
在超净工作台上用解剖刀将霍山石斛试管苗除去叶、叶鞘和根 , 切成 015～ l10 cm长的茎段 , 每
个切段含有一个茎节。将茎节接种于固体诱导培养基上 , 每处理 10瓶 , 每瓶接种 6个 , 每个处理重
复 3次 , 诱导培养 60 d。然后将诱导的类原球茎从茎段上切下转入固体增殖培养基中 , 每 40 d继代 1
次 (贾书华 等 , 2007) , 培养 5～6代后 , 分别以固体静置培养、固液双层静置培养、液体静置培养
和液体振荡培养等 4种方式进行增殖培养。观察类原球茎诱导和增殖生长状况。
11212　培养基和培养条件 　
诱导培养基 (Ⅰ～Ⅵ) 为 Knudson添加不同的植物生长调节剂 (表 1) , 增殖培养基为 MS +
62BA 012 mg·L - 1 +NAA 011 mg·L - 1。
培养基中均加入 018%琼脂和 310%蔗糖 , pH 518。培养温度为 (25 ±1) ℃; 诱导培养期间采用
漫射光 ; 增殖培养期间光强 15μmol·m - 2 ·s- 1 , 光照时间 10 h·d - 1 ; 液体振荡培养时光照与增殖
培养一致 , 摇床转速为 120 r·m in - 1。
113　类原球茎的显微结构观察
诱导培养一周后 , 每 5 d取样 1次 , 直至类原球茎出现茎叶分化。将不同时期的材料采用卡诺固
定液固定 , 系列酒精脱水 , 二甲苯透明 , 石蜡包埋 , 切片厚 8μm, 番红 —固绿对染 , 中性树胶封片
(何凤仙 , 2000) , O lympus光学显微镜观察类原球茎发生途径 ; 选取固体增殖培养不同发育期的类原
球茎 , 置于解剖镜下观察类原球茎发育进程。
114　数据统计处理
诱导培养第 60天统计类原球茎诱导率。诱导率 ( % ) = (诱导出原球茎的茎段数 /接种的茎段
数 ) ×100 。
取不同培养方式培养 40 d的类原球茎 , 105 ℃杀青 , 60 ℃烘至恒重后称量质量 (蔡永萍 等 ,
2005) , 计算增殖率。增殖率 ( % ) = (收获时的干样质量 - 接种干样质量 ) /接种干样质量 ×100。
每隔 5 d取固体静置和液体振荡增殖培养的类原球茎 , 称干样质量 , 绘制生长曲线。
试验数据用 SPSS1210软件处理并统计分析。
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2　结果与分析
211　霍山石斛类原球茎诱导
诱导培养 20 d后 , 可观察到霍山石斛带节间茎段一侧开始膨大 , 数天后膨大处出现肉眼可见淡
黄色颗粒状突起。诱导培养 60 d内 , 诱导的类原球茎数量不断增加 , 接种材料的褐化数和死亡数也
随之增加。
当培养基中只含 KT而不含 2, 42D时 , 类原球茎的诱导率为 0, 随着 2, 42D浓度增加 , 诱导率
先升后降 ; 而当 2, 42D浓度一定时 , 随着 KT浓度增加 , 诱导率较低并呈下降趋势。可见 , 2, 42D
对霍山石斛类原球茎诱导最为关键 , 植物生长调节剂配比对霍山石斛类原球茎诱导的影响也较大。Ⅲ
号培养基上诱导出 PLB s的茎段数最多 , 达到 1513个 /60茎 , 诱导率达 25150% , 与其它培养基相比
差异极显著。由此可见 , 诱导霍山石斛茎段产生类原球茎的适宜培养基为 Knudson + 2, 42D 011 mg·
L - 1 + KT 0105 mg·L - 1。
表 1　植物生长调节剂配比对霍山石斛类原球茎诱导的影响
Table 1　Effects of horm one com b ina tion s on induction of protocorm 2like bod ies from D. huoshanense
培养基
Medium
2, 42D
/ (mg·L - 1 )
KT
/ (mg·L - 1 )
接种数
Number
of inocula
褐化数
Number
of browed
死亡数
Number
of death
诱导出 PLB s的茎段数
Number of stem with PLB s
PLB s诱导率 /%
Induction ratio
Ⅰ 0 0105 60 315 ±0103 215 ±0102 0 0
Ⅱ 0105 0105 60 413 ±0102 317 ±01013 3 212 ±0101 3167 ±0102
Ⅲ 0110 0105 60 512 ±01013 3 217 ±0103 1513 ±01023 3 25150 ±01013 3
Ⅳ 0120 0105 60 616 ±01043 3 516 ±01023 3 414 ±0101 7133 ±0103
Ⅴ 0105 0110 60 515 ±01013 3 418 ±01033 3 217 ±0101 4150 ±0102
Ⅵ 0105 0120 60 718 ±01033 3 511 ±01023 3 113 ±0102 2117 ±0103
　　注 : 3 表示 P < 0105水平差异显著 , 3 3 表示 P < 0101水平差异极显著 , 下表同。
　　Note: 3 shows correlation is significant at the 0105 level; 3 3 shows correlation is significant at the 0101 level. The same below.
212　霍山石斛类原球茎发育过程的显微观察
通过石蜡切片观察发现 , 霍山石斛茎段诱导类原球茎的形成过程是通过胚状体途径发生的 (图
1)。
霍山石斛茎段诱导培养 20 d后其一侧开始膨大 , 突起部分的表皮或表皮下薄壁细胞经多次平周
和垂周分裂后形成不规则的细胞团 , 细胞团边缘细胞具有细胞质浓 , 细胞核大且居于细胞中央的特
点 , 这个阶段类似于合子胚发育过程的原胚期 (图 1, a)。
随着进一步发育 , 突起部分细胞多次分裂 , 逐渐发育成球形胚期 (图 1, b)。
球形胚进行纵向伸长 , 两侧细胞分裂较快 , 向外突出 , 中间向内凹陷 , 多细胞胚继续发育成拳头
状突起的心形胚 , (图 1, c)。此后经历鱼雷胚期 (图 1, d) 和子叶期 (图 1, e) 等阶段 , 发育为
成熟的胚状体。
伴随球形胚发育的逐步推进 , 胚根原基出现分化 (图 1, f)。
整个体细胞胚胎发育期 , 胚体内各细胞之间结合紧密无空隙 , 但胚体细胞团与原母体细胞组织之
间逐渐疏松 , 空隙较大 , 容易分离。
将诱导的霍山石斛类原球茎置于适宜的固体增殖培养基上 , 类原球茎能增殖和分化直至发育成
苗。其发育过程经过类原球茎形成期 (图 2, a)、类原球茎肥大期 (图 2, b)、茎叶分化期 (图 2,
c)、茎叶形成期 (图 2, d) 以及茎叶伸长期 (图 2, e) , 形成完整的植株 (图 2, f)。类原球茎肥大
期细胞分裂增生速度较快 , 此时适宜类原球茎增殖培养。霍山石斛类原球茎的发育过程与张启香和方
炎明 (2005) 报道的铁皮石斛结果较为一致。
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213　霍山石斛类原球茎的增殖
21311　培养方式对类原球茎增殖的影响 　
类原球茎增殖是霍山石斛体细胞快繁育苗的关键步骤 , 培养方式对霍山石斛类原球茎增殖的影响
较大。
由表 2可以看出 , 在 4种培养方式中 , 与固体培养相比 , 其他 3种培养方式中的类原球茎平均干
样质量都有显著增加 , 其中液体振荡培养的干样质量最大 , 平均干样质量增殖率为 208114% , 且类
原球茎呈颗粒状 , 均匀性、分散性好 , 其他 3种培养方式中的类原球茎聚结在一起 , 呈团块状 , 且固
液双层培养和液体静置培养的类原球茎生长紧密 , 而固体培养的较疏松。延长培养期 , 固体培养的类
原球茎易分化出芽。因此 , 固体培养的类原球茎有利于进行试管苗分化培养成苗 , 液体振荡培养的类
原球茎分散 , 不易分化 , 有利于类原球茎的快速增殖。
表 2　培养方式对霍山石斛类原球茎增殖生长的影响
Table 2　Effects of d ifferen t culture m ethods on protocorm 2like bod ies m ultiplca tin of D. huoshanense
培养方式 Culture method 接种干样质量 / g Inoculated weight 平均干样质量 / g D ry weight 增殖率 /% Ratio of multip lacation
固体培养 Solid culture 017 11270 ±0103 81142 ±0103
固液双层 Double layer 017 11320 ±01023 88157 ±01023
液体静置 Static liquid 017 11305 ±01043 86142 ±01043
液体振荡 Shaking2bottle liquid 017 21157 ±01053 3 208114 ±01053 3
21312　霍山石斛类原球茎增殖培养生长曲线 　
由图 3可以看出 , 霍山石斛类原球茎在固体和液体振荡培养方式下增殖培养 , 在培养周期内生长
曲线都近似 “S”型 , 液体振荡培养比固体培养提前达到生长高峰 , 前者在 40 d, 后者在 55 d。液体
振荡培养的类原球茎最大生长量达每瓶 21157 g DW , 高于固体培养的最大生长量 11460 g。由此可
见 , 液体振荡培养方式更适合霍山石斛类原球茎的增殖培养 , 液体振荡培养适宜的继代周期为 40 d,
固体培养适宜的继代周期为 55 d。
图 3　霍山石斛类原球茎固体和液体振荡培养的生长曲线
F ig. 3　The growth curve of protocorm 2like bod ies m ultiplca tin of D. huoshanense
in solid and shak ing2bottle liqu id culture
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References
Cai Yong2p ing, W ang Shu, L in Yi, L i He2sheng, Luo B ing2shan. 2005. Studies on the growth, chem ical components and physiological
characteristics of F1 generation of D endrobium huoshanense. China Journal of Chinese Materia Medica, 30 ( 14) : 1064 - 1068. ( in Chi2
nese)
蔡永萍 , 汪　曙 , 林 　毅 , 李合生 , 骆炳山. 2005. 霍山石斛 F1代生长、有效成分和生理特性的研究. 中国中药杂志 , 30
(14) : 1064 - 1068.
Chen Zhi2lin, Duan Jun, Zeng Song2jun, L iang Cheng2ye, Ye Xiu2lin. 2007. Agrobacterium 2mediated transformation of D endrobium orchid by
targeting p rotocorm s. Acta of Scientiarum Natural Universitatis Sunyatseni, 46 (1) : 86 - 90. ( in Chinese)
陈之林 , 段　俊 , 曾宋君 , 梁承邺 , 叶秀粦. 2007. 原球茎为转化受体的农杆菌介导石斛遗传转化. 中山大学学报 : 自然科学
版 , 46 (1) : 86 - 90.
He Feng2xian. 2000. Botanical experiment. Beijing: H igher Education Press. ( in Chinese)
何凤仙. 2000. 植物学实验. 北京 : 高等教育出版社.
J ia Shu2hua, W ang D i, Gao Yuan, Cai Yong2p ing, L in Yi. 2007. Influence of subculture cycle on tube p lantlet growth of D endrobium
huoshanense and medium composition. Chinese Traditional and Herbal D rugs, 37 (8) : 1239 - 1243. ( in Chinese)
贾书华 , 王　娣 , 高　橼 , 蔡永萍 , 林　毅. 2007. 继代周期对霍山石斛试管苗生长及培养基成分的影响. 中草药 , 37 ( 8 ) :
1239 - 1243.
M ishibak I, Chind P, Masahiro M. 2005. Agrobacterium 2mediated transformation of Phalaenopsis by targeting p rotocorm s at an early stage after
germ ination. Plant Cell Reports, 24 (5) : 291 - 303.
Q in Zi2qing, Zhao Ting, Q iu J ing, L in Yi, Cai Yong2p ing. 2008. Germ ination and p ropagartors of artificial seeds of D endrobium huoshanense.
Chinese Journal of B iotechnology, 24 (5) : 803 - 809. ( in Chinese)
秦自清 , 赵　婷 , 邱 　婧 , 林 　毅 , 蔡永萍. 2008. 霍山石斛人工种子包埋繁殖体和萌发的研究. 生物工程学报 , 24 ( 5 ) :
803 - 809.
Shashi C. 1993. Propagation of Cym bid ium giganteum W all through high frequency conversion of encap sulated p rotocorm s under in vitro and in
vitro conditions. Indian Journal or Experimental B iology, 31: 61 - 64.
Sheelavanthmath S S, Murthy H N, Hema B P, Hahn E J, Paek K Y. 2005. H igh frequency of p rotocorm like bodies ( PLB s) induction and
p lant regeneration from p rotocorm and leaf sections of A erides crispum. Scientia Horticulturae, 106: 395 - 401.
W ang Kai2ji. 1994. A dictionary of p lant biology. Shanghai: Shanghai Scientific and Technological Education Publishing House. ( in Chinese)
王凯基. 1994. 植物生物学词典. 上海 : 上海科技教育出版社.
Xu Hong, W ang Zheng2tao, D ing J ia2yi. 2001. General research aspect of biotechnology about medical D endrobii. Chinese W ild Plant
Reasources, 20 (1) : 1 - 4. ( in Chinese)
徐　红 , 王峥涛 , 丁家宜. 2001. 药用石斛生物技术的研究概况. 中国野生植物资源 , 20 (1) : 1 - 4.
Ye Xiu2lin, Cheng Shi2jun, W ang Fu2xiong, Q ian Nan2fen. 1988. Morphology of immature seeds and development in vitro of D endrobium can2
didum. Acta Botanica Yunnanica, 10 (3) : 285 - 295. ( in Chinese)
叶秀粦 , 程式君 , 王伏雄 , 钱南芬. 1988. 黑节草未成熟种子的形态发育及其在离体培养时的表现. 云南植物研究 , 10 ( 3 ) :
285 - 295.
Zha Xue2qiang, Luo J ian2p ing, J iang Shao2tong. 2005. Studies on synthesis of active polysaccharides in suspension cultures of p rotocorm2like
bodies of D endrobium huoshanense. Food Science, 26 (4) : 41 - 44. ( in Chinese)
查学强 , 罗建平 , 姜绍通. 2005. 悬浮培养霍山石斛原球茎合成活性多糖的研究. 食品科学 , 26 (4) : 41 - 44.
Zhang Q i2xiang, Fang Yan2m ing. 2005. Tissue culture and in vitro seedling and p rotocorm2like body exam ination of D endrobium candidum. Acta
Bot Boreal2Occident Sin, 25 (9) : 1761 - 1765. ( in Chinese)
张启香 , 方炎明. 2005. 铁皮石斛组织培养及试管苗营养器官和原球茎的结构观察. 西北植物学报 , 25 (9) : 1761 - 1765.
0351