全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2010 37 6 880 890
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–12–17；修回日期：2010–05–07
基金项目：江苏省农业科学院科研基金项目（6110816）；江苏省科技基础设施建设计划项目（BM2008008）；国家农业科技成果转化资
金项目（2008GB2C100100）
豆梨植物络合素合酶PcPCS1基因克隆及其表达
分析
李 慧1,2，丛 郁3，王宏伟1，盛宝龙1，蔺 经1，常有宏1,2,*
（1江苏省农业科学院园艺研究所，南京 210014；2江苏省食品质量安全重点实验室，南京 210014；3中国科学院南
京土壤研究所，南京 210009）
摘 要：以梨砧木豆梨（Pyrus calleryana Dcne.）为试材，克隆其植物络合素合酶基因（PcPCS1）的
cDNA全长序列，并研究该基因的表达特点。结果表明PcPCS1 cDNA 序列长度为 1 970 bp，编码 497 个
氨基酸，推导的氨基酸序列由两个典型的植物络合素亚家族结构域组成，具有 3 个相邻的Cys-Cys元件
（331-332、351-352 和 369-370 位氨基酸）和植物络合素合酶蛋白的特征位点（Cys-56、Cys-90/91 和
Cys-109）。它与豆科植物的PCS1 蛋白处于系统发生树的同一分支，且与百脉根LjPCS1 蛋白的同源性最高
（84%）。荧光定量RT-PCR分析结果显示：PcPCS1 基因为组成型表达，各器官表达量存在差异，在 20
mol · L-1 CdSO4胁迫条件下，其表达量迅速上升，并且在豆梨叶中的表达量高于根；不同重金属离子对
其上调表达的诱导能力为Cd2+ > Zn2+ > Cu2+。200 mol · L-1 γ–谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁胱亚磺酰
亚胺能够显著抑制该基因的表达，补充 200 mol · L-1谷胱甘肽后，其相对表达量恢复或超过单一重金属
离子处理的表达水平，即豆梨植物络合素以谷胱甘肽为底物，通过γ–谷氨酰半胱氨酸合成酶途经合成。
关键词：豆梨；植物络合素合酶；基因；克隆；丁胱亚磺酰亚胺；表达特点
中图分类号：S 661 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）06-0880-11

Molecular Cloning and Expression Analysis of a Phytochelatin Synthase
Gene，PcPCS1，from Pyrus calleryana Dcne.
LI Hui1, 2，CONG Yu3，WANG Hong-wei1，SHENG Bao-long1，LIN Jing1，and CHANG You-hong1, 2, *
（1Institute of Horticulture，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China；2The Key Laboratory of
Jiangsu Province Food Safety，Nanjing 210014，China；3Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing
210009，China）
Abstract: Pear rootstocks bean pear（Pyrus calleryana Dcne.）was used as an experimental materials
for cloning phytochelatin synthase gene and researching its expression characterization via rapid
amplification of cDNA ends（RACE）and fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain
reaction（RT-PCR）methods. PcPCS1 cDNA sequence length is 1 970 bp, which contains an open reading
frame that would encode a 54.77 kD protein of 497 amino acids. Two typical phytochelatin subfamily
domains constitute PcPCS1 protein, which includes three adjacent Cys-Cys elements（331-332, 351-352

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：cyh@jass.ac.cn）
6 期 李 慧等：豆梨植物络合素合酶 PcPCS1 基因克隆及其表达分析 881
and 369-370 location amino acid）in the C-terminal region and all characteristics sites（Cys-56, Cys-90/91
and Cys-109）of phytochelatin synthase protein. PcPCS1 and other PCS1 proteins from leguminous plants
belong to the same branch in PCS1 phylogenetic tree. Moreover, PcPCS1 had the highest homology（84%）
with Lotus corniculatus LjPCS1. Fluorescence quantitative RT-PCR results showed that PcPCS1 gene was
constitutively expression and its expressions were different in various organs. Furthermore, PcPCS1
transcription level was quickly climbed up after 20 mol · L-1 CdSO4 treatment 24 hours, which was
higher in leaf than in root. It was very significant that three heavy-metal ions had different abilities to
up-regulated PcPCS1 expression as the sequence Cd2+ > Zn2+ > Cu2+. It is need to point out that PcPCS1
expression was significantly inhibited by 200 mol · L-1 L-Buthionine sulfoximine（BSO） which was one
of γ-glutamyl cysteine synthetase inhibitors. However, its expression returned to the normal level of single
heavy-metal treatment or exceeded it after adding 200 mol · L-1 L-Glutathionereduced（GSH）to the
nutrient solution. In summary, the bean pear phytochelatins synthesis used glutathione as substrate, which
was produced through γ-glutamyl cysteine synthetase pathway.
Key words：Pyrus calleryana Dcne.；phytochelatin synthase；gene；cloning；L-Buthionine
sulfoximine；expression characteristics

植物络合素（Phytochelatins，PCs）是重金属胁迫诱导下植物体内产生的一类由半胱氨酸、谷
氨酸和甘氨酸组成的低分子量非蛋白质态富含巯基螯合多肽，通常结构为（γ-Glu-Cys）n-Gly（其中
n = 2 ~ 11）（Ramos et al.，2008）。通过合成植物络合素来螯合细胞内游离态的重金属，并对该复合
物进行区域化隔离，是植物、藻类、真菌以及部分动物体内普遍存在的一种应对重金属毒害的稳态
机制（DalCorso et al.，2008）。PCs能与Cu2+、Zn2+等生命活动必需金属离子结合，并将其转运至液
泡或目标酶等部位（Tennstedt et al.，2008），也会螯合Cd2+、Pb2+等非必需金属离子，避免其与酶或
其它活性物质的结合，从而降低重金属的毒害作用（Alberich et al.，2008）。PCs不是基因的直接翻
译产物，而是以谷胱甘肽为底物，由植物络合素合酶（Phytochelatin synthases，PCS，EC 2.3.2.15）
催化合成（Ramos et al.，2008）。不同的重金属离子对植物络合素合酶的诱导能力存在差异，而Cd2+
是最佳的金属催化剂（Grill et al.，1989）。目前拟南芥（Ha et al.，1999；Vatamaniuk et al.，1999）、
小麦（Clemens et al.，1999）、芥菜（Heiss et al.，2003）、大蒜（姜瑛楠 等，2005）、生菜（He et al.，
2005）、百脉根（Ramos et al.，2008）等植物中编码该酶的基因已经获得，其中对拟南芥AtPCS1 的
研究最为透彻。拟南芥AtPCS1 缺失体对镉高度敏感，过量表达AtPCS1 会改变受体植物的镉积累和
耐受能力，这些证据充分证明植物络合素合酶基因在植物重金属螯合解毒过程起重要作用（Ha et al.，
1999；Pomponi et al.，2006；Gasic & Korban，2007a，2007b；Wojas et al.，2008）。
植物体内绝大部分重金属来自于根系从土壤中的吸收和积累，果树生产多采用砧木嫁接品种的
方式，因此砧木吸收、积累和运输重金属的能力可直接决定地上部果实重金属含量。砧木吸收过量
重金属后，不仅植株的生长发育受到抑制，而且在根部没有得到螯合的活性重金属离子，通过嫁接
口向接穗转运后，会影响果品中重金属的含量，从而对果品安全生产造成威胁。鉴于植物络合素在
螯合重金属方面发挥的重要作用，解析果树砧木体内由植物络合素介导的重金属解毒过程，对于进
一步揭示嫁接后重金属从砧木到接穗转运的具体情况起指导作用，从而为实现果品无重金属残留安
全生产奠定理论基础。
本研究中以我国南方梨产区广泛使用的砧木豆梨（Pyrus calleryana Dcne.）为研究对象，首次尝
试从蔷薇科植物中克隆植物络合素合酶基因，并利用荧光定量 RT-PCR 技术研究不同重金属处理后
该基因的表达情况，为有针对性地解析其在豆梨重金属解毒过程中所起的生理作用提供理论依据。

882 园 艺 学 报 37 卷
1 材料与方法
1.1 试验材料
2008 年 11 月于浙江省嵊州市长乐镇（E120.58，N30.01）收集豆梨成熟种子，湿砂拌种贮藏
在 4 ℃冷藏柜中进行层积处理。2009年 3 月和 6 月将种子取出，播种于光照培养箱石英砂基质盆
钵内，培养温度（25 ± 0.5）℃，光照周期 14 h/10 h（光照/黑暗），光强为 300 µmol · m-2 · s-1。生
长期间常规管理，并用1/10 Hoagland营养液浇灌。
待豆梨幼苗长至 4 片真叶大小时，轻轻洗净植株根部石英砂，转入含 20 mol · L-1 CdSO4、
CuSO4或 ZnSO4的 1/10 Hoagland营养液中处理 24 h，采集不同处理的叶片与根，保存于–70 ℃冰
箱待用。
1.2 试验试剂
丁胱亚磺酰亚胺（L-Buthionine sulfoximine，BSO）、谷胱甘肽（L-Glutathionereduced，GSH）、
硫酸镉（CdSO4）、硫酸铜（CuSO4）和硫酸锌（ZnSO4）购自Sigma公司，RNA Plant Kit和胶回收
试剂盒购自TIANGEN公司，M-MLV反转录酶、RNase inhibitor、Oligo（dT）15、Oligo（dT）18和 3′-full
RACE Core Set购自TaKaRa公司，AMV反转录酶和pGEM-T Easy连接试剂盒购自Promega 公司，
DNA marker 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。Real time PCR Master Mix（SYBR Green）
购自南京凯基生物科技发展有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 RNA的提取及逆转录反应
豆梨叶片和根总 RNA 提取按照 RNA Plant Kit 的说明书进行，所提取的 RNA 经 1%琼脂糖凝胶
电泳检测后进行下列逆转录反应。
基因克隆模板准备：2.0 L Oligo（dT）15，1 g 总RNA，RNase free water补足 13.0 L，70 ℃
热激 10 min，冰浴冷却 2 min，加入 4.0 L 5 × M-MLV Buffer，1.0 L 10 mmol · L-1 dNTP，1.0 L
RNase inhibitor（40 U · μL-1），1.0 L M-MLV逆转录酶（200 U · L-1），轻轻混匀，37 ℃保温 60 min，
70 ℃加热 15 min 终止反应，反转录产物保存于–20 ℃备用。
荧光定量PCR模板准备：1.0 L Oligo（dT）18，2 g 总RNA，1.0 L 10 mmol · L-1 dNTP，RNase
free water补足 11.0 L，70 ℃保温 5 min，冰浴冷却 5 min，加入 1.0 L RNase inhibitor （40 U · μL-1），
5.0 L 5 × AMV Reaction Buffer，1.0 L DTT （1 mol · L-1），1.0 L AMV逆转录酶（20 U · L-1），
RNase free water补足 25.0 L，轻轻混匀，42 ℃保温 60 min，95 ℃加热 5 min，5 ℃冷却 5 min，反
转录产物保存于–20 ℃。
1.4 PcPCS1 基因全长cDNA序列的克隆
根据 GenBank 核酸数据库中不同双子叶植物植物络合素合酶基因保守氨基酸序列，设计简并引
物 PA 和 PS，扩增豆梨 PcPCS1 基因保守区片段。反应参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，
72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 10 min。
根据已克隆的豆梨 PcPCS1 基因保守区片段，设计 3′ RACE 上游引物 PCS-3′S，再结合 TaKaRa
公司 3′-full RACE Core Set 试剂盒提供的 3′末端锚定引物（3′ adaptor primer），对豆梨 PcPCS1 基因
的 3′末端进行 PCR 扩增，反应参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 个循环；
72 ℃ 10 min。
用获得的 PcPCS1 基因保守片段核苷酸序列在 NCBI 上与其他植物络合素合酶基因进行比对，
6 期 李 慧等：豆梨植物络合素合酶 PcPCS1 基因克隆及其表达分析 883
寻找并设计 5′上游保守区域简并引物 PCS-5′S，根据保守片段测序结果设计下游引物 PCS-5′A，扩增
PcPCS1 的 5′末端，反应参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 个循环；72 ℃ 10
min。
比对、拼接豆梨 PcPCS1 基因保守区片段、3′末端和 5′末端 3 个序列片段，获得豆梨 PcPCS1 基
因的全长 cDNA 序列信息，并设计全长引物 PcPCS-5′和 PcPCS-3′，进行扩增和测序验证。反应参数：
94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，28 个循环；72 ℃ 10 min。
各轮PCR扩增所用引物如表 1。所得产物用胶回收试剂盒纯化后与 pGEM-T Easy克隆载体连接，
转化 JM109 感受态细胞，挑取阳性菌落，PCR 鉴定后由上海博亚生物技术有限公司测序。
1.5 PcPCS1 基因序列分析和系统进化树的构建
PcPCS1 基因核苷酸翻译采用 BioXM 软件，氨基酸序列比对和系统进化树构建采用 DNAMAN
软件完成，TreeView 软件生成图形，所用 PCS1 氨基酸序列来自 http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov。
PcPCS1 蛋白保守结构域的查找通过 http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast 完成。蛋白质三维结构预
测在 http://swissmodel.expasy.org 上进行，并通过 http://www.ebi.ac.uk/InterProScan 寻找该类蛋白在不
同物种中的分布。
1.6 PcPCS1 基因表达研究
分别以各处理和对照样品的 2 g总RNA逆转录成 cDNA 第一链，然后利用PcPCS1基因的特异
性引物 qPCCSS 和 qPCCSA（表 1），参照试剂说明书（凯基）在ABI荧光定量PCR仪（达安基因）
进行实时定量PCR。
表 1 引物序列与预期扩增片段大小
Table 1 Primer sequences and PCR products expected sizes
编号
Code
序列
Sequence
用途
Using
预期片段大小/bp
Expected size
PS 5′-GAAAGGGCCTTGGAGRTGG-3′ 保守区扩增 420
PA 5′-GATATDAGCATRAACCCYCT-3′ Conserved region amplification 420
PCS-5′S 5′-ATGGCKATGGCGRGKTTRTATC-3′ 5′末端扩增 290
PCS-5′A 5′-GACAGTCTCCAAAGGCTCGCAACAG-3′ 5′ terminal region amplification 290
PCS-3′S 5′-TTCATCTACTGGACAACGCAGAGGGT-3′ 3′末端扩增 1 360
3′ adaptor primer 5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′ 3′ terminal region amplification 1 360
PcPCS-5′ 5′-ATGGCGATGGCGGGGTTG-3′ 全长扩增 1 940
PcPCS-3′ 5′-TCGCTCACATATCACCACTATA-3′ Full length sequence amplification 1 940
qPCactS 5′-CTCCCAGGGCTGTGTTTCCTA-3′ 内参基因扩增 170
qPCactA 5′-CTCCATGTCATCCCAGTTGCT-3′ Reference gene amplification 170
qPCCSS 5′-AACGGACATCAAGCCAAAAAAA-3′ 荧光定量 RT-PCR 160
qPCCSA 5′-CAGTTAGCACGCAATTCAGCCA-3′ Fluorescent quantitative RT-PCR 160

PCR反应参数为 95 ℃预变性 5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45个循环后作熔解曲线（95 ~ 55℃，
0.5 ℃ · s-1）以鉴定反应的特异性。每个点 3 次重复。
选用PcActin基因（引物qPCactS 和qPCactA见表1）为内参照，按照 2-ΔΔCT法（Livak & Schmittgen，
2001）计算出待测基因相对表达量，应用Excel 2003整理试验数据并作图。

884 园 艺 学 报 37 卷
2 结果与分析
2.1 PcPCS1 基因全长cDNA克隆
以豆梨叶片 RNA 为模板，用 PA 和 PS 为引物进行保守片段的PCR扩增（图1，A），经测序
该核苷酸序列大小为 420 bp，同源比对结果显示，其与百脉根LjPCS1基因相似性达到 86%。
用所获得的PcPCS1保守片段核苷酸序列在NCBI上与其他植物络合素合酶基因进行比对，寻找
并设计 5′上游保守区域简并引物 PCS-5′S，结合根据保守片段设计的下游引物 PCS-5′A，扩增获得
PcPCS1的 5′末端序列（图1，B），经测序该核苷酸序列大小为 291 bp，与百脉根LjPCS1基因相似
性达到 98%，并且包含起始密码子ATG。
利用 3′ RACE上游引物 PCS-3′S与3′末端锚定引物进行3′末端序列扩增（图1，C），测序结果表
明3′ RACE产物大小为 1 360 bp，含有 28 个 A 组成的 PolyA 尾巴，它与大豆GmPCS1基因相似
性为75%。
比对、拼接PcPCS1的保守片段、5′末端和3′末端序列片段，获得豆梨PcPCS1基因的全长cDNA
序列信息，并设计引物PcPCS-5′和PcPCS-3′，进行RT-PCR扩增除PolyA尾巴外的全长序列（图1，D），
测序结果与所拼接的序列完全一致，获得了豆梨植物络合素合酶基因PcPCS1共1 970 bp的全长
cDNA。

图 1 豆梨 PcPCS1 基因保守区（A）、5′末端序列（B）、3′末端序列（C）和全长序列（D）的扩增结果
Fig. 1 The PCR amplification results of PcPCS1 conserved sequence（A），5′ sequence（B），3′ sequence（C）and
full-length sequence（D）from Pyrus calleryana Dcne.

2.2 PcPCS1 基因的序列分析
PcPCS1 基因核苷酸序列大小为 1 970 bp，开放阅读框由 1 ~ 1 494 bp 碱基组成，编码一个含有
497 个氨基酸残基的蛋白，预测的等电点（pI）为 6.97，估计的相对分子质量为 54.77 kD（图 2）。
与其它植物 PCS1 基因类似的是，PcPCS1 基因编码产物由 N 端（4 个氨基酸）、保守区（208 个氨
基酸）和 C 端可变区（285 个氨基酸）组成，氨基端高度保守，其中 Cys-56、Cys-90/91、Cys-109
和 Cys-113 是双子叶 PCS 蛋白的特征位点，羧基末端包含 12 个半胱氨酸（Cys）残基，它们是 PCS
蛋白的主要金属结合位点，其中包括 3 个相邻的 Cys-Cys 元件（331-332、351-352 和 369-370 位氨
基酸）（图 2，表 2）。

6 期 李 慧等：豆梨植物络合素合酶 PcPCS1 基因克隆及其表达分析 885
图2 豆梨PcPCS1基因的cDNA序列及其编码的氨基酸
半胱氨酸残基用圆圈标出。
Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Pyrus calleryana Dcne. PcPCS1
Cys residues have been marked with circles.

表 2 双子叶植物 PCS1 蛋白氨基酸组成比较
Table 2 The comparison of amino acid composition from PCS1 proteins of eudicots
植物
Plants
蛋白
Protein
N + B + C = T (M) Cys
保守半胱氨酸残基位置
Conservative Cys residues location
in amino acids sequence
序列号
Accession
No.
拟南芥
Arabidopsis thaliana
AtPCS1 4+208+273=485 (54.48) 10 Cys-56，Cys-90/91,Cys-109，Cys-113 AF135155
芥菜 Brassica juncea BjPCS1 4+208+273=485 (54.31) 11 Cys-56，Cys-90/91,Cys-109，Cys-113 AJ278627
烟草 Nicotiana tabacum NtPCS1 4+208+289=501 (54.98) 12 Cys-56，Cys-90/91,Cys-109，Cys-113 AY235426
马铃薯
Solanum tuberosum
StPCS1 4+208+291=503 (55.65) 11 Cys-56，Cys-90/91,Cys-109，Cys-113 AJ548471
大豆 Glycine max GmPCS1 4+208+286=498 (55.07) 12 Cys-56，Cys-90/91,Cys-109，Cys-113 AF411075
百脉根 Lotus japonicus LjPCS1 4+208+289=501 (55.53) 14 Cys-56，Cys-90/91,Cys-109，Cys-113 AY633847
苣荬菜 Sonchus arvensis SaPCS1 4+208+279=491 (54.33) 10 Cys-56，Cys-90/91,Cys-109，Cys-113 GQ372840
莴苣 Lactuca sativa LsPCS1 4+208+278=490 (54.32) 9 Cys-56，Cys-90/91,Cys-109，Cys-113 AY618896
豆梨 Pyrus calleryana PcPCS1 4+208+285=497 (54.77) 12 Cys-56，Cys-90/91,Cys-109，Cys-113 本研究获得
注：N：N 端；B：保守区；C：C 端可变区；T：总氨基酸残基数；M：预测的相对分子质量/kD；Cys：可变区半胱氨酸残基数。
Note: N，N-terminal domain；B，Conserved region；C，C-terminal variable domain；T，Total amino acid residues number；M，Predicted relative
molecular quality/kD；Cys，Cys residues number in variable domain.

886 园 艺 学 报 37 卷
利用 DNAMAN 软件进行多重比对（Multiple alignment）的结果表明，不同 PCS1 蛋白的氨基端
氨基酸比较保守，羧基端氨基酸组成呈现多样性变化；PcPCS1 与百脉根和大豆的 PCS1 蛋白间有较
高的同源性，分别为 84%和 83%（图 3）。

图 3 PcPCS1推测的氨基酸与其它植物PCS1蛋白序列比对
缩写和序列号：AtPCS1（拟南芥，AAD41794）；BjPCS1（芥菜，CAC37692）；GmPCS1（大豆，AAL78384）；
LjPCS1（百脉根，AAT80342）；LsPCS1（莴苣，AAU93349）；NtPCS1（烟草，AAO74500）；
PcPCS1（豆梨，本研究获得）；SaPCS1（苣荬菜，ACU44656）；StPCS1（马铃薯，CAD68109）。
Fig. 3 Alignment of PcPCS1 deduced amino acid sequence and several other plants PCS1 proteins
Abbreviations and GenBank accession numbers：AtPCS1 (Arabidopsis thaliana，AAD41794)；BjPCS1 (Brassica juncea，CAC37692)；
GmPCS1 (Glycine max，AAL78384)；LjPCS1 (Lotus japonicus，AAT80342)；LsPCS1 (Lactuca sativa，AAU93349)；
NtPCS1 (Nicotiana tabacum，AAO74500)；PcPCS1 (Pyrus calleryana，obtained from this research)；
SaPCS1 (Sonchus arvensis，ACU44656)；StPCS1 (Solanum tuberosum，CAD68109).
6 期 李 慧等：豆梨植物络合素合酶 PcPCS1 基因克隆及其表达分析 887
植物络合素合酶（PCS1 蛋白）无根系统进化树如图 4，来自同一科生物的不同 PCS1 蛋白位于
分子进化树的相同分支上，而蔷薇科植物豆梨 PcPCS1 蛋白与豆科植物的该类蛋白聚为一类，与百
脉根 LjPCS1 蛋白亲缘关系最近。

图 4 蓝藻，真菌，植物和线虫的PCS1蛋白系统进化树
缩写和GenBank序列号：Asat（大蒜，AAO13809）；Atha（拟南芥，AAD41794）；Ayok（禾杆蹄盖蕨，BAB64932）；
Bjun（芥菜，CAC37692）；Cdac（狗牙根，AF384111）；Cele（线虫，NP001122616）；Gmax（大豆，AAL78384）；
Ljap（百脉根，AAT80342）；Lsat（莴苣，AAU93349）；Npun（念珠藻，ACC81212）；
Ntab（烟草，AAO74500）；Osat（水稻，AAO13349）；Pcal（豆梨，本研究获得）；
Pmar（原绿球藻，NP894844）；Sarv（苣荬菜，ACU44656）；Spom（裂殖酵母，CAA92263）；
Stub（马铃薯，CAD68109）；Taes（小麦，AAD50592）；
Tjap（遏蓝菜，BAB93119）；Tlat（香蒲，AAG22095）。
Fig. 4 Phylogenetic analysis of PCS1 proteins from cyanobacteria，fungi，plants，and nematodes
Abbreviations and GenBank accession numbers：Asat (Allium sativum，AAO13809)；Atha (Arabidopsis thaliana，AAD41794)；
Ayok (Athyrium yokoscense，BAB64932)；Bjun (Brassica juncea，CAC37692)；Cdac (Cynodon dactylon，AF384111)；
Cele (Caenorhabditis elegans，NP001122616)；Gmax (Glycine max，AAL78384)；Ljap (Lotus japonicus，AAT80342)；
Lsat (Lactuca sativa，AAU93349)；Npun (Nostoc punctiforme，ACC81212)；Ntab (Nicotiana tabacum，AAO74500)；
Osat (Oryza sativa，AAO13349)；Pcal (Pyrus calleryana，obtained from this research)；
Pmar (Prochlorococcus marinus，NP894844)；Sarv (Sonchus arvensis，ACU44656)；
Spom (Schizosaccharomyces pombe，CAA92263)；Stub (Solanum tuberosum，CAD68109)；
Taes (Triticum aestivum,AAD50592)；Tjap (Thlaspi japonicum，
BAB93119)；Tlat (Typha latifolia，AAG22095).

PcPCS1基因所编码蛋白的同源性比对结果显示它具有两个典型的植物络合素亚家族结构域（图
5），该结构域是 PCS 蛋白的特征结构。在 http://swissmodel.expasy.org 上利用 Automatic Modelling
Mode 预测了豆梨 PcPCS1 蛋白的三维结构，同时与拟南芥 AtPCS1 蛋白和百脉根 LjPCS1 蛋白的三
维结构进行比较，发现这 3 个蛋白具备类似的空间构架，估计它们在生物体中行使相似功能（图 6）。
通过 http://www.ebi.ac.uk/InterProScan 寻找 PCS1 蛋白在不同物种中的分布，发现该类蛋白普遍
存在于蓝藻、真菌、植物和线虫体内，证明植物络合素合酶催化合成植物络合素是不同物种共同拥
有的生物途径。
上述结果表明，本研究中所克隆 PcPCS1 基因的氨基酸序列特征表明了它所编码的蛋白为植物
络合素合酶。

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图 5 PcPCS1 基因所编码蛋白的 Blast 结果
Fig. 5 Blast result of PcPCS1 coding protein
图 6 PCS1 蛋白三维结构预测
Fig. 6 The prediction of PCS1 protein 3D structure

2.3 PcPCS1 的组织表达特点
正常生长条件下，PcPCS1基因在豆梨的根和叶中都有表达，其中根中的相对表达量较高；外加
20 mol · L-1 CdSO4处理 24 h后，该基因在根和叶中的相对表达量显著增加，分别提高了 2.24 和
11.77 倍（图 7）。外加 20 mol · L-1 CdSO4、CuSO4或 ZnSO4处理 24 h 后，豆梨根中PcPCS1基
因相对表达量均得到提高，增加幅度分别为 224.13%、59.33%和 71.73%；加入 200 mol · L-1 γ–
谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁胱亚磺酰亚胺（BSO）能够显著抑制该基因的表达，相对表达量比
单一重金属处理减少了 84.26%、87.88%和 85.95%；补充 200 mol · L-1 谷胱甘肽（GSH）后，其
相对表达量恢复或超过单一重金属处理的表达水平（图 8）。以上结果说明PcPCS1基因在豆梨中为
组成型表达，各器官表达量间存在差异，BSO 和 GSH分别为该基因的抑制剂和促进剂，不同重金
属对其相对表达量的诱导能力为Cd2+ > Zn2+ > Cu2+。
图 7 荧光定量 PCR 检测 PcPCS1 基因在豆梨组织中的表达
试验重复3次, 标准误差在图中标出。
Fig. 7 Expression of PcPCS1 gene in different tissues from Pyrus
calleryana by fluorescent quantitative RT-PCR
Each experiment was repeated three times and standard error was
pointed with bars in diagram.
图 8 荧光定量 PCR 检测 PcPCS1 基因在各处理豆梨根中的表达
试验重复3次, 标准误差在图中标出。
Fig. 8 Expression of PcPCS1 gene in different treatment root
from Pyrus calleryana by fluorescent quantitative RT-PCR
Each experiment was repeated three times and standard error was
pointed with bars in diagram.
6 期 李 慧等：豆梨植物络合素合酶 PcPCS1 基因克隆及其表达分析 889
3 讨论
Cys残基的位置和排列方式（特别是N末端区域）对植物络合素合酶蛋白活性和镉耐受能力非常
重要（Cobbett & Goldsbrough，2002；Ruotolo et al.，2004；Rea，2006）。Cys-56 残基存在于所有
已知植物络合素合酶中，它对植物络合素合成的活性必不可少，并且是Cd2+酰基化的第一个位点
（Clemens，2006）；LjPCS1 蛋白包含 3 个活性必需的氨基酸（Cys-56，His-162 和Asp-182），它
们组成催化三联体来起作用（Ramos et al.，2007）。同样，AtPCS1 蛋白（Ha et al.，1999）和本研
究获得的PcPCS1 基因所编码蛋白也含有这 3 个特异氨基酸位点。Cys 残基丰富的C末端在螯合重金
属离子过程中的作用也得到了试验证明，Cys358、Cys359、Cys363 和 Cys366点突变后的AtPCS1 蛋白，
在Cd2+ 或Zn2+存在条件下，植物络合素合成能力下降，而Cu2+处理反而促进突变体植物络合素合成
（Vestergaard et al.，2008）。上述 4 个位点Cys残基的同时缺失会导致植物络合素合酶的特异性改
变，即C358C359XXXC363XXC366基序为植物络合素合酶的重金属离子传感器（Vestergaard et al.，2008）。
而该模式在LjPCS1 和PcPCS1 蛋白中表现为C368C369RETC373MKC376和C369C370QETC374VKC377形式，
并且AtPCS1、LjPCS1 和PcPCS1 蛋白质预测的三维结构非常相似（图 6），因此认为这 3 个蛋白可
能在生物体内行使类似的功能。LjPCS1 和AtPCS1 在酵母中表达，能够提高Cd耐受能力(Ramos et al.，
2007)，拟南芥AtPCS1 缺失体对镉高度敏感（Ha et al.，1999），说明该基因在镉的螯合解毒过程起
重要作用。但是在不同植物中异源表达AtPCS1 却获得多样表型：镉积累和忍耐能力同时提高
（Pomponi et al.，2006）；镉积累能力不变，但是镉耐受能力下降（Wojas et al.，2008）；镉积累
能力下降镉耐受能力增强或不变（Gasic & Korban，2007a，2007b）。因此构建了PcPCS1 基因的正
义和反义表达载体，将进一步通过转基因验证该基因在豆梨中的生理功能。
对裂殖酵母和拟南芥的研究发现，植物络合素的合成途经如下：谷氨酰 + 半胱氨酸①→γ–谷
氨酰半胱氨酸②→谷胱甘肽③→植物络合素，①、②、③分别为γ–谷氨酰半胱氨酸合成酶，谷胱甘
肽合成酶和植物络合素合酶（Cobbett，2000）。而豆梨的植物络合素合酶基因表达水平受到γ–谷氨
酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁胱亚磺酰亚胺（BSO）的明显抑制，外加谷胱甘肽（GSH）后，抑制作
用解除，该基因恢复或超过单一重金属处理的表达水平（图 8），这一现象说明豆梨植物络合素合成
途经与裂殖酵母和拟南芥类似，但是仍需构建突变体来加以进一步证实。
无论Cd2+ 是否存在，不同植物的PCS1基因（如AtPCS1、BjPCS1、LsPCS1）在根部的表达丰度
均显著高于叶片组织（Ha et al.，1999；Heiss et al.，2003；He et al.，2005）。与此类似的是，在正
常生长情况下，豆梨PcPCS1基因表达丰度为：根 > 叶；但是外加20 mol · L-1 CdSO4处理 24 h后，
该基因在叶中的相对表达量增加幅度远远大于根（图 7）。造成这一现象的可能原因是在水培条件
下，豆梨根部吸收了大部分的Cd2+（597.36 mg · kg-1），但其叶片也积累了相当部分Cd2+（18.06
mg · kg-1），对叶片中镉离子螯合解毒的需要促使PcPCS1基因表达丰度迅速上调。
本试验结果表明：外加 20 mol · L-1 CdSO4、CuSO4或 ZnSO4处理24 h后，豆梨根中PcPCS1
基因相对表达量均有提高，诱导能力为：Cd2+ > Zn2+ > Cu2+，即在相同处理浓度和处理时间条件下，
植物非必需金属元素Cd2+对植物络合素合酶基因在转录水平上的表达调控能力远大于植物必需金属
元素Cu2+和Zn2+，这与它们在体外对麦瓶草植物络合素合酶的激活能力相一致（Grill et al.，1989）。

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