全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2010 37 5 769 776
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–09–18；修回日期：2010–04–22
基金项目：‘十一五’国家科技支撑计划项目（2006BAD01A18）；国家高技术研究发展计划（‘863’计划）项目（2008AA10Z156）
菊花FT类似基因的克隆与表达分析
潘才博，张启翔*，潘会堂，孙 明
（北京林业大学园林学院，国家花卉工程技术研究中心，北京 100083）
摘 要：以地被菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）‘七月桃花’为材料，利用同源基因克隆法结
合 RACE 技术克隆了光周期调控开花重要基因 FLOWERING LOCUS T（FT）的类似基因（基因登陆号
GQ925916，命名为 CmFT）。该基因开放阅读框有 525 bp，可编码 174 个氨基酸。蛋白比对发现，CmFT
所推测的氨基酸序列包含 FT 类蛋白保守基序和两个关键性氨基酸残基。通过系统遗传进化树分析进一步
表明 CmFT 属于 FT 亚家族成员。SYBR GREEN 法实时荧光定量 RT-PCR 表达分析结果表明 CmFT 在花
芽的表达量最高，茎的表达量次之，叶片表达量最低。在短日条件下，该基因的表达量呈昼夜节律表达
型，在光照期间呈下降趋势，在夜间逐渐上升，光照前 4 h 时达到最高水平。在长日条件下，其相对表达
量显著低于短日条件下且趋于零。由此推测，该基因主要与菊花光周期敏感性密切相关，可能在光周期
促进开花中发挥一定的作用。
关键词：菊花；光周期敏感性；FT 类似基因；实时定量 RT-PCR
中图分类号：S 682.1+1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）05-0769-08

Clone and Expression Analysis of FLOWERING LOCUS T in
Chrysanthemum morifolium Ramat.
PAN Cai-bo，ZHANG Qi-xiang*，PAN Hui-tang，and SUN Ming
（School of Landscape Architecture，Beijing Forestry University；China National Engineering Research Center for
Floriculture，Beijing 100083，China）
Abstract：A FT-like gene named CmFT（Genbank accession No. GQ925916）was cloned by RT-PCR
and rapid amplification of cDNA ends（RACE） using Chrysanthemum morifolium Ramat.. A predicated
525 bp open reading frame was deduced in the cloned sequence，which encoded 174 amino acids. By
alignment analysis，the deduced amino acid sequence contained two critical residues and conserved
region，both of which identified as diagnostic of true FT. The gene was proposed to belong to FT subfamily
by phylogenetic analysis. Fluorescence quantitative RT-PCR system followed by SYBR GREEN was
established to examine the expression of CmFT under different part of mature tissues and different
photoperiod treatments. CmFT gene expressed highest in flower buds，next in stem and lowest in leaf.
Expression of CmFT under the short day（SD）treatment was significantly high than that under long day
（LD）. Abundance of CmFT indicated a diurnal rhythm in SD-grown plants，so that its levels showed a
decreasing trend under light，a rise during night and the maximal level before the coming of light. Under
the LD treatment，the expression level tended to be zero. The results suggest that CmFT is associated with

﹡ 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zqx@bjfu.edu.cn）
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photoperiod sensitivity and may function in regulating photoperiodic flowering in Chrysanthemum.
Key words：Chrysanthemum；photoperiod sensitivity；FT-like gene；real-time quantitative RT-PCR

光周期是植物成花诱导的关键因子之一，通过控制光周期途径来调控植物开花是花期育种的一
个重要途径（Boss et al.，2004；Abe et al.，2005；Baurle & Dean，2006）。光周期遗传调控途径主
要由光受体基因、昼夜节律钟组分及相关的输出基因等 3 部分组成（Strayer & Kay，1999；Ausin et
al.，2005）。
FLOWERING LOCUS T（下文简称 FT）基因作为昼夜节律钟重要的输出产物之一，在光周期途
径中具有承上启下的作用（Boss et al.，2004；Jack，2004；Moon et al.，2005；Baurle & Dean，2006）。
昼夜节律钟输出产物 GIGANTEA（GI）激活转录因子 CONSTANS（CO）的表达（Putterill et al.，1995；
Fowler et al.，1999；Park et al.，1999），CO 进一步激活 FT 的转录而促进下游开花决定基因的表达
（Samach et al.，2000；Suarez-Lopez et al.，2001；Searle & Coupland，2004；Valverde et al.，2004；
Wigge et al.，2005）。
已有研究表明，FT 的表达水平与光周期敏感性密切相关，被认为是光周期途径中决定植物开花
的重要因子（Suarez-Lopez et al.，2001；Izawa et al.，2002；Turner et al.，2005；Beales et al.，2007；
Wilhelm et al.，2009）。在拟南芥中 FT 首次被克隆鉴定，被认为是一个转录辅助因子（Kardailsky et
al.，1999；Kobayashi et al.，1999；Pnueli et al.，2001）。近年来，FT 蛋白作为成花素信号分子研究
取得了突破性进展，FT 蛋白从叶片输送至茎顶并与 FD 蛋白共同起作用而促进开花（Abe et al.，2005；
Wigge et al.，2005；Lifschitz & Eshed，2006；Corbesier et al.，2007；Jaeger & Wigge，2007；Tamaki
et al.，2007）。
光周期调控开花是菊花育种的重要手段之一，分离鉴定光周期关键因子有利于加快育种进程。
然而，在菊科菊属中有关光周期相关基因的研究较少，菊花 FT 类似基因与光周期敏感研究未见报
道。
作者试图克隆菊花 FT 类似基因，并初步探知该基因的光周期敏感特性，为进一步研究光周期
敏感机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料和光周期处理
供试材料为地被菊品种‘七月桃花’。取长日照处理的菊花母株的营养茎段进行扦插，以草炭、
蛭石（体积比为 3∶1）为培养介质，培养湿度为 55% ~ 70%，白天温度为（25 ± 2）℃，夜间温度
为（22 ± 2）℃，进行生根处理 2 周（光照同母株）。
分两组进行不同光周期处理（培养条件同上），一组为长日照处理：自然光（12 ~ 14 h 光照）
并于夜间 22：00 至凌晨 2：00 加 400 W 白炽灯光源（强度 1 000 lx）补充光照进行暗中断（Anderson
& Ascher，2001）；另一组用短日照处理：每天上午 10：00 至下午 6：00 光照 8 h，通过短日照遮光
膜缩短日照。光周期处理 90 d 时分别于 1 日内间隔 4 h 取离茎尖第 7 节段的叶片作为实时定量的材
料，液氮速冻后–80 ℃保存备用。
分别取短日照处理中午时期已开花植株的叶片、茎段、花芽为组织定量材料。处理共计 15 组，
每组取 3 个样株。
5 期 潘才博等：菊花 FT 类似基因的克隆与表达分析 771
1.2 总RNA的提取和cDNA第 1 链的合成
按照 RNA Easy spin kit（北京盖宁公司）说明书提取叶片和茎尖混合组织总 RNA，并用 DNase
I 酶（Promega 公司）去除 RNA 中的痕量 DNA。用 M-MLV 反转录酶（MBI 公司）对 1 μg 总 RNA
进行反转录获得第 1 链 cDNA。
1.3 FT类似基因的克隆
根据 FT 类似基因保守区序列设计一对引物 FT 1f：5′-CTCCATTGGTTGGTGACTGA-3′，FT 1r：
5′-CTCGCGAGTGTTGAAGTT-3′，以 cDNA 第一链作模板进行 PCR 扩增。扩增产物回收、纯化，
连接 pGM-T 载体（北京天根公司），转化 Escherichia coli TOP10 感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆
并测序（北京奥科公司）。根据获得的序列，设计 3′ RACE 两个正向引物：FT 2f1：5′-AACAGGAGCA
CAGTTTGGTCAAG-3′和 FT 2f2：5′-TCGACAAACTGTGTACGCCCCAG-3′，按 3′-Full RACE Core Set
Ver.2.0（TaKaRa）说明书进行操作，获得 3′ 端序列。将保守区序列和 3′ RACE 序列进行拼接，按
SMART™ RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）说明书设计两个反向引物：FT 3r1：
5′-TGGTCTTGGGCTCTCATAGCACAC-3′，FT 3r2：5′-CAAACTGTGCTCCTGTTGTCG CTGG-3′，
获得 5′端序列。
1.4 FT类似基因全长的获得与序列分析
根据 3′ 端和 5′ 端拼接序列设计两条特异引物 FT 4f：5′-TCCCGTTTTTACATAATGCC-3′，FT 4r：
5′-AATATGATGTGCGTGCTTTC-3′ 进行 PCR 扩增，然后克隆、测序，获得 FT 类似基因全长编码
序列。分析该序列所翻译的氨基酸序列，并与拟南芥 FT/TFL1 所有家族成员和部分双子叶植物的同
源序列比对。使用 MEGA 4.0 软件按邻接法构建双子叶植物 FT 类蛋白系统进化树。
1.5 荧光定量PCR
1.5.1 引物设计和标准曲线的建立
通过 BLAST（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）软件分析，获得与 FT 类似基因的相似序列，
在基因的编码序列中跨内含子设计两条特异引物，FT 5f：5′-GCGCGCATTTCACACATTA-3′和 FT 5r：
5′-TTGGTGTTGAAGTTCTGGCG-3′，目的片段为 252 bp。
以已登陆的菊花 Actin 序列（AB205087）作为内参基因设计特异引物 Actin gsp1：5′-TGGCATTGT
GTTGGATTCTGG-3′和 Actin gsp2：5′-CCATCCCAATCATAGACGGCT-3′，目的片段为 362 bp。
通过对 PCR 扩增产物的凝胶检测和测序，进一步验证引物设计的特异性。同时根据 CT 值绘制
标准曲线。
1.5.2 荧光定量 PCR体系和数据处理
荧光定量PCR体系含 10 × PCR buffer 2.0 μL，25 mmol · L-1 MgCl2 2.4 μL，10 mmol · L-1 dNTP混
合液 0.4 μL，20 × SYBR染料 0.5 μL，Taq 0.2 μL，10 pmol · L-1的上下游引物各 0.2 μL，ddH2O 12.1 μL，
模板 2.0 μL。利用Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System荧光定量PCR仪进行扩增，反应程
序为 95 ℃ 120 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 45 s，40 个循环，72 ℃读取荧光值；循环结束后 60
℃保温 60 s，并进行熔解曲线分析。
检测每份样品的 FT 类似基因和 Actin 内参基因 CT 值，每份样品 3 次 PCR 重复，根据标准曲线
计算定量结果及校正值，再计算其平均值和标准差。
使用 Microsoft Excel 2003 软件处理数据。

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2 结果与分析
2.1 总RNA的提取和检测
经电泳检测，所提取 RNA 的 28 S 和 18 S 条带清晰，说明 RNA 完整性良好，纯度高。用 Actin
gsp1、Actin gsp2 对 cDNA 进行 PCR 扩增均得到 362 bp 的产物，说明反转录得到的 cDNA 第一链结
果良好。
2.2 FT类似基因的克隆与分析
利用引物 FT 1f 和 FT 1r，以叶片和茎尖混合组织的 cDNA 为模板进行扩增，获得 183 bp 保守
片段。经 BLAST 分析，发现该片段与大多数 FT 类似基因高度同源。用引物 FT 2f1 和 FT 2f2 进行
3 RACE，获得了该基因 386 bp 3′ 端序列，与已知片段进行拼接，获得了 FT 类似基因 3 端部分蛋
白编码序列。通过 5 RACE 获得了 370 bp 5 端序列。该序列中 525 bp 的开放阅读框可编码 174 个
氨基酸（图 1）。
图 1 菊花 FT 类似基因的 cDNA 序列及推导的氨基酸序列
* 代表终止密码子。
Fig. 1 The complementary DNA sequence and deduced amino acid sequence for CmFT，a Chrysanthemum FT-Like gene
Stop codon is indicated by asterisk.

BLAST 分析表明，该基因与杨属（Populus）、葡萄（Vitis vinifera）等大多数双子叶植物 FT 类
似基因的同源性可达 75%。通过氨基酸序列比对（图 2）发现 CmFT 中包含区分 FT 和 TFL1 蛋白的
关键氨基酸残基酪氨酸（Y）、谷氨酰胺（Q），且具有 FT 类蛋白的两个保守基序即 14 个保守氨基
酸序列（LGRQTVYAPGWRQN）和 LYN/IYN 三联体（Ahn et al.，2006）。
通过构建蛋白系统进化树（图 3），进一步分析菊花 CmFT 与其它双子叶植物 FT/TFL1 类似蛋
白的遗传进化关系。结果表明，CmFT 蛋白与杨树 PnFT1b、PnFTL4a、PnFT3c 遗传距离较近，且
与拟南芥 FT 同属于 FT-Like 亚家族。可以推断，菊花 CmFT 属于 FT 亚家族成员。
5 期 潘才博等：菊花 FT 类似基因的克隆与表达分析 773
图 2 不同双子叶植物和拟南芥 FT/TFL1 蛋白家族部分氨基酸序列比对分析
★代表区分 FT 和 TFL1 蛋白的关键氨基酸残基，黑色框表示鉴别 FT 基因的保守基序。
Fig. 2 Comparison of partial proteins with homologous proteins of dicots plants
Asterisks indicate amino acids that are critical to define FT or TFL1-like proteins. The 14-amino-acid stretch and the LYN triad identified as
diagnostic of true FT genes are boxed.

图 3 不同双子叶植物 FT/TFL1 蛋白系统进化树
右边大括弧表示 3 个亚家族。
Fig. 3 Phylogenetic tree of FT/TFL1 proteins
The three subfamilies are indicated on the right under square brackets.

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2.3 FT类似基因的定量表达分析
2.3.1 荧光产物的鉴定与标准曲线
对 CmFT 荧光定量特异扩增产物进行测序，与原基因的相似性为 100%。用引物 Actin gsp1、Actin
gsp2 对反转录产物进行 PCR 扩增，均得到大小与预期相同的片段。CmFT 的标准曲线为 Y = −3.5855X +
36.3178，相关系数为 0.9962。Actin 的标准曲线为 Y = −3.8546X + 35.4926，相关系数为 0.9979。两
条标准曲线的斜率相差小，相关系数都接近 1，熔解曲线均为单峰，扩增产物特异性好，荧光曲线
能够准确地反映目的产物的扩增。
2.3.2 FT类似基因在不同光周期处理下 mRNA转录水平比较
通过1 d内不同光周期处理下4 h间隔的荧光定量分析验证了该基因与光周期响应类型之间的相
关性。结果如图 4 所示，短日照处理（SD）下叶片 CmFT 的表达量显著高于长日照处理，长日照处
理（LD）下该基因的表达量相对短日照下几乎不表达。在短日照处理下，叶片 CmFT 在 1 d 内的表
达量变化呈昼夜节律变化：在光照期间总体呈下降趋势，前 4 h 表达量下降幅度较大，后 4 h 呈平
稳趋势；在黑暗期间，前 4 h 延续下降的趋势降至 1 d 内最低点，之后表达量逐渐上升，并于中间
时段急剧升高至最高水平，后 4 h 逐渐下降（图 4）。
图 4 菊花叶片在长日照(LD）和短日照(SD）中 CmFT 的实时
定量表达分析
Fig. 4 Quantitative expression of CmFT in leaves
under SD and LD
图 5 CmFT 在叶片、茎与花芽中的表达差异
Fig. 5 Different expression of CmFT in leaves，
stems and flower buds

2.3.3 FT类似基因在不同组织中的 mRNA转录水平比较
对已开花的菊花同一植株不同组织进行 CmFT 荧光定量表达分析，结果表明（图 5），短日照下
已开花植株叶片、茎与花芽 CmFT 表达量存在明显差异，花芽内显著高于同时期叶片内的表达，而
茎的表达量居中。
3 讨论
FT 为编码磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）的基因家族成员，该家族可分为两个亚家族（TFL/FT）。
在拟南芥中共有 6 个成员，除 FT 外，还包括 TERMINAL FLOWER 1（TFL1）、TWIN SISTER OF FT
（TSF）、ARABIDOPSIS THALIANA CENTRORADIALIS（ATC）、BROTHER OF FT AND TFL1（BFT）
和 MOTHEROF FTANDTFL1（MFT）（Kobayashi et al.，1999）。组成型表达 FT 可提前开花（Kobayashi
et al.，1999；Yamaguchi et al.，2005），组成型表达 TFL1 则延迟开花（Mimida et al.，2001），FT 和
5 期 潘才博等：菊花 FT 类似基因的克隆与表达分析 775
TFL1 蛋白在开花中扮演相反的功能。FT 和 TFL1 蛋白有 59%同源性，但在 PEBP 域中仅改变一个
关键氨基酸就能使 TFL1 与 FT 功能互相转换（Hanzawa et al.，2005）。本研究获得的 CmFT 与大多
数双子叶植物 FT 类似基因的同源性较高，氨基酸序列中包含区分 FT 和 TFL1 蛋白的关键氨基酸残
基和保守基序，系统进化分析进一步说明该基因属于 FT 亚家族成员。
拟南芥 FT 或水稻同源物 Hd3a（Heading date 3a）的表达响应日照长短，FT mRNA 仅在适合开
花的日照条件下积累。长日照属性拟南芥 FT 仅在长日照下积累，而水稻 Hd3a 在适合其开花的短日
照条件下才能积累达到一定水平（Suarez-Lopez et al.，2001；Izawa et al.，2002；Kojima et al.，2002）。
菊花 CmFT 的表达型在不同的日照长度下表达不同，在短日照下有相对较高的积累，长日照下几乎
不表达，表明所克隆的 CmFT 对日照长短存在响应机制，与光周期诱导开花存在密切相关。短日照
条件下菊花 CmFT 在 1 d 内的表达型与牵牛花（P. nil）在短日照下的昼夜节律表达型类似，但与光
诱导条件下拟南芥、大麦（Hordeum vulgare）等植物存在相反的表达峰（Suarez-Lopez et al.，2001；
Faure et al.，2007；Hayama et al.，2007），这是否暗示着菊花 CmFT 昼夜节律表达型与短日照植物
牵牛花更为相似有待于进一步研究。此外，大多数植物光钝感特性与 CO/FT 类似基因间的昼夜节律
表达型密切相关（Turner et al.，2005；Beales et al.，2007；Wilhelm et al.，2009），探讨不同光周期
菊花品种 CO/FT 类似基因间的表达型差异将是培育光不敏感型菊花品种的重要研究方向之一。
菊花属于短日照植物，通常对日照长短较为敏感，存在花期短、花期相对集中等缺点。CmFT
的光周期敏感性响应机制的研究有助于了解菊花光周期途径的分子机理，为培育不同花期品种奠定
基础。

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