全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（3）：485–490
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–07–02；修回日期：2010–02–12
基金项目：国家自然科学基金项目（3057155）
* 通信作者 Author for correspondence (E-mail: ssli@sdau.edu.cn)
EST-SSR 标记在翦股颖上的通用性及其利用
赵 岩 1,2，孔凡美 1,2，王 涛 2，李斯深 1,*
（1 作物生物学国家重点实验室，山东农业大学农学院，山东泰安，271018；2 山东农业大学资源与环境学院，山东
泰安，271018）
摘 要：利用来自小麦、大麦、玉米、高粱、水稻的 1 058 对 EST-SSR 在翦股颖上进行扩增，得到
有效扩增引物 620 对（58.60%）。其中源于小麦、大麦、玉米、高粱、水稻的引物对数分别为 313（61.49%）、
30（63.83%）、101（51.53%）、11（35.48%）、165（60.00%）。进一步利用其中 53 个引物对，对 8 个翦股
颖品种进行了遗传多样性分析。有 51 对引物显示了多态性，占引物数的 94.34%；共检测到 368 个等位变
异，平均每对引物有 6.9 个等位变异；多态性信息指数（PIC）为 0.49 ~ 0.93，平均为 0.78；品种间遗传
相似系数为 0.48 ~ 0.86，平均为 0.72。聚类分析结果表明，在相似系数 0.75 处，8 个品种可明确的分为两
大类，第Ⅰ类为高地；第Ⅱ类又可分为两个亚类，Ⅱ-1 亚类由阿尔法、潘克劳斯、回旋组成，Ⅱ-2 亚类
由普特、L-93、开拓、A4 组成。
关键词：翦股颖；EST-SSR；通用性；遗传多样性
中图分类号：S 688.4 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）03-0485-06

Transferability of EST-SSR Markers on Bentgrasses and Its Application
ZHAO Yan1,2，KONG Fan-mei1,2，WANG Tao 2，and LI Si-shen1,*
(1 State Key Laboratory of Crop Biology/College of Agronomy，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong
271018，China；2 College of Resources and Environment，Shandong Agricultural University，Tai’an, Shandong 271018，
China)
Abstract: Bentgrass is a major cool season turfgrass. Few molecular markers have been developed
for bentgrass compared to field crops. In this study, 1 058 EST-SSR primer pairs developed by our lab
from wheat, barley, maize, sorghum and rice were screened on bentgrass. Of which, 620(58.60%) primer
pairs showed amplification. Effective primer pairs from wheat, barley, maize, sorghum and rice were 313
(61.49%), 30 (63.83%)，101 (51.53%)，11 (35.48%)，and 165 (60.00%), respectively. Furthermore, 53
EST-SSR primers were selected to investigate the genetic relationship of eight bentgrass cultivars, and 51
(94.34%) primer pairs showed polymorphism. In total, 368 alleles were found with an average of 2.69
alleles per primer. The PIC (polymorphism information content) for each polymorphic primer varied from
0.49 to 0.93, with an average of 0.78. The average genetic similarity coefficient (GS) among the eight
cultivars was 0.72(ranged from 0.48 to 0.86). Clustering analysis indicated that the eight bentgrass
cultivars were clustered into two groups based on 0.75 of GS. GroupⅠconsists only Highland, group Ⅱ
includes the others, which could be divided into two subgroups based on 0.80 of GS. The sub-group Ⅱ-1

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includes Alpha, Penncross and Blackspin, The sub-group Ⅱ-2 includes Putter, L-93, Cato and Penn A4.
Key words：bentgrass；EST-SSR；transferability；genetic diversity

翦股颖（Agrostis L.）属禾本科（Poaceae）早熟禾亚科（Pooideae），是重要冷季型草坪草之一，
世界上有 220 余种，中国有 29 种、10 个变种。其中匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera L.）、细弱翦股
颖（Agrostis tennis L.）和绒毛翦股颖（Agrostis cannina L.）因其在强刈割下能产生致密的草皮而作
为草坪草被广泛应用于高尔夫球场和园林绿地草坪等（Warnker et al.，1997）。
EST-SSR 是近年发展起来的基于 EST（expressed sequence tags）的新型分子标记。与基因组 SSR
相比，EST-SSR 能为功能基因提供“绝对”标记，开发成本低，物种间通用性高（Chen et al.，2005；
Zhang et al.，2006）。目前小麦（Li et al.，2008）、大麦（Thiel et al.，2003）、白菜（忻雅 等，2006）、
百合（杨素丽 等，2008）、高羊茅（Saha et al.，2004）、三叶草（Barrett et al.，2004）等的 EST-SSR
标记已被开发，但在翦股颖资源研究中还未见报道。
截止 2010 年 2 月 6 日，NCBI 中注册的翦股颖EST 仅为 21 656 条（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites），
难以直接从其中开发大量的 EST-SSR 标记。本研究中利用来自小麦、大麦、玉米、高粱、水稻的
EST-SSR，检测其在翦股颖上的通用性，为翦股颖提供新的分子标记，进一步利用这些新标记分析
翦股颖常见品种间的亲缘关系。
6B1 材料与方法
9B1.1 植物材料
EST-SSR 标记通用性研究所用的翦股颖品种为普特；亲缘关系分析所用翦股颖属植物共 8 个品
种，包括细弱翦股颖（A. tennis L.）高地，匍匐翦股颖（A. stolonifera L.）阿尔法、潘克劳斯、回旋、
普特、L-93、A4 和开拓。
1.2 EST-SSR引物
1 058 对 EST-SSR 引物为本实验室开发（Chen et al.，2005；Li et al.，2008），由上海生工生物
技术工程有限公司合成，其中来自小麦、大麦、水稻、高粱、玉米的引物分别为 509、47、275、31
和 196 对。
1.3 PCR扩增与电泳检测
基因组总 DNA 的提取按照 Sharp 等（1998）提出的方法。PCR 反应体系为（20 μL）：1×缓冲
液，1.5 mmol · L-1 MgCl2，0.1 mmol · L-1 dNTPs，500 nmol · L-1 引物，1 U Taq 酶，60 ng DNA 模板。
反应在 Biometra 公司的 T-Gradient 型 PCR 扩增仪上进行。反应程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变
性 1 min，50 ~ 65 ℃复性 45 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环；72 ℃延伸 5 min。产物用 4.5%的脲变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳。DNA marker 为 pBR322。
1.4 数据统计及分析
以扩增条带在相对迁移位置的有无，赋以“1”或“0”，生成分子数据矩阵。根据 Botstein 等（1980）
的方法计算多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）：
用 NTSYS pc V2.10 软件计算品种间遗传相似系数（GS）和遗传距离（GDij，欧氏距离），根
据 GS 值以不加权成对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析。
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2 结果与分析
2.1 EST-SSR在翦股颖上的通用性
共用 1 058 对 EST-SSR 引物对翦股颖进行了检测，有 620 个引物对（58.60%）能扩增出稳定清
晰带型。其中，源于小麦、大麦、玉米、高粱和水稻的引物对数及有效扩增比例分别为 313（61.49%）、
30（63.83%）、101（51.53%）、11（35.48%）和 165（60.00%）。通用性高低依次为：大麦、小麦、
水稻、玉米、高粱（表 1）。
620 对 EST-SSR 引物在翦股颖中共扩增出 1 447 条清晰带，单个引物对最高扩增带 6 条，平均
2.33 条，扩增片段大小 80 ~ 800 bp。其中，源于高粱、大麦、玉米、小麦和水稻的 EST-SSR 引物平
均扩增条带数分别为 2.64、2.63、2.50、2.32 和 2.19。从 EST-SSR 引物的核苷酸重复数来看（表 2），
以二核苷酸重复的 EST-SSR 引物扩增率最高，为 60.99%，五核苷酸重复的 EST-SSR 引物扩增率最
低，为 53.88%，两者相差 7.11 个百分点。

表 1 不同作物 EST-SSR 标记在翦股颖中的 PCR 扩增结果
Table 1 PCR amplification results of EST-SSR markers derived from different crops in bentgrass
来源作物
Origin crops

引物数
Number of
primer pairs
有效引物数
Number of effective
primer pairs
百分比/%
Percentage

扩增片段长/bp
Sizes of amplificated
fragments
最高扩增带数
Number max amplificated
bands
平均扩增带数
Average of
amplificated bands
小麦 Wheat 509 313 61.49 80~800 6 2.32
大麦 Barley 47 30 63.83 80~620 6 2.63
玉米 Maize 196 101 51.53 120~700 6 2.50
高粱 Sorghum 31 11 35.48 90~650 6 2.64
水稻 Rice 275 165 60.00 105~650 6 2.19
总计 Total 1058 620 58.60 80~800 6 2.30

表 2 不同核苷酸重复 EST-SSR 的 PCR 扩增结果
Table 2 PCR amplification results of EST-SSR markers with different motif in bentgrass
核苷酸重复类型
Motifs of EST-SSR markers
引物数
Number of primer pairs
有效引物数
Number of effective primer pairs
百分数/%
Percentage
平均带数
Average
二核苷酸 Dinucleotide 182 111 60.99 2.32
三核苷酸 Trinucleotide 530 313 59.05 2.30
四核苷酸 Tetranucleotide 140 85 60.71 2.32
五核苷酸 Pentanucleotide 206 111 53.88 2.27
总计 Total 1058 620 58.60 2.30

2.2 基于EST-SSR的翦股颖亲缘关系分析
从 620 个有效扩增的 EST-SSR 引物对中随机挑选 53 对扩增带清晰、条带数较多的引物用于 8
个翦股颖品种的亲缘关系分析（图 1）。
53 对引物中，51 对引物表现多态性，多态性比率为 94.34%。共检测到 368 个等位变异，每对
引物检测出的等位变异数为 2~20，平均为 6.9 个等位变异。51 对有多态性引物的 PIC 值最高为 0.93，
最低为 0.49，平均为 0.78。根据这 51 对引物扩增产物的数据矩阵，计算出的 8 份供试材料间平均
遗传距离为 0.72，变化范围为 0.48～0.86。
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图 1 EST-SSR 引物在翦股颖中的扩增
M. 分子量标准；1. 阿尔法；2. 潘克劳斯；3. 回旋；4. 普特；5. 高地；
6. L-93；7. A4；8. 开拓。
Fig. 1 Amplification of EST-SSR primer on bentgrasses
M. Marker；1. Alpha；2. Penncross；3. Blackspin；4. Putter；5. Highland；
6. L-93；7. A4；8. Cato.

利用 NTSYS-PC 软件，使用 UPGMA 法构建了聚类树（图 2）。在相似系数为 0.75 水平可分为
两大类：Ⅰ类是细弱翦股颖 ‘高地’，Ⅱ类为匍匐翦股颖，由阿尔法、潘克劳斯、回旋、普特、L-93、
开拓和 A4 等 7 个品种组成。该类在相似系数 0.80 左右的水平上可进一步分为两个亚类，Ⅱ-1 亚类
由阿尔法、潘克劳斯、回旋组成；Ⅱ-2 亚类由普特、L-93、开拓、A4 组成。

图 2 基于 EST-SSR 标记的翦股颖品种聚类图
Fig. 2 Dendrogram of bentgrass cultivars based on EST-SSR markers
3 讨论
已有几种分子标记应用于翦股颖资源研究，如 RAPD 标记（Rajasekar et al.，2007）、RFLP 标
记（Caceres et al.，2000；Chakraborty et al.，2005）、AFLP 标记（Vergara et al.，2004；Zhao et al.，
2006）和 SRAP 标记（Dinler et al.，2008）等。但相对于大田作物，翦股颖标记数量还很少。本研
究中对小麦等 5 种作物的 EST-SSR 标记在翦股颖中的通用性进行了分析，在 1 058 对 EST-SSR 引物
中筛选出 620 对引物能在翦股颖中有效扩增，为翦股颖增加了新的分子标记。这些标记可以应用于
翦股颖的遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位、指纹图谱分析和标记辅助选择等。
前人研究表明 EST-SSR 标记在物种间通用性较高（Saha et al.，2004；Yu et al.，2004；Li et al.，
2008）。本研究中来自小麦、大麦、玉米、高粱、水稻的 1 058 对 EST-SSR 引物在翦股颖中有效扩
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增率都较高，平均为 58.60%，说明这 5 种作物的 EST-SSR 在翦股颖上有较好的通用性，这与其它
作物通用性研究结果一致。通用性研究结果证实了基于 EST 的 SSR 引物在物种之间的高保守性，
这启示我们利用水稻、小麦等大田作物已开发的大量的 EST-SSR 标记，在 EST 数据库中数量较少
的物种具有良好的前景。
翦股颖品种间遗传关系的信息有限，这一方面缘于翦股颖是异花授粉植物，另一方面因为许多
品种的亲本来源不清楚（Warnker et al.，1997；Caceres et al.，2000）。Rotter 等（2007）对翦股颖属
植物系统进化的研究也表明，翦股颖的驯化时间较短，存在广泛基因渐渗。从本试验结果来看，53
对引物中，51 对引物表现多态性，多态性比率为 94.34%，远远高于 Gupta 等（2003）检测面包小
麦多样性的结果（55%）和忻雅等（2006）检测白菜的结果（46.7%），这说明我们开发的 EST-SSR
标记能很好的用于翦股颖品种间亲缘关系分析。从基于 EST-SSR 分子标记的翦股颖品种聚类结果可
以看出，高地品种（细弱翦股颖）在形态上明显与其它材料（匍匐翦股颖）不同，其遗传距离也最
远，在聚类图上单独聚为一类，这和 Caceres 等（2000）利用 RFLP 分析翦股颖品种的亲缘关系研
究结果一致。另外 7 个品种分为两个亚类，每一亚类内的品种间可能存在较近的亲缘关系，我们所
得翦股颖亲缘关系可为其新品种选育和遗传学研究提供参考。

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