全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（12）：2395–2400 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–09–02；修回日期：2011–11–24
基金项目：广东省科技计划项目（2009B020310015，2009B030803055）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hehong893@163.com）
马拉巴栗疫病病原的分离与鉴定
李 琳，陈鸿宇，柳 凤，何 红*，余 莎
（广东海洋大学农学院，广东湛江 524088）
摘 要：2008—2009 年，从广东省湛江等地采集疑似疫病的马拉巴栗病株，经病原菌分离及柯赫氏
法则验证，证明其病原菌是疫霉菌。通过致病性、寄主范围测定，菌体形态，培养特性及 rDNA-ITS 序列
分析等，将该病原菌初步鉴定为棕榈疫霉（Phytophthora palmivora）。
关键词：马拉巴栗；棕榈疫霉；疫病；分离；鉴定
中图分类号：S 68 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）12-2395-06

Isolation and Identification of the Pathogen Causing Phytophthora Blight
of Pachira macrocarpa
LI Lin，CHEN Hong-yu，LIU Feng，HE Hong*，and YU Sha
（College of Agriculture，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）
Abstract：The diseased plants of Pachira macrocarpa showing symptoms of phytophthora blight
were collected from Zhanjiang，Guangdong Province from 2008 to 2009. This study proved that the
pathogen was a kind of fungus by test of Koch’s postulates. The pathogenic fungus was identified as
Phytophthora palmivora based on pathogenicity and morphology，host range and sequence analysis of
rDNA-ITS.
Key words：Pachira macrocarpa；Phytophthora palmivora；phytophthora blight；isolation；
identification

马拉巴栗（Pachira macrocarpa）俗称发财树、美国花生、中美木棉，原产热带美洲，是一种室
内绿化观赏树木。近年来随着需求量增加，马拉巴栗在中国广东、海南、广西等地的种植面积不断
扩大，病害发生也越来越严重。
马拉巴栗的病害有茎部腐烂病（章桂明和麦瑞生，1992；冯家望 等，1997；李一农和陈雪娇，
1997；习平根 等，2000；尚巧霞 等，2004；谭志琼 等，2009）和根褐腐病（Ann et al.，2002）等，
马拉巴栗疫病为各种植区严重发生的病害之一。根据本实验室 2008—2009 年在广东种植区调查发
现，马拉巴栗疫病发病率高达 30% ~ 40%，若遇到台风或暴风雨天气，病害发生更为严重。但有关
马拉巴栗疫病的病原菌目前尚未见报道。
本研究中对马拉巴栗疫病病原菌进行了鉴定，旨在为进一步研究病害的发生规律，防治措施等
提供依据。

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1 材料与方法
1.1 病原菌的分离与培养
2008—2009 年从广东湛江等地马拉巴栗苗圃中采集疑似疫病的病株，立即带回实验室用组织分
离法（方中达，1998）对其病原菌进行分离。分离用培养基为 PDA 培养基（马铃薯 200 g，葡萄糖
20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL）和 NA 培养基（蛋白胨 10 g，牛肉浸膏 5 g，氯化钠 5 g，琼脂
20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.2 ~ 7.5）。长出的菌落纯化后，保存备用。
1.2 病原菌致病性与寄主范围测定
1.2.1 致病性测定
取健康无病 6 ~ 8 叶期的马拉巴栗苗移植于装有灭菌土的圆盆钵（160 mm × 220 mm）中常规管
理备用。接种测定时用大头针分别刺伤叶片和苗茎基部，用内径为 8 mm 的打孔器提取 PDA 培养基
上的菌丝块，接种于伤口处（方中达，1998），立即用无菌水湿棉球保湿，以接种无菌水为对照，
室温下保湿培育，逐日观察发病情况，待发病后从病部再次分离病原菌。
1.2.2 寄主范围测定
供试植物为狗尾草（Setaria viridis）、巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）、柑橘（Citrus reticulata）、
灰藜（Chenopodium album）、杧果（Mangifera indica）、马蹄莲（Zantedeschia aethiopica）、美丽
针葵（Phoenix roebelenii）、肿柄菊（Tithonia diversifolia）、木瓜（Chaenomeles sinensis）、万年
青（Rohdea japonica）、富贵竹（Dracaena sanderiana）等 11 科 11 种植物。接种方法同上。
1.3 病原菌形态观察
供试菌株在 PDA 平板上 28 ℃下黑暗培养 3 d 后用孔径 5 mm 打孔器在菌落边缘取菌丝块接种
在 PDA 平板中央，每处理 5 次重复，28 ℃恒温培养 5 d，观察菌落形态，在显微镜下观察菌丝特征。
孢子囊的诱导采用平板培养光照法：将在 PDA 平板上生长 5 ~ 7 d 的供试菌株培养物置于日光
灯下连续培养 4 ~ 7 d，显微镜下观测培养基表面产生的孢子囊和厚垣孢子的形态和大小。
以 OMA（燕麦片 30 g，60 ℃水浴 2 h，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL）为基础培养基，分别取供
试菌株和南京农业大学王源超教授提供的疫霉菌 A1 和 A2 交配型标准菌株菌丝块（4 mm × 4 mm），
配对培养（两菌丝块距离约 4 cm），28 ℃下培养 10 ~ 15 d。在显微镜下观察菌落交界处是否产生
卵孢子，并观测卵孢子的形态和大小（郑小波，1997）。
1.4 rDNA-ITS 序列分析及系统发育树的构建
将供试菌株接种于 PDB（马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水 1 000 mL）液体培养基中，于 25
℃下培养 2 ~ 3 d 后收集菌丝，采用简化 CTAB 法（白占兵 等，2009）提取菌株的基因组总 DNA。
采用引物 ITS5/ITS4（程颖慧 等，2009）扩增病菌 rDNA 的 ITS 片段，引物序列为：ITS5（5′-GGAA
GTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR 反应体系为
25 μL，包括 10 × PCR buffer 2.5 μL，2 mmol · L-1 dNTPs 2 μL，10 pmol · μL-1 的 ITS5 和 ITS4 引物各
1 μL，5 U · μL-1 Taq 酶（含 MgCl2）0.5 μL，模板 DNA 1.5 μL，ddH2O 16.5 μL。
PCR 扩增反应程序为：95 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，
35 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送大连宝生物工程有
限公司进行序列测定。
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将供试菌株的 rDNA-ITS 序列在 NCBI 网站上用 BLAST 软件进行同源性比对，下载同源序列，
用 DNAMAN 软件保存所有待分析的序列，用 MEGA 4.0（molecular evolutionary genetics analysis）
软件将病原菌 rDNA-ITS 序列与下载的同源序列进行比对，并用邻接法（neighbor-joining，NJ）
（Tamura et al.，2007）构建系统发育树，自举法（bootstrap）（Singh & Xie，2010）对系统发育树
进行检验，1 000 次重复。
2 结果与分析
2.1 病害症状及病原菌的致病性
马拉巴栗疫病主要危害叶片和茎基部（图 1，A、B），叶片发病时，初期在叶片边缘或中央出
现水渍状暗褐色小点，之后病斑扩展呈灰褐色大病斑，病斑的病健交界不明显，湿度大时病斑可扩
展至全叶，并在病部可见大量的灰白色霉层（病菌菌丝体及孢子囊），致使叶片大量脱落。茎基部
发病时，初期在茎基部出现水渍状暗褐色小点，之后病斑上下扩展至整个茎基部呈灰褐色大病斑，
剖开病茎，其木质部呈黑褐色棉絮状腐烂，导致全株萎蔫死亡。
用常规组织分离法从病部分离纯化病原菌，多次分离结果均只出现菌物菌株，未出现细菌，表
明马拉巴栗疫病的病原可能是菌物。根据菌落形态或色素产生情况等基本特征的判断，获得镰刀菌
（Fusarium sp.）、疫霉菌（Phytophthora sp.）和丝核菌（Rhizoctonia sp.）3 种类型菌物菌株，分别
选取代表菌株，编号为 P1、P2、P3。将分离得到的菌株分别回接到马拉巴栗幼苗上，结果显示，接
种疫霉菌的处理均可引起健康马拉巴栗植株发病，接种后 5 ~ 7 d 出现明显症状，且病斑症状与田间
病斑症状基本相似，并从发病后的植株上再次分离到相同的疫霉菌菌落，而接种其余两种菌落处理
未发病，根据柯赫氏法则，表明引起马拉巴栗疫病的病原菌为疫霉菌。为此本研究中以疫霉菌 P2
菌株为代表，对其种类进行了鉴定。
2.2 寄主范围测定
盆栽接种测定结果（表 1）表明，供试病原菌物可侵染马蹄莲、木瓜、万年青、狗尾草、巴西
橡胶树、柑橘、杧果等植物，并引起灰褐色病斑，病部表面出现霜状霉层、茎溃疡等症状，而不侵
染富贵竹。测定中还发现，病原菌物可侵染肿柄菊、灰藜、美丽针葵，但不表现病害症状。表明该
病原菌可侵染多种植物，其寄主范围较广（表 1）。

表 1 供试菌株的寄主范围测定结果
Table 1 The host range of pathogenic fungi P2
接种植物 Inoculated plant 分类地位 Taxonomic statue 发病情况 Pathogenicity
马蹄莲 Zantedeschia aethiopica 天南星科 Araceae +
肿柄菊 Tithonia diversifolia 菊科 Asteracea –+
木瓜 Chaenomeles sinensis 蔷薇科 Rosaceae +
万年青 Rohdea japonica 假叶树科 Ruscaceae +
富贵竹 Dracaena sanderiana 龙舌兰科 Agavaceae –
狗尾草 Setaria viridis 禾本科 Poaceae +
巴西橡胶树 Hevea brasiliensis 大戟科 Euphorbiaceae +
柑橘 Citrus reticulata 芸香科 Rutaceae +
灰藜 Chenopodium album 藜科 Chenopodiaceae –+
杧果 Mangifera indica 漆树科 Anacardiaceae +
美丽针葵 Phoenix roebelenii 棕榈科 Palmae –+
注：“+”表示发病，“–”表示不发病，“–+”表示侵染但不表现症状。
Note：“+” indicates having pathogenicity；“–”indicates no pathogenicity；“–+”infection but no disease signs.
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图 2 供试菌株 P2 的 rDNA-ITS 区段 PCR 扩增凝胶电泳图
Fig. 2 The electrophoresis of ITS PCR for the strain P2
2.3 病原菌鉴定
2.3.1 病原菌的形态特征
将供试菌株接种在 PDA 培养基平板上，28 ℃培养 5 d 后进行观测。结果表明，分离获得的菌
株在 PDA 平板上菌落呈现白色，气生菌丝中等旺盛；显微镜下观察，菌丝无隔，粗细均匀，宽度
2.0 ~ 5.6 μm，未见菌丝膨大体（图 1，C、D）。
供试菌株孢囊梗简单合轴分枝，孢子囊大多数倒梨形，少数呈椭圆形或卵圆形，乳突明显；孢
子囊大小差异较大，长 29 ~ 58 μm，宽 15 ~ 40 μm，长宽比大于 1.6。厚垣孢子大量，顶生或间生，
球形，淡褐色，直径 25 ~ 40 μm（图 1，E ~ G）。
供试菌株为异宗配合，在 OMA 固体培养基上可产生大量卵孢子，藏卵器球形，直径 24 ~ 30 μm。
卵孢子蜜黄色，球形，近满器，直径 20 ~ 28 μm。雄器球形或椭圆形，围生（图 1，H）。
综上，分离的病原菌株形态特征与郑小波（1997）描述的 Phytophthora palmivora 基本相同，可
初步认为马拉巴栗疫病的病原菌为棕桐疫霉。



图 1 马拉巴栗感染疫病的症状及供试菌株的形态特征
A：根；B：叶；C：菌落形态；D：菌丝；E、F：厚垣孢子；G：孢子囊（乳突和排孢孔）；H：卵孢子，藏卵器和雄器。
Fig. 1 The symptom of phytophthora blight from Pachira macrocarpa and the morphological characteristics of the strain
A：Root；B：Leaf；C：The colony morphology；D：Mycelium；
E，F：Chlamydospore；G：Sporangia；H：Oospore.

2.3.2 病原菌 rDNA-ITS序列测定及系统发育树构建
以供试菌株 P2 基因组 DNA 为模板，用引
物 ITS4/ITS5 扩增到约 800 ~ 900 bp 的 DNA 序
列（图 2），经纯化、测序得供试菌株 rDNA-ITS
序列长度为 866 bp（GeneBank 登录号为
GQ924478）。
经 BLAST 分析，供试菌株 P2 的 ITS 序列
与疫霉菌（Phytophthora sp.）序列的同源性较
高。
选取其中相近种的 rDNA-ITS 序列，经
MEGA4.0 进行多序列对比并用 Neighbor-joining
法构造系统发育树（图 3）。结果表明，供试
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菌株 P2 与棕榈疫霉（P. palmivora）（GQ398157、GQ131800、FJ801259）ITS 序列的同源性达 99.87%，
结合供试菌株的形态特征和培养性状，将马拉巴栗疫病的病原菌鉴定为棕榈疫霉（P. palmivora）。


图 3 供试菌株 P2 与来自 GenBank 的 Phytophthora 属不同种的菌株 rDNA-ITS 序列构建的系统发育树
Fig. 3 The phylogenetic tree based on ITS sequences of Phytophthora strains
3 讨论
马拉巴栗茎部腐烂病在我国各种植区均有发生，关于其病原菌，现已报道的有可可毛色二孢菌
（Lasiodiplodia theobromae）（章桂明和麦瑞生，1992；冯家望 等，1997；李一农和陈雪娇，1997；
习平根 等，2000）、潮湿镰孢菌（Fusarium udum）和茄病镰孢菌（F. solani）（尚巧霞 等，2004）、
华丽腐霉菌（Pythium splendens）（谭志琼 等，2009）。本试验中采用常规组织分离法和柯赫氏法
则测定发现，引起马拉巴栗疫病的病原为病原菌物，进一步经形态特征观测及 rDNA-ITS 序列分析，
证明马拉巴栗疫病的病原为棕榈疫霉（Phytophthora palmivora）。由此可见，有多种病原菌可引起
马拉巴栗的茎部腐烂，这可能是在不同环境条件下其病原菌有所不同，对此在病害发病规律及防控
等相关研究中也应引起注意。
据报道，棕榈疫霉可侵染可可树、榴莲、面包树、凤梨、韭、木瓜、番木瓜、甜橙、咖啡、枇
杷、冬青卫矛、无花果、短筒倒挂金钟、橡胶树、杧果、泡桐属植物、柑橘属植物、鳄梨、蝴蝶兰、
胡椒、洋蒲桃、酸枣、芋、丝兰属植物（郑小波，1997；APPS，2008）。但目前国内外尚未见棕榈
疫霉侵染马拉巴栗的报道，有关该病害的发生规律、病害循环及其防控措施等有待进一步研究。

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