全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（6）：1139–1146 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–04–06；修回日期：2011–05–30
基金项目：国家‘863’项目（2008AA10Z156）；东北林业大学研究生论文项目；中央高校基本科研业务费专项资金项目（DL09BA18）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lyhshen@126.com）
以PMI为选择标记的露地菊转Lc-14-3-3基因体
系的建立及功能鉴定
于利刚，解莉楠，王 江，张 旸，李玉花*
（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）
摘 要：从东北地区高 pH 盐碱地上生长良好的羊草中克隆 Lc14-3-3 基因，以露地菊（Chrysanthemum
morifolium）‘火焰’叶片愈伤组织为受体，以农杆菌介导，将 Lc14-3-3 基因转入‘火焰’基因组中。以
载体中的磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase，PMI）为筛选标记，通过甘露糖的筛选，
结合 PCR、Southern 杂交检测 Lc14-3-3 整合到其基因组。通过转基因植株与对照植株的耐盐性对比可见
转化 Lc14-3-3 基因植株具有更高的耐盐能力。磷酸甘露糖异构酶基因/甘露糖筛选系统可有效应用于露地
菊遗传转化。
关键词：菊；露地菊；Lc14-3-3；磷酸甘露糖异构酶基因；转基因
中图分类号：S 682.1+1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）06-1139-08

Phosphomannose Isomerase/Mannose Selection System to Screen Lc14-3-3
Transgenic Chrysanthemum Plants
YU Li-gang，XIE Li-nan，WANG Jiang，ZHANG Yang，and LI Yu-hua*
（College of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）
Abstract：The objective of this experiment was to develop the selection system for transgenic
chrysanthemums（Chrysanthemum morifolium）by Agrobacterim tumefaciens carrying genes related in
saline-alkaline tolerance without using antibiotic resistance genes. Lc14-3-3 was cloned from a xerophilous
grass，Leymus chinensis，which is adapted to high pH（8.5–11.5）sodic soils. Leaf explants from in vitro
germinated plants of chrysanthemum ‘ Huoyan ’ were infected with A. tumefaciens EHA105
pCAMBIA1301. The selection system was based on the use of Escherichia coli phosphomannose
isomerase（PMI）gene as a selectable marker gene and mannose as a selective nutrient. The explants were
selected on medium supplemented with a combination of mannose and sucrose as a carbon source at
different concentrations. Among the leaf explants which were infected，there are 19 shoots surviving after
selection by the medium containing 15 g · L-1 mannose. PCR analysis and southern blot analysis confirmed
that T3 independent transformed lines were positive for PMI and Lc14-3-3 gene. The growth of
transformed lines showed more healthy and high tolerant. The PMI/mannose selection system was efficient
for producing transgenic chrysanthemum plants without using antibiotics or herbicides.

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Key words：chrysanthemum；Lc14-3-3；PMI；transgenic

露地菊（Chrysanthemum morifolium）花色丰富，花多而密，花期长，植株低矮，覆盖力强，繁
殖容易，适应范围广，抗逆性强，因而被广泛应用于公园、街道绿地、城市道路绿化带等地方。但
中国东北地区的土地盐碱化严重，如何提高花卉的耐盐碱特性，提高盐碱贫瘠土地的利用成为急需
解决的问题。
植物 14-3-3 蛋白是一种小肽段，通常结合转录因子和其他的信号蛋白来调控植物发育和胁迫反
应（Bai et al.，2007）。有研究证明 14-3-3 蛋白主要调控质膜 H+-ATP 酶、碳及氮酶机制，参与油菜
素内酯信号通路，另外也参与高盐下引起的缺铁、缺钾等反应的调控（Bunney et al.，2001；Paul et
al.，2006）。
目前报道的植物遗传转化研究通常使用抗生素基因作为标记基因，如潮霉素基因、抗除草剂基
因等，这些基因可能在转基因植物环境释放中带来的潜在危害，因此近来在苹果（Degenhardt et al.，
2006）等几种果树（王鸿和郝燕，2011）中利用安全标记，如利用磷酸甘露糖异构酶基因
（phosphomannose isomerase，PMI）为选择标记，以甘露糖为筛选介质进行遗传转化的报道，但在
菊花等花卉中尚未广泛应用。
本试验中利用从耐高盐碱的天然羊草中克隆的 14-3-3 基因与磷酸甘露糖异构酶基因，构建
PMI-Lc14-3-3 安全选择标记的目的基因载体，遗传转化露地菊‘火焰’品种，以期培育出抗盐碱能
力更强且安全的露地菊转基因新品系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验时间为 2009 年 2 月至 2010 年 8 月。
露地菊品种‘火焰’（东北林业大学 2009 年黑龙江省登记品种）、羊草、农杆菌 EHA105、载体
pCAMBIA1301-PMI、羊草 Lc14-3-3 基因均由东北林业大学生命学院发育学科实验室保存。Gateway
LR reaction 试剂盒，RACE clone 试剂盒购于 Invitrogen 公司，Blend Taq 聚合酶、dNTP、内切酶
EcoRⅠ和 BamHⅠ购自 TOYOBO 公司，引物由上海生工合成，pGEM-T 载体、大肠杆菌 TOP10、
质粒和胶回收试剂盒购自北京天根生化有限公司，Dig-dNTP 购自罗氏公司，尼龙膜购于 GE 公司，
其他生化试剂为 Sigma 公司产品以及国产 AR 级产品。
1.2 Lc14-3-3 基因的克隆及序列分析
在抑制消减文库中获得的 Lc14-3-3 基因片段的基础上，进一步利用 Trizol 试剂法提取羊草总
RNA，然后用 Promege 的反转录试剂盒反转录成末端带有一串 oligo(dT)的 cDNA，并根据 invetrogen
RACE 试剂盒说明书，用已经设计好的 5′RACE 和 3′RACE 引物克隆，最后进行拼接，得到 Lc14-3-3
的全长序列，利用 NCBI 网站中的 BLAST 进行同源性分析。
全长引物 Primer F：5′GGCCAATCAGTGCCCCTCTCCCTCA3′，Primer R：5′GACGTTGGCACGT
CTAACTTCCTCAGGT3′。
PCR 扩增条件为 94 ℃变性 2 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 30
个循环；72 ℃延伸 5 min；4 ℃保存。
扩增产物于 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。
6 期 于利刚等：以 PMI 为选择标记的露地菊转 Lc-14-3-3 基因体系的建立及功能鉴定 1141

1.3 载体构建
依据 Gateway 手册，全长序列先加入接头引物 attB1 和 attB2，PCR 产物回收纯化后进行 BP 反
应，再将 BP 反应产物回收纯化后进行 LR 反应得到重组的 pCAMBIA1301-PMI-Lc14-3-3 植物表达载
体。将 LR 反应产物回收纯化后进行测序验证，确定其没有变异，再通过电转法转入到农杆菌菌株
EHA105 中。
1.4 遗传体系建立及其优化
1.4.1 叶片分化对甘露糖敏感性的测试
以 20 ~ 25 d 苗龄的露地菊‘火焰’无菌苗为试材，选取中上部幼嫩叶片，将无菌叶片剪成约
8 mm × 8 mm 的小块，接种在加有不同含量甘露糖的分化培养基上，每一处理接种约 20 块外植体，
3 次重复。
设置 6 种甘露糖和蔗糖质量配比，测定叶片分化对甘露糖的本底敏感性。设定甘露糖和蔗糖的
总含量为 3%，加入甘露糖的含量分别为 5、10、15、20、25 和 30 g · L-1，30 d 后统计分化率及增
殖系数。分化率（%）= 再生不定芽的外植体数/接种外植体数 × 100。增殖系数 = 外植体再生不
定芽总数/再生不定芽的外植体数。
1.4.2 农杆菌介导的叶盘法遗传转化及抗性苗筛选
利用含有目的基因的农杆菌（EHA105）进行叶盘法遗传转化。侵染液浓度 OD600 为 0.3，侵染
时间 10 min。
将侵染过的叶片接种在 MS 培养基上，28 ℃暗培养条件下共培养 2 ~ 3 d。将经过共培养的外植
体转移到脱菌培养基 MS + 0.5 mg · L-1 BA + 1.5 mg · L-1 NAA + 头孢霉素（cef）200 mg · L-1 上，选
择培养 2 ~ 3 周。
外植体愈伤组织转入选择培养基 MS + 0.5 mg · L-1 BA + 1.5 mg · L-1 NAA + 甘露糖 15 g · L-1 +
cef 200 mg · L-1 中进行诱导分化和抗性筛选。待不定芽长到 1 cm 以上时切下，并插入含有选择压的
生根培养基上进行生根培养。
1.5 转化植株的 PCR 和 Southern 检测
PMI 基因的 PCR 检测，引物 primer F：5′ATGCAAAAACTCATTAACT3′，primer R：5′TTACAG
CTTGTTGTAAACACG3′。扩增条件为 94 ℃变性 2 min；94 ℃变性 30 s，48 ℃退火 30 s，72 ℃延
伸 1 min，共 30 个循环；72 ℃延伸 5 min；4 ℃保存。
Lc14-3-3 片段引物的 PCR 检测，片段引物 Primer F：5′AGCAGGCTGAGCGTTATG3′，Pimer R：
5′ATCGGGTGAGTGGTAGGC3′。其扩增条件为 94 ℃变性 2 min；94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 30 s，
72 ℃延伸 1 min，共 30 个循环；72 ℃延伸 5 min；4 ℃保存。
CTAB 法提取转基因植株和对照植株总 DNA，限制性内切酶 EcoRⅠ和 BamHⅠ进行酶切后经
过琼脂糖凝胶电泳分离，转移到带正电荷的尼龙膜上，用地高辛标记的 Lc14-3-3 基因片段作为探针，
参照《现代分子生物学模式实验指南》（李玉花，2007）中的方法进行 Southern 杂交。
1.6 阳性植株的抗盐性鉴定
将经过分子检测的转基因植株 T3 扩繁到 50 个植株，并移栽至液体 MS 培养基的三角瓶中（无
任何其他成分），与 50 株未转化植株分别在 NaCl 浓度为 100、200 和 300 mmol · L-1 的 MS 液体培养
基（无其他成分）中的进行培养，20 d 后观察、统计分析其生长情况。
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2 结果与分析
2.1 Lc14-3-3 基因的克隆与表达载体构建
从羊草中克隆获得的 Lc14-3-3 基因全长序列，经 PCR 产物电泳检测长度约 1 000 bp，其扩增结
果如图 1 所示。
通过 NCBI Blast 程序对 Lc14-3-3 基因进行同源氨基酸序列搜索，羊草 Lc14-3-3 基因编码的氨
基酸序列与其它物种的 Lc14-3-3 具有很高的相似性，与禾本科植物麦、小麦、水稻的相似性很高，
均大于 90%，另外与双子叶植物烟草、百合等也具有大于 85%的相似度。
系统发生树结果显示，羊草 Lc14-3-3 基因编码蛋白与单子叶植物的 Lc14-3-3 为同一起源，并与
小麦的同源性最高为 98%，在进化上属同一种分支。
根据 Gateway 手册获得 BP 反应产物后进行 LR 反应，将 Lc14-3-3 基因构建到携带 PMI 标记基
因的表达载体上，获得 pCAMBIA-PMI-Lc14-3-3 表达载体（图 2）。

图 1 Lc14-3-3 基因全长 PCR 产物
Fig. 1 PCR product of Lc14-3-3 gene


图 2 表达载体 pCAMBIA1301-PMI-Lc14-3-3
Fig. 2 Expression vector structure of pCAMBIA1301-PMI-Lc14-3-3

2.2 甘露糖浓度对叶片外植体分化的影响
为了确定露地菊‘火焰’对筛选时所使用的筛选介质甘露糖的敏感性，有效淘汰非转化植株，
同时避免甘露糖浓度过大对外植体造成伤害，将外植体接种于含不同甘露糖和蔗糖配比浓度的分化
培养基中，观察叶片生长情况和不定芽分化情况。结果（表 1）表明在 5 和 10 g · L-1 甘露糖浓度下
叶片大量分化，不适宜作筛选浓度，在甘露糖浓度 20 g · L-1 及更高浓度的处理中没有芽的分化。所
以认为 15 g · L-1 的甘露糖浓度是筛选的临界耐受浓度。


6 期 于利刚等：以 PMI 为选择标记的露地菊转 Lc-14-3-3 基因体系的建立及功能鉴定 1143

表 1 甘露糖对露地菊‘火焰’叶片外植体不定芽分化的影响
Table 1 Mannose on affect of bud differentiation of the chrysanthemum explantations
甘露糖/（g · L-1）
Mannose
接种外植体数
Number of explant
出芽外植体数
Number of buds
总芽数 Total number
of all buds
分化率/%
Differentiation rate
增殖系数
Proliferation
5 66 58 609 87.8 10.5
10 66 34 72 51.5 2.1
15 60 16 20 26.7 1.3
20 60 0 0 0 0
25 60 0 0 0 0
30 60 0 0 0 0

2.3 转化植株的分子检测
对 19 个在甘露糖筛选培养基上能够正常生长的抗性芽进行 PMI 基因的 PCR 检测，发现 1 至 16
号植株均有表达，转基因植株已把 PMI 基因整合到基因组中并已表达；17 ~ 19 号 3 株没有 PMI 的
表达，可能是由于其生命力强造成的假阳性（图 3）。
进一步对特异基因进行 PCR 检测，转基因阳性植株 3 号（记为 T3）已经整合并表达了 Lc14-3-3
基因，而对照植株中并没有 Lc14-3-3 的基因。
检测的 Lc14-3-3 基因片段长度 469 bp，结果见图 4。


图 3 转化植株及未转化植株 PMI 基因的 PCR 检测
M：DL2000；1 ~ 19：检测植株 DNA；20：H2O；21：检测对照植株；22：阳性对照。
Fig. 3 PCR detection of PMI gene in transformed and untransformed lines
M：DL2000；1–19：Transgenic plant；20：H2O；21：Wild type plant；22：Plasmid positive.



图 4 转化植株 T3 及未转化植株 Lc14-3-3 基因的 PCR 检测
M：DL2000；CK+：Agrobacterium plasmid；T3：转基因植株；CK-：对照植株。
Fig. 4 PCR detection of Lc14-3-3 gene in transformed lines，T3 and untransformed lines
M：DL2000；CK+：Agrobacterium plasmid；T3：Transgenic plant；CK-：Wild type plant.
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2.4 Southern 杂交的结果分析
进行 Southern 杂交结果如图 5 所示，在转化植株基因组检测到 Lc14-3-3 基因，证明 Lc14-3-3
基因已经成功转入露地菊的基因组，其拷贝数为 3。













图 5 转基因植株的 Southern 杂交鉴定株 DNA
Fig. 5 Southern blot of transformed line T3
2.5 转基因植株的耐盐性分析
经过分子检测出 T3 为转基因植株，扩繁的 50 株转基因露地菊和对照植株在不同浓度 NaCl 胁
迫下，培养 20 d 后，在 NaCl 100 mmol · L-1 的培养基中，可见转基因植株下部叶片有少量褐变、凋
谢，对照几乎整株叶片褐变、凋谢，芽未见明显变化。在 NaCl 200 mmol · L-1 的培养基中，转基因
植株的叶片全部死亡而芽部依然呈现鲜绿色，而对照植株包括芽均褐变、萎蔫，接近死亡。在 NaCl
300 mmol · L-1 的培养基中，转基因植株叶片褐变、萎蔫而芽保持鲜绿色，而对照植株整株明显褐变、
萎蔫（图 6）。由此可以见露地菊‘火焰’转入 Lc14-3-3 基因后抗盐能力有比较明显地提高。
















图 6 NaCl 处理后转化株（T）和对照株（W）生长情况
Fig. 6 Growth of transgenic plant（T）and wild plant（W）under NaCl treatment
A：NaCl 0 mmol · L-1；B：NaCl 100 mmol · L-1；C：NaCl 200 mmol · L-1；D：NaCl 300 mmol · L-1.
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3 讨论
本研究中通过对羊草 Lc14-3-3 基因的克隆获得其完整的序列，成功改造 Gateway 系统，构建了
携带安全标记的植物表达载体 pCAMBIA1301-PMI-Lc14-3-3，通过电击法转入了根癌农杆菌 EHA105
中，利用侵染法转入观赏性强而且适于北方种植的露地菊‘火焰’中，在筛选中利用载体上的非抗
生素标记，使用甘露糖为筛选介质，最终获得了转 Lc14-3-3 基因露地菊‘火焰’植株。通过初步检
测发现露地菊‘火焰’转化株有很高的抗性。以后应对其进行进一步的研究而使其能推广，丰富盐
碱地绿化植物品系。
在植物遗传转化研究中，目前仍多采用抗生素基因为标记基因，其潜在危害尚不能排除。磷酸
甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase，PMI）作为一种安全的选择标记，已在一些园艺作
物中，如白菜（Min et al.，2007）、葡萄（Reustle et al.，2003）、柑橘（Boscariol et al.，2003；Ballester
et al.，2008）、木瓜（Zhu et al.，2005）和苹果（Degenhardt et al.，2006）等中得到应用，为获得安
全和特定品质性状改良的遗传转化体提供研究基础。本研究中将 Lc14-3-3 基因与磷酸甘露糖异构酶
基因构建重组表达载体转入露地菊中，成功构建了以甘露糖为选择介质的筛选体系，该体系可对其
他菊花品系及其他观赏植物的安全标记遗传转化提供有价值的参考。
在植物抗病和抗逆反应体系中，由于 14-3-3 基因在调控一些抗逆相关基因和信号传导中起到关
键作用（Xu & Shi，2006），所以 14-3-3 被广泛运用于改良作物或花卉的抗病抗逆方面，并取得很
多有重大意义的进展（Fuglsang et al.，2007）。在 H+-ATP 酶、碳及氮酶机制方面也有大量报道（Sylviane
et al.，2002）。关于菊花转抗逆基因的研究已经有了许多研究成果（Lin et al.，2007），本研究中转
抗盐碱植物羊草的 14-3-3 基因能提高露地菊的抗胁迫能力是一个新进展。
本研究中通过将 Lc14-3-3 基因转入露地菊‘火焰’中显著提高了转化植株的耐盐性，其结果显
示 Lc14-3-3 作为一种正调控因子参与了‘火焰’的抗盐性。但是植物的抗逆系统是一个庞大且复杂
的生理过程，和与各种通路的交叉协同完成的。后续试验将对 Lc14-3-3 在露地菊‘火焰’中的一些
其他抗性作用，以及在抗盐碱信号转导系统中的重要作用作深入探讨。
另外，转录因子因其具有调控与同类性状相关的多个基因表达的特点也是植物抗逆反应体系研
究的重要策略之一，也取得了诸多进展（Kazuo et al.，2009）。
在今后的研究中会着重考虑通过转录因子的遗传转化，为露地菊的品种改良及获得抗逆新品系
开拓新的途径。

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