全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（12）：1953–1960
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–08–18；修回日期：2010–11–29
基金项目：中国博士后科学基金项目（20080440325）；‘十一五’国家科技支撑计划项目（2008BADB1B02，2009BADB8B03）；北京市
自然科学基金项目（6102012）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：kangjungen@nercv. org）
甘蓝 OguCMS 相关的花药优势表达转录因子
BoBHLH1 的克隆与表达分析
刘海霞 1,2，康俊根 1,*，颉建明 2，简元才 1，丁云花 1
（1 北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100097；2甘肃农业大学农学院，兰州 730070）
摘 要：以甘蓝 OguCMS 花药中下调表达的 EST 序列为信息探针，克隆到一个与甘蓝 OguCMS 相关
的 bHLH 家族转录因子，命名为 BoBHLH1（GenBank 登录号：GU390530），该基因编码 102 个氨基酸，
具有典型的 bHLH 结构域，可识别顺式元件 G-box 序列，预测该蛋白定位在线粒体上。荧光定量 RT-PCR
表明，BoBHLH1 是一个甘蓝花药中优势表达的基因，且在花药发育的早期和晚期均有一个表达高峰。研
究结果为下一步分析其在甘蓝花药发育过程中的功能验证及 OguCMS 核质互作机理奠定了基础。
关键词：甘蓝；OguCMS；基因克隆；bHLH 转录因子；时空表达
中图分类号：S 635 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）12-1953-08

Cloning and Expression of an OguCMS-related Anther-preferential
Transcription Factor in Brassica oleracea
LIU Hai-xia1,2，KANG Jun-gen1,*，XIE Jian-ming2，JIAN Yuan-cai1，and DING Yun-hua1
（1Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China；
2College of Agronomy，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）
Abstract：A new anther preferential bHLH transcription factor was cloned using a down-regulated
expression EST sequence as a querying probe. The gene as BoBHLH1（GenBank accession number：
GU390530）was designated. BoBHLH1 is a new member of bHLH transcription factors family related to
OguCMS and contains an 309 nt of continuous complete open reading frame（ORF）encoding a poly-
peptide of 102 amino acids. BoBHLH1 is preferentially expressed in cabbage anther and have two
expression peaks in early and late stages of anther development. The results provide new clues for further
understanding of the nuclear-cytoplasmic interaction mechanism of OguCMS.
Key words：cabbage；OguCMS；cloning；bHLH transcription factor

bHLH（The basic/helix-loop-helix family protein）转录因子是构成真核生物蛋白的一个大家族，
在动物和植物中都有十分重要的转录调控作用（Toledo-Ortiz et al.，2003；Carretero-Paulet et al.，
2010）。bHLH 核心结构域约含 60 个氨基酸，其中碱性区域能与 DNA 结合，识别不同形式的
CANNTG 核心序列；bHLH 区域由 α 螺旋 1–环–α 螺旋 2 组成，与其它相关蛋白互作形成同源或

1954 园 艺 学 报 37 卷
异源二聚体进行转录调控，环的长度在不同 bHLH 蛋白中存在差异。目前已在拟南芥和水稻基因组
序列中分别鉴定出 147 个和 167 个 bHLH 基因，但对这些转录因子的功能了解很少（Sorensen et al.，
2003；Li et al.，2006）。近年研究表明，这个家族的部分成员在植物花药发育过程中起着极为重要
的调控枢钮作用，通过激活或抑制一系列花药发育相关基因的时空特异性表达，保证植物花药的正
常发育。例如：拟南芥 AMS 基因编码一个绒毡层和小孢子表达的 bHLH 转录因子，其缺失突变体表
现为雄性不育，小孢子从四分体释放后在有丝分裂前很快退化（Sorensen et al.，2003）。另一个已经
克隆的雄性不育相关的 bHLH 转录因子是位于 AMS 上游的 DYT1，其在花药发育早期的绒毡层细胞
中优势表达，参与绒毡层细胞的发育（Zhang et al.，2006）。在水稻中又发现 1 个雄性不育相关的
bHLH 基因 TDR，证据表明 TDR 直接参与绒毡层发育和降解过程中 Cys 蛋白酶和蛋白酶抑制基因
Os CP1 和 Os c6 的转录调控，是绒毡层发育调控网络的关键基因（Li et al.，2006）。
OguCMS 是目前甘蓝中应用较广的雄性不育类型，其既是利用杂交优势进行品种改良的育种材
料，又是研究花药和花粉发育过程中核质互作的遗传特性的理想材料（方智远和孙培田，2001）。但
OguCMS 转育至不同遗传背景（同质异核）的甘蓝育种材料中时，往往表现不同的核质互作特征，
表现出生长势、畸形花及花蕾不同死亡程度的现象，造成其良种繁殖的困难，反应了其核质基因互
作的高度复杂性，因此，对甘蓝 OguCMS 机理的研究具有重要的理论意义和生产应用价值。
本研究在进行甘蓝 OguCMS 花药发育表达谱的研究过程中，得到 1 个 OguCMS 不育系花药中表
达的 EST 序列，以此为信息探针，采用电子克隆的策略，克隆到 1 个甘蓝 OguCMS 雄性不育相关的
bHLH 转录因子。继而对该基因 cDNA 及其编码的蛋白质序列以及在不同器官和花药发育时期的表
达特征进行分析，为进一步研究该基因在甘蓝花药发育过程中的作用及 OguCMS 核质互作机理奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以经过 8 代回交获得的甘蓝 OguCMS 不育系 358 和相应保持系 357 为试材，于 2007 年 11 月同
时定植于北京市农林科学院蔬菜研究中心阳畦，2008 年春季种株开花后，参照 Kang 等（2008）的
取样策略，分别用锡箔纸包好，立即投入液氮中固定，保存于–80 ℃冰箱中备用。该不育源于 1996
年从德国引进。
对于表达谱分析，分别取不育系 358 和相应保持系 357 的 3 个完整花序混合；对于组织特异性
表达分析，取保持系的根、茎、叶、花蕾、种荚；对于花器官不同部位表达分析，取保持系成熟花
蕾的花萼、花瓣、花柱、雄蕊；对于花药发育不同时期表达特征分析，将保持系整个花序按照花蕾
长度与发育时期的对应关系分成 S1 ~ S7 共 7 个时期后提取总 RNA。S1 ~ S7 花蕾长度分别为 0 ~ 1、
1 ~ 2、2 ~ 3、3 ~ 4、4 ~ 5、5 ~ 6、和大于 6 mm（已经开花或将要开花），分别对应于造孢细胞期至
花粉母细胞期（S1）、四分体期（S2），四分体至单核小孢子早期（S3）、单核小孢子早期至单核小
孢子晚期（S4）、单核小孢子晚期至双核花粉期（S5）、双核花粉期至三核花粉期（S6）、三核花粉
期至成熟花粉期（S7），长度与花药发育时期的对应关系由荧光显微镜下 DAPI（1 μg · mL-1）染色
观察的结果确定。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA的提取及反转录合成单链 cDNA
12 期 刘海霞等：甘蓝 OguCMS 相关的花药优势表达转录因子 BoBHLH1 的克隆与表达分析 1955

采用 Trizol（Invitrogen）提取甘蓝各组织和不同发育阶段的花粉总 RNA。具体操作参照说明书。
随后用 RNase Free DNase I（TaKaRa）处理总 RNA，去除残留的基因组 DNA，总 RNA 最后溶于 20
μL DEPC 水中。取 1 μL 总 RNA 用于 cDNA 合成，单链 cDNA 合成采用 Superscript II Transcriptase
（Invitrogen）和 poly-dT18 primer（TaKaRa）。
1.2.2 甘蓝 BoBHLH1转录因子的克隆
以甘蓝 OguCMS 花药下调表达的 EST 序列为探针，在 NCBI 的 EST 数据库中进行同源序列检
索，结果得到一系列高度相似并部分重叠的芸薹属作物 EST 序列，将这些 EST 拼接成一个 contig，
据此设计特异引物 BoBHLHFullF（5′-ATTATCCCTTGTCTAGACAACA-3′）和 BoBHLHFullR（5′-TT
TTCATTGATTTTCTTGTTTA-3′），分别在合成的甘蓝花药单链 cDNA 和甘蓝基因组 DNA 中进行扩
增。PCR 扩增反应体系：cDNA 或 DNA 模板 2 μL，10 × PCR 缓冲溶液 2 μL，特异引物（5 pmol · μL-1）
1 μL，2.5 mmol · L-1 dNTPs 1.6 μL，Taq 酶（2.5 U · μL-1）0.2 μL，加水到总体积 20 μL。反应程序：
94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，56 ℃ 复性 45 s，72 ℃延伸 75 s，共 36 个循环，72 ℃延伸
10 min。反应完毕后取 5 μL 于 2%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。回收目的基因 PCR 产物，克隆到
pEASY-T1 载体上，阳性克隆委托北京奥科生物技术有限公司测序。测序结果受信息探针完全支持，
序列经 BLAST 检索，确认所克隆序列为一个新的甘蓝 bHLH 转录因子，具有完整的开放阅读框，
命名为 BoBHLH1。
1.2.3 甘蓝 BoBHLH1基因编码蛋白质的序列分析
本研究中利用 DNASTAR 和 DNAMAN 软件分析 BoBHLH1 序列特征、开放阅读框、编码蛋白
质的氨基酸组成、理论分子量和等电点；在 NCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/guide/data-software/）
和 ExPASy Proteomics Server（http：//cn. expasy. org/tools/blast/）利用在线服务器及软件进行蛋白质
结构功能域、同源氨基酸序列比对以及生物信息学分析。
1.2.4 BoBHLH1基因的时空特异性表达特征分析
根据克隆到的 BoBHLH1 基因全长 cDNA 序列设计一对特异引物：BoBHLH1F：5′-GACAAA
ACAAAGAGCACGAAG-3′；BoBHLH1R：5′-GTCTAAAGAGTCCATCCAAACC-3′，扩增片段长度
236 bp。分别利用上述不同器官及不同发育时期的单链 cDNA 进行半定量 RT-PCR 和定量 PCR 表达
特征分析，用 5′-ATCGAGCACGGTATTGTAAGC-3′ 和 5′-CCCACTAGCGTAAAGAGAAAG-3′ 扩增
甘蓝 β-actin 作为内标。半定量 RT-PCR 反应程序：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，56 ℃复性
45 s，72 ℃延伸 45 s，共 28 个循环，72 ℃延伸 10 min。定量 PCR 反应总体系为 10 μL，包括 Real
Master Mix SYBR GreenⅠ（天根生化）4.5 μL，特异引物各 0.25 μL，cDNA 模板 1 μL，加水到 10 μL，
在 Light Cycler Roche 480 上采用 Light Cycler System 进行实时定量 PCR 反应。试验结果采用 2-△△Ct
方法来计算基因相对表达量（唐永凯和贾永义，2008）。
2 结果与分析
2.1 甘蓝 BoBHLH1 的 cDNA 和 DNA 序列的克隆与分析
以甘蓝 OguCMS 花药下调 6.4 倍（图 1，B）的 EST 序列为探针，在 GenBank 数据库中进行同
源序列检索，得到一系列部分重叠的 EST 序列，将这些 EST 拼接成一个 contig，再以此重叠群序
列反复进行拼接和比对，直至重叠群不能继续延伸。利用特异引物 BoBHLHFullF 和 BoBHLHFullR
分别进行 RT-PCR 扩增和基因组 DNA 扩增后均获得约 550 bp 的单一产物（图 1，A），经克隆测序，
其 cDNA 和 DNA 序列完全一致，不含内含子，长度为 552 bp，序列受信息探针完全支持，命名为
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BoBHLH1，GenBank 登录号为 GU390530。

图 1 BoBHLH 的克隆（A）及其在甘蓝 OguCMS 花药中下调表达特征（B）
1：DNA Marker；2：BoBHLH1全长cDNA；3：BoBHLH1基因组全长；
F：保持系357可育混合花蕾；S：OguCMS 358不育混合花蕾。
Fig. 1 Cloning（A）and down regulation of BoBHLH1 in OguCMS in cabbage anthers（B）
1：DNA marker；2：Full length cDNA of BoBHLH1；3：Genomic PCR product of
BoBHLH1；F：Anther of maintainer line 357；
S：Anther of OguCMS line 358.

BoBHLH1 包含一个完整的 309 bp 的开放阅读框（ORF），上下游分别有 75 bp 的 5′-UTR 和 166
bp 的 3′-UTR，编码 102 个氨基酸。起始密码子 ATG 上游–3 位核苷酸为 A，+ 4 位为 G，为典型的
Kozak 结构（Kozak，1992），3′-UTR 有加尾信号 AATGAA。预测其蛋白分子量约 11.84 Da，其中
包含有 22 个强碱性氨基酸（K、R），10 个酸性氨基酸（D、E），34 个疏水氨基酸（A、I、L、F、
W 和 V），21 个极性氨基酸（N、C、Q、S、T 和 Y），富含精氨酸 12.7%，亮氨酸 9.8%，缬氨酸 9.8%，
赖氨酸 8.8%，等电点为 10.75。经 SubLoc1.0（Hua & Sun，2001）（http：//www. Bioinfo. tsinghua. edu.
cn/SubLoc/）亚细胞定位分析，可以将该蛋白定位于线粒体上（RI = 2；预期精度 Expected Accuracy
= 74%）。在 NCBI 进行蛋白质结构域分析，发现该蛋白序列的 Ile31 ~ Glu83 区域含有典型的 bHLH 结
构域（图 2），第 31 ~ 46 氨基酸间为一个保守的碱性区域，第 47 ~ 83 氨基酸残基为两个 α 螺旋被一
个环隔断，为典型的 bHLH 家族转录因子特征。其碱性区域内第 5 位为保守的 Lys（K）、第 9 位为
Glu（E），第 13 位为 Arg（R）（图 2，图 3）。

图2 BoBHLH1基因cDNA全长序列及其推导的氨基酸序列
虚线处示引物结合区，方框示起始密码子，星号示终止密码子，加尾信号用黑体标出，下划实线表示从Ile31 到Glu83保守的bHLH结构域。
Fig. 2 The nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of BoBHLH1
The regions underscored with a dashed line correspond to primer sequences used for PCR .The initial codon is boxed and stop codon is indicated by
asterisk（*）. A putative polyadenylation signal is in bold. From Ile31 to Glu83 is the conserved bHLH domain which is underlined.

12 期 刘海霞等：甘蓝 OguCMS 相关的花药优势表达转录因子 BoBHLH1 的克隆与表达分析 1957



图 3 BoBHLH1及其同源蛋白的bHLH保守结构域比较
Fig. 3 Comparison of the bHLH domain of BoBHLH1 with other related proteins

2.2 甘蓝 BoBHLH1 与其他相关 bHLH 转录因子比较
利用 BoBHLH1 蛋白的保守结构域检索 NCBI，其与拟南芥 bHLH 转录因子第 14 亚组的
AtBHLH151 氨基酸序列有 87%的一致性，与毛果杨 bHLH Pt_B9I9G8、蓖麻 Rc_B9RNB4 和水稻
Os_A2Y0L7 分别有 49%、65%和 35%的相似性。目前在拟南芥中已经报道了 4 个可能与雄性不育相
关的 bHLH 家族转录因子：AMS、DYT1、AtBHLH089 和 AtBHLH091（Sorensen et al.，2003；Zhang
et al.，2006），另外在白菜中也克隆了 1 个可能与 OguCMS 相关的 bHLH 转录因子 BcBHLHogu（向
珣 等，2007）。为进一步分析这些基因之间的系统进化关系，下载了上述基因以及与 AtBHLH151
同属第 14 亚组的 AtBHLH147、AtBHLH149、AtBHLH150 的蛋白序列（Bailey et al.，2003），对这些
同源蛋白进行系统进化和保守结构域比较分析（图 3），结果表明，BoBHLH1 与同属第 14 亚组的
AtBHLH147、AtBHLH149、AtBHLH150 和 AtBHLH151 遗传距离较近，而与第 9 亚组的调控绒毡层
发育的AMS和DYT1距离较远，与BcBHLHogu遗传距离也较远（图 4）。因此可以推断甘蓝BoBHLH1
是拟南芥未知功能 bHLH 转录因子 AtBHLH151 的直系同源基因。
图 4 BoBHLH1 及其同源蛋白的 bHLH 家族蛋白系统进化分析
进化树分枝长度表示氨基酸变化率，Bootstrap重复1 000次。
Fig. 4 Phylogenic analysis of BoBHLH1-related homologous proteins
Bootstrap neighbor-joining phylogenic tree was constructed using DNAMAN and 1 000 replicates.
The length of the branches refers to the amino acid variation rates.
1958 园 艺 学 报 37 卷
2.3 甘蓝 BoBHLH1 的表达特异性分析
以 Actin 作为内参标定起始浓度为一致后，以可育系为材料利用 RT-PCR 及 Real-time RT-PCR
对 BoBHLH1 进行表达特征分析。结果表明（图 5，A），BoBHLH1 在花蕾中的表达丰度最高，而在
根、茎、叶、种荚等部位均不表达；在花不同器官中，雄蕊和花瓣中表达量较高，而在柱头和花萼
中均不表达。在处于不同发育时期的花蕾中，花药发育后期表达量较高。使用 Real-time RT-PCR 进
行进一步验证，试验结果基本吻合。其虽然在雄蕊和花瓣中均有表达，但在雄蕊中表达量为花瓣中
的 2 倍（图 5，C），证明 BoBHLH1 是一个甘蓝花药中优势表达的基因；此外，Real-time RT-PCR 还
检测到了一个半定量分析未检测到的花药发育早期 S1 的表达高峰（图 5，D）。
图 5 BoBHLH1 时空表达特征分析
A. BoBHLH1时空表达特征半定量RT-PCR分析；B. 组织特异性表达特征；C. 花不同器官表达特征；D. 不同发育时期表达特征。
S1：< 1 mm；S2：1 ~ 2 mm；S3：2 ~ 3 mm；S4：3 ~ 4 mm：S5：4 ~ 5 mm；S6：5 ~ 6 mm；S7：> 6 mm。
Fig. 5 Organ and spatial specific expression of BoBHLH1
A. RT-PCR expression of BoBHLH1 in different organs and developmental stages of Brassica oleracea；
B，C，D. Real time expression of BoBHLH1 in different organs and developmental stages of Brassica oleracea.
S1：Mostly sporogenous cell stage to pollen mother cell；S2：Mostly tetrad stage；S3：Mostly tetrad to early uninucleate microspore stage；
S4：Mostly early uninucleate microspore stage to late uninucleate microspore stage；S5：Mostly late uninucleate microspore stage to bicellular
pollen stage；S6：Mostly bicellular pollen to tricellular pollen stage；S7：Mostly tricellular pollen stage to mature pollen grain stage.
3 讨论
细胞质雄性不育已经成为发育生物学研究中探索质—核互作机理和反向信号通路（Retrograde
Signaling）的经典模型（Chase，2007）。目前在线粒体基因组中发现了至少 14 个导致雄性不育的开
放阅读框 orf，但由于核基因的高度复杂性，目前对于与线粒体基因互作导致花药败育的核基因的了
解仍很有限（Hanson & Bentolila，2004）。Carlsson 等（2007)）研究证明线粒体的异常可导致运输
至细胞器的蛋白和调控雄蕊分化的转录因子表达异常。笔者在利用基因芯片研究甘蓝 OguCMS 花药
发育表达谱过程中也发现 6.9%的转录因子表达异常，明显高于全基因组中转录因子的比例，说明大
量转录因子参与了花药发育过程中的回朔信号通路。BoBHLH1 在 OguCMS 不育系花药中下调达 6.4
倍（图 1，B），表明在 OguCMS 中 BoBHLH1 的正常表达受到了线粒体 orf138 的明显干扰。
12 期 刘海霞等：甘蓝 OguCMS 相关的花药优势表达转录因子 BoBHLH1 的克隆与表达分析 1959

目前研究表明，bHLH 转录因子家族部分成员通过激活或抑制一系列花药发育相关基因的时空
特异性表达，保证植物花药的正常发育。本试验克隆的 BoBHLH1 与拟南芥未知功能 bHLH 转录因
子 AtBHLH151 氨基酸序列有 87%的一致性，具有一个典型的 bHLH 结构域（图 3），其碱性结构域
内第 5 位、第 9 位和第 13 位分别为 Lys、Glu 和 Arg 残基，是典型的 5K-9E-13R 结构域（Atchley &
Fitch，1997）。约 60%的拟南芥 bHLH 家族蛋白具有类似的保守结构域，可识别经典的顺式元件
G-box（CACGTG)）序列（Toledo-Ortiz et al.，2003），推测 BoBHLH1 可能通过其 DNA-binding domain
直接结合在具 G-box 顺式元件的下游花药发育相关基因启动子上，以调控甘蓝花药的正常生长发育。
时空表达特征分析证明 BoBHLH1 是一个在甘蓝花药中优势表达的 OguCMS 相关基因。除花药
发育晚期的表达高峰外，荧光定量 PCR 还检测到了一个在半定量分析试验中未检测到的花药发育早
期表达高峰。实时荧光定量 PCR 是最近几年新发展起来的方法，具有准确和高灵敏度的特点（Wong
& Medrano，2005），有研究表明，荧光定量 PCR 比半定量 RT-PCR 或常规的基于分子杂交的方法如
Northern 杂交具有更高的准确性和灵敏度（Langmann et al.，2003），因此近年来在基因表达分析中
已经得到了越来越多的应用。本研究中利用半定量 RT-PCR 未能检测到 BoBHLH1 在花药发育早期
的表达高峰，原因可能是由于在本半定量试验中，为避免假阳性而只用了 28 个循环，而在荧光定量
PCR 中却可以通过实时监测整个 PCR 过程，直至扩增的平台期，从而得以检测出了花药发育早期
的表达高峰。
BoBHLH1 是拟南芥 bHLH 转录因子 AtBHLH151 的同源基因，推测其具有与 AtBHLH151 相似
的功能。AtBHLH151 是一个功能未知的 bHLH 转录因子，通过与 Alves-Ferreira 等（2007）发表的
拟南芥雄性不育基因 MS1 和 SPL 调控的基因芯片数据比较发现，AtBHLH151 可能位于 SPL 的下游
和 MS1 的上游，受茉莉酸诱导（Mandaokar et al.，2006）。目前研究表明，这个基因编码的 bHLH
转录因子可能定位于线粒体上（Elo et al.，2003），这个结果与本研究对 BoBHLH1 的定位亚细胞定
位预测一致。
各方面证据表明，BoBHLH1 可能是参与 OguCMS 花药发育过程中线粒体和细胞核互作的重要
枢钮之一，并且与 MS1 有相互调控的关系。后续对其功能的深入研究将为揭示甘蓝 OguCMS 核质
互作机制提供新的理论依据。

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