全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (6) : 867 - 872
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 12 - 26; 修回日期 : 2009 - 03 - 31
基金项目 : 科技部科技基础工作项目 (2006DKA21002220) ; 国家林业局 ‘948’项目 (200824211)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: 908505685@qq1com; Tel: 13700610996)
核桃离体培养和植株再生
樊　靖 1, 2 , 刘庆忠 2 , 张俊林 2, 3 , 秦　岭 4 , 陈　新 2 , 王　锦 13
(1 西南林学院园林学院 , 昆明 650224; 2 山东省果树研究所 , 山东泰安 271000; 3 浙江森禾种业股份有限公司 , 杭州
310012; 4 北京农学院植物科学技术系 , 北京 102206)
摘 　要 : 以 5个核桃品种 (株系 ) 10年生植株的茎段为外植体 , 进行了离体培养和植株再生的研究。
结果表明 , 附加 2 g·L - 1聚乙烯吡咯烷酮的 DKW + 62BA 110 mg·L - 1 + IBA 0101～0110 mg·L - 1是诱导茎
段萌发最适宜的培养基 , 5个品种 (株系 ) 间的萌发率存在差异 ; DKW + 62BA 110 mg·L - 1 + IBA 0101
mg·L - 1 + 蔗糖 40 g·L - 1是最适宜的增殖培养基 ; 采用二步生根法最高生根率为 41167% , 生根试管苗移
栽于草炭土 ∶河沙 = 1 ∶1的基质中 , 控制温度 20～30 ℃, 保湿 20 d, 期间遮荫 , 40 d后成活率 95%。
关键词 : 核桃 ; 茎段 ; 组织培养 ; 聚乙烯吡咯烷酮
中图分类号 : S 66411; Q 81311 + 2　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0620867206
In V itro Culture and Plan t Regenera tion of J uglans reg ia L .
FAN J ing1, 2 , L IU Q ing2zhong2 , ZHANG Jun2lin2, 3 , Q IN L ing4 , CHEN Xin2 , and WANG J in13
(1 Facu lty of Landscape A rchitecture, Southw est Forestry College, Kunm ing 650224, China; 2 Shandong Institu te of Pom ology,
Taipian, Shandong 271000, China; 3 Zhejiang Senhe Seed Co. , LTD, Hangzhou 310012, Ch ina; 4D epartm ent of P lant Science
and Technology, B eijing U niversity of A griculture, B eijing 102206, Ch ina)
Abstract: A study was conducted on in vitro culture and p lant regeneration of Jug lans reg ia L. with the
nodal segments or ap ical buds excised from the newly2grown shoots of the ten2year2old of five elites maternal
p lants. Results showed that the DKW supp lemented with 62BA 110 mg·L - 1 + IBA 0101 - 0110 mg·L - 1
and polyvinylpyrrolidone 2 g·L - 1 was op timal for segments breaking, five genotypes exhibited differences;
W hile the DKW with 62BA 110 mg·L - 1 + IBA 0101 mg·L - 1 + 40 g·L - 1 sucrose was op timal for the tube2
shoot multip lication; The highest rooting frequency was 41167% by using two step smethod. The p lantletswith
roots were transp lanted into the substrate containing peat and sand (1 ∶1) , A t 20 - 30 ℃ for 20 days, with
the survival 95% after 40 days’transp lanting.
Key words: walnut; Jug lans reg ia L. ; stem segment; tissue culture; polyvinylpyrrolidone
长期以来 , 核桃 (Jug lans reg ia L. ) 主要采用实生繁殖与嫁接繁殖 (郗荣庭和张毅萍 , 1996)。
但实生繁殖后代发生变异 , 难以保持品种的优良特性 ; 嫁接繁殖 , 由于嫁接切口易氧化褐变 , 常导致
成活率很低且不稳定 , 因此常规繁殖技术便成为核桃良种推广的巨大障碍 (高清华 等 , 2000)。自
D river和 Kuniyuki (1984) 将 Paradox核桃组织培养成功后 , 在核桃组织培养研究方面虽然取得了一
定的进展 (McGranahan et al. , 1988; Cornu & Jay2A llemand, 1989; Pijut, 1994; 汤浩茹 等 , 2000;
Saadat & Hennerty, 2002; Kaur et al. , 2006) , 但所采用的外植体多为合子胚、实生苗等幼嫩的组织 ,
对于核桃成龄品种的组织培养报道不多。本研究中以 10年生的具有优良性状的核桃品种 (株系 ) 为
试材 , 成功建立了再生体系 , 为核桃良种推广奠定了基础。
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
1　材料与方法
111　外植体材料及其培养条件
2007年 5月从山东省泰安市国家果树资源圃核桃圃采集 , 由山东省果树研究所选育的核桃品种
‘香玲 ’、‘绿圆 ’、‘丰辉 ’和 ‘优株 1’、‘优株 2’ (优株 1, 优株 2暂未鉴定 ) , 均为 10年生树。
选择直径为 015～110 cm树膛内部枝干上当年抽生的无病虫害带 10个节间的嫩梢。将保留 1～2 cm
长叶柄的枝条装入冰盒带回实验室 , 4 ℃冰箱保存备用。
供试枝条剪截成 2～3 cm长单芽茎段 (少数两个芽 ) , 洗衣粉浸泡 30 m in, 自来水冲洗 4～5 h,
在超净工作台上用 70%酒精涮洗 60 s, 无菌水冲洗两次后用含 011% HgCl2溶液浸泡 10 m in, 无菌水
冲洗 5次 , 然后再用 011% HgCl2溶液浸泡 5 m in, 无菌水冲洗 8次。用无菌滤纸吸干表面水分 , 剪切
枝条上下切口 , 将有新切口的枝条作为外植体。
以 DKW (D river & Kuniyuki, 1984) 作基本培养基 , 附加蔗糖 30 g·L - 1 (生根培养为 20 g·
L - 1 ) , 琼脂 6 g·L - 1 , pH 516～518, 附加各种植物生长调节剂 , 温度 (25 ±2) ℃, 光照 16 h·d - 1 ,
光强 2 000 lx。
112　不同浓度植物生长调节剂对茎段的培养
将茎段接种于添加 62BA和 IBA的 DKW培养基上进行培养 , 加入 210 g·L - 1聚乙烯吡咯烷酮以
阻止酚类物质氧化为醌类物质损伤组织细胞。培养 30 d后 , 以萌发嫩茎的长度大于 2 cm的为有效嫩
茎 (下同 ) , 统计分析不同植物调节剂组合对茎段萌发率的影响。每瓶接种 1～2个茎段 , 每个处理
20瓶 , 重复 3次。萌发率 ( % ) =萌发茎段数 /未污染茎段数 ×100。
113　不同品种 (株系 ) 茎段的培养
将 5个供试核桃品种枝条接种于附加 62BA 110 mg·L - 1、 IBA 0101 mg·L - 1和添加聚乙烯吡咯烷
酮 210 g·L - 1的 DKW培养基上培养 , 30 d后统计分析萌发率的差异。每个品种 (株系 ) 接种 20个
茎段 , 重复 3次。
114　初代嫩茎培养和继代增殖培养的筛选
将外植体萌发出的嫩茎切割下来 , 接种于附加 62BA 110 mg·L - 1、 IBA 0101 mg·L - 1的 DKW 培
养基上 , 经 2～3次继代 , 试管苗有一定数量时选取 015～110 cm长的丛生芽或单芽进行增殖培养基
的筛选。以 ‘香玲 ’试管苗为试材 , 以 3种基本培养基 (DKW、MS、W PM )、62BA和 IBA不同浓度
及蔗糖不同用量为参选因素 , 采用正交试验设计 L9 (34 ) , 观察核桃试管苗增殖情况 , 选择最佳增殖
培养基。接种 20瓶 , 每瓶接种 4个 , 重复 3次。以长度大于 015 cm单芽或至少带有一个叶片的茎段
为有效增殖芽 , 培养 20 d观察增殖情况。
115　试管生根诱导
选取生长健壮 , 高 210～310 cm的试管苗进行生根。核桃试管嫩茎生根方法采用 “二步法 ”生
根 (Jay2A llemand et al. , 1992; 裴东 等 , 2002)。第 1步诱导生根培养基为 1 /4 DKW 附加不同浓度
IBA (0～15100 mg·L - 1 ) ; 第 2步生根培养基为不含生长调节剂的 1 /4 DKW。嫩茎在根诱导培养基
上暗培养 10 d后转接到生根培养基上培养。以根的长度大于 015 cm为有效根 , 30 d后调查生根条数
和生根率。每处理接种 40个嫩茎 , 重复 3次。
116　炼苗和移栽
试管苗根长 2 cm以上时即可将生根的小植株开瓶炼苗 7 d, 移栽时先将小苗从培养基中取出 , 小
心洗净 , 移栽到草炭土与河沙为 1∶1的基质中。移栽后小拱棚封闭保湿 20 d以上 , 小植株恢复健壮
生长后慢慢放风。7 d浇灌 1次 1 /4 DKW大量溶液 , 大田移栽前将经锻炼的试管苗 , 移于室外炼苗 7
d, 然后移栽到沙壤土中 , 移栽前在畦内撒少量草炭土。保持土壤湿润 , 加盖遮荫网。
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117　数据统计分析
数据分析与处理采用 DPS v3101专业版统计软件。
2　结果与分析
211　不同浓度的植物生长调节剂组合对茎段萌发的影响
由表 1可以看出 , 不同浓度 62BA和 IBA的组合 , 茎段的萌发率差异比较明显。不添加 62BA和
IBA的处理 (对照 , 表中未列出 ) 茎段不萌发 , 30 d后腋芽脱落 , 茎段干枯。植物生长调节剂处理
的萌发率最高可达 88133% , 萌发的茎段颜色鲜绿。随 62BA浓度的增高 , 茎段的萌发率呈先上升后
下降的趋势。
经方差分析 , 62BA处理间差异显著 ( P < 0105) , 当 62BA 110 mg·L - 1时 , 萌发率最高 , 萌发
早 , 嫩茎壮实 , 叶色鲜绿 ; 62BA浓度低于或高于 110 mg·L - 1时 , 萌发晚 , 嫩茎细弱 , 叶色不正常。
因此 , 核桃茎段萌发适宜的培养基为添加 210 g·L - 1聚乙烯吡咯烷酮的 DKW + 62BA 110 mg·L - 1 +
IBA 0101～0110 mg·L - 1 (图版 , A )。
表 1　62BA和 IBA对核桃茎段萌发率的影响
Table 1　Effects of 62BA and IBA on the break ra te from wa lnut stem segm en ts
62BA /
(mg·L - 1 )
IBA /
(mg·L - 1 )
萌发率 /%
B reak rate
萌发情况
Germ inate situation
生长状况
Growth situation
015 0101 33199 ±4136 晚 Late 细弱 ,黄绿 Thin, chlorotic
015 0110 30146 ±3104 晚 Late 细弱 ,黄绿 Thin, chlorotic
110 0101 88133 ±12158 早 Early 壮实 ,浓绿 Strong, heavy green
110 0110 74179 ±10140 早 Early 壮实 ,绿 Strong, green
210 0101 50149 ±8130 晚 Late 细弱 ,淡绿 Thin, light green
210 0110 41181 ±8134 晚 Late 极细弱 ,淡绿 Thin, light green
212　不同品种 (系 ) 茎段萌发结果
由表 2可以看出 , 供试的 5个品种 (株系 ) 的茎段外植体萌发率存在较为明显的差别 , 说明基
因型的差异决定外植体再生能力的高低。‘优株 1’和 ‘优株 2’的萌发率 (88133% , 7215% ) 显著
高于另 3个品种 , 嫩茎粗壮 , 颜色浓绿 , 说明在当地选育出来的品质优良、产量高、生长健壮的优
株 , 在组织培养中同样表现出生长优势。‘香玲 ’、‘绿圆 ’、‘丰辉 ’表现出较低的萌发率 , 可能与
枝条上腋芽的饱满程度有关。3个品种中 ‘丰辉 ’腋芽最瘪 , ‘绿圆 ’居中 , ‘香玲 ’稍好 , 腋芽的
饱满程度在一定程度上反映了萌发率的高低 ; ‘香玲 ’和 ‘丰辉 ’的萌发率之间差异不显著 , 可能是
因为两个品种是姊妹系 , 都是从 ‘阿 9’ ב上宋 6号 ’杂交后代实生选育出来的。
表 2　不同品种 (株系 ) 的核桃茎段对萌发率效果的影响
Table 2　Effects of d ifferen t var ieties and clones of wa lnut on in vitro shoot break ra te from stem segm en ts
品种
Variety
萌发率 /%
B reak rate
生长状况
Growth situation
香玲 Xiangling 43133 ±3181 健壮 ,叶片浓绿 Growth healthy and strong, leaves dark green
丰辉 Fenghui 31167 ±6129 健壮 ,叶绿 Growth healthy and strong, leaves green
绿圆 Lüyuan 40100 ±2150 叶小 ,叶柄长 Leaves small, petiole long
优株 1 Elite 1 88133 ±12158 健壮 ,有腋芽 Strong, axillary buds
优株 2 Elite 2 72150 ±5100 粗壮 ,节间短 ,有愈伤 Strong and thick, node short, callus
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213　核桃试管苗的增殖培养基筛选
从表 3可见 , 不同组合方式影响核桃增殖倍数 , 处理 5的芽苗增殖效果最好 , 增殖倍数达 5157,
且芽苗生长较壮 , 生长高度达 5 cm; 处理 9虽然获得最高的增殖倍数 , 但试管苗基部愈伤组织过大
且嫩茎木质化严重 , 不利于生根。
从极差分析结果可以看出 , 62BA的浓度是决定核桃芽苗增殖系数的决定因子 , 蔗糖的含量对增
殖影响次之 , 基本培养基的影响不大 , IBA的影响最小。根据极差的大小 , 可以确定核桃试管苗最佳
增殖组合为 : DKW + 62BA 110 mg·L - 1 + IBA 0101 mg·L - 1 +蔗糖 40 g·L - 1。在此组合下 , 核桃
试管苗继代 20 d的增殖倍数能达 615 (图版 , B )。
表 3　核桃芽增殖的正交试设计方案与试验结果直观分析表
Table 3　Test design and v isua l m ultiplica tion ana lysis of J uglans regia L.
of reproduction by orthogona l exper im en t
处理
Treatment
62BA /
(mg·L - 1 )
IBA /
(mg·L - 1 )
蔗糖 / ( g·L - 1 )
Sucrose
培养基
Medium
增殖倍数
Rep roduction times
长势
Growing trend
1 015 (1) 01001 (1) 20 (1) DKW (1) 2192dD 较弱 Rather weak
2 015 (1) 01005 (2) 30 (2) MS(2) 2189dD 较健壮 Rather vigorous
3 015 (1) 01010 (3) 40 (3) W PM (3) 3192cdBCD 较健壮 Rather vigorous
4 110 (2) 01001 (1) 30 (2) W PM (3) 4167bcABCD 矮小 Dwarf p lants
5 110 (2) 01005 (2) 40 (3) DKW (1) 5157abAB 健壮 Rather vigorous
6 110 (2) 01010 (3) 20 (1) MS(2) 4150bcABCD 矮小 Dwarf p lants
7 115 (3) 01001 (1) 40 (3) MS(2) 4176bcABC 矮小 ,愈伤大 Dwarf p lants
8 115 (3) 01005 (2) 20 (1) W PM (3) 3164cdCD 较弱 ,愈伤大 Rather weak
9 115 (3) 01010 (3) 30 (2) DKW (1) 6100aA 健壮 ,愈伤大 Rather vigorous
T1 3124 4111 3169 4182
T2 4191 4104 4152 4105
T3 4180 4181 4174 4107
R 1167 0177 1106 0178
　　注 : A、B、C、D分别表示α = 0101水平下的差异显著性 ; a、b、c、d分别表示α = 0105水平下的差异显著性。T1、T2、T3 为各
因素水平 1、水平 2、水平 3的均值 ; R为极差。
Note: A, B, C, D indicate the significance at the level ofα = 0101; a, b, c and d indicate the significance at the level ofα = 0105. T1 ,
T2 , T3 indicate the average of level 1, level 2, level 3, respectively; R indicates range.
214　核桃试管苗的生根培养基
将 2～3 cm高的试管苗嫩茎切割下来 , 接种到含有 IBA的 1 /4 DKW 诱导培养基中暗培养 10 d,
然后转接到不含生长素的 1 /4 DKW生根培养基上培养 , 30 d后调查生根条数和生根率。在试管苗根
诱导阶段 , 暗培养 10 d后 , 在附加 IBA 3100～15100 mg·L - 1的培养基上嫩茎基部呈现不同程度的肿
大 , 有些会出现红色的根原基 (图版 , C) , 将经过诱导的嫩茎转接到生根培养基中进行根的发生和
伸长。
从图 1可以看出 , 试管苗在附加 IBA 5100～8100 mg·L - 1的 1 /4DKW 培养基上获得最佳生根效
果 (图版 , D ) , 生根率最高达 41167% , 平均生根条数 2133～3150条 ; IBA低于 5100 mg·L - 1时 ,
生根率下降 , 平均生根条数也降低 ; IBA高于 8100 mg·L - 1时 , 平均生根条数虽有提高 , 但生根率下
降且基部愈伤化严重。当 IBA为 15100 mg·L - 1时虽获得了最高生根条数 (5150条 ) , 但是出现了最
为严重的愈伤化和最低的生根率 (515% )。
生根试管苗大田移栽已成活 (图版 , E) , 移栽成活率 95%。
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3　讨论
在核桃组织培养过程中 , 作者观察到一个有趣但难以定论的现象 : 在 ‘香玲 ’继代培养中出现
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试管苗开雌花的现象 (图版 , F)。核桃试管苗开花已有报道 , 但未见开雌花的报道。裴东和奚声珂
(1998) 指出开花是试管苗退化的信号 , 本研究中发现继代开花 (雄花和雌花 ) 的试管苗表现出增殖
率下降、矮小、叶片深绿、叶柄变长等退化特征 , 开雄花的试管苗在继代培养中仍可以开雄花 , 但继
代开雌花的试管苗不再开雌花 ; 对于试管苗开雌花现象 , 推测可能是接种的外植体在继代培养中发生
了变异 , 具有早实特征 , 这种推测有待进一步研究。
核桃是较难发生不定根的树种 ( Gale & Charles, 1988) , 生根诱导方法、外源 IBA水平、 IBA处
理天数、光周期及试管苗发育状态等均对不定根发生具有明显影响。有人通过对核桃不定根发生发育
的 IAA / IBA调控机制的研究 (Jay2A llemand et al. , 1992; 裴东 等 , 2002; 王清明 等 , 2006) , 采用
二步生根法在继代长达 4年的 6个核桃品种幼态嫩茎上取得了 60%以上的生根率 ( Pei et al. , 2007)。
核桃试管嫩茎生根要求条件严格 , 若条件不适宜往往诱导失败或生根率低下。本试验采用二步生根法
最高获得 41167%的生根率 , 可能是因为继代次数较少 , 试管嫩茎还未完全驯化为幼嫩状态 , 随继代
次数增加 , 试管苗逐渐复幼 , 有望获得较高生根率。
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