全 文 ：园 艺 学 报 2007，34(6)：1459—1464
Aeta Horticulturae Sinica
大白菜和结球甘蓝基因组原位杂交及核型分析
郄丽娟，申书兴 ，轩淑欣，王彦华，陈雪平，张成合，李晓峰，罗双霞
(河北农业大学园艺学院，河北保定071001)
摘 要 ：为研究 A、C基 因组间的亲缘关系和识别不同染色体，分别以大白菜 (AA)和结球甘蓝
(BB)的基因组总 DNA为探针，与大白菜和结球甘蓝的中期染色体杂交。结果表明，两种基因组总 DNA
在大白菜 2(】条染色体和结球甘蓝 18条染色体上都有杂交信号，但信号图型有明显差异。大白菜基因组总
DNA在大白菜和结球甘蓝染色体上的杂交信号几乎都只集中于近着丝粒区和核仁组织区，但在大白菜染色
体上的分布区域略大；结球甘蓝基因组总 DNA在其染色体上的杂交信号分散布满其全长，但在着丝粒区和
核仁组织区显示增强的信号带，而在大白菜中期染色体上则主要集中于着丝粒和近着丝粒区，且强度弱于
大白菜基因组总 DNA为探针的杂交信号。基于大白菜基因组 DNA的GISH信号对大白菜和结球甘蓝的核型
进行了分析。该研究结果为鉴别其种问杂种及其染色体的组成和同源关系提供了分子细胞学依据。
关键词：大白菜；甘蓝；基因组原位杂交；种间杂交；染色体；核型分析
中图分类号：S 634．1；S 635．1 文献标识码 ：A 文章编号：0513．353X (2007)06．1459-06
Karyotype Analysis of Chinese Cabbage and Cabbage by Genome in Situ
Hybridization
QIE Li-juan，SHEN Shu—xing ，XUAN Shu—xin，WANG Yan—hua，CHEN Xue—ping，ZHANG Cheng—he，
LI Xiao-feng，and LUO Shuang—xia
(Colege ofHorticulture，Agricultural University ofHebei，Baoding，Hebei 071001，China)
Abstract：In order to study the relationship and identify diferent chromosomes between the A and C ge—
nome of Brassica，the labeled genomic DNAs of Chinese cabbage and cabbage were respectively hybridized to
their metaphase chromosomes．Nonuniform distribution of the fluorescent labeled probe DNAs were observed
on al the chromosomes of two species tested．The signal patterns varied between species and were related to
the genome DNA probes．When Chinese cabbage genomic DNA was used as probe，the signals were almost
only in the pericentromeric regions and the nucleolus organizer regions(NORs)of Chinese cabbage and cab—
bage，but the signal regions were larger in form er than latter． While cabbage genomic DNA was used as
probe，the signals dispersed along the chromosome lengths of cabbage and enhanced signal bands were shown
in a1l Dericentromeres and the NORs；Only were observed in the pericentromeres and the NORs of Chinese
cabbage chromosomes，and that all the signal intensity was weaker than with genomic DNA probes of Chinese
cabbage．Karyotypes of Chinese cabbage and cabbage were analyzed based on GISH signals．The results pro‘
vided a molecular cytological basis for identification of interspecifc hybrids，their chromosomic components
and homologous between A and C genomes．
Key words：Chinese cabbage；Cabbage；Genome in situ hybridization；Interspecifc hybrid；Chromo—
some；Karyotype analysis
收稿日期：2007—06—25；修回日期：2007—09—03
基金项目：国家自然科学基金项目 (30471182)；河北省自然科学基金项 目 (C2005000222)；河北农业大学将帅计划项目
通讯作者 Author for corespondence(E-mail：shensx@mail．hebau．edu．cn)
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1460 园 艺 学 报 34卷
大白菜 (Brassica campestris L．ssp．pekinensis，AA，2n=20)和结球甘蓝 (Brassica oleracea var．
capitata L．，CC，2n=18)作为芸薹属的基本种，其起源演化、基因组间的亲缘关系以及细胞遗传学
的研究十分重要。Robbelen(1960)、Armstrong和 keler(1982)和Song等 (1988)研究认为，大白
菜和甘蓝是由更加原始的物种进化而来的，它们在进化过程中发生了大量的染色体变异。比较基因作
图分析表明，A、C物种基因组问具有高度的同源性 ，只是在长期的进化过程中，染色体可能发生融
合、分裂、重排，从而导致染色体数目的变化，同时也伴随着大片段染色体的易位和倒位 (Lagercra．
ntz&Lydiate，1996)。目前，在芸薹属作物上，染色体鉴定和核型分析是细胞遗传学研究的主题。现
今已有几种芸薹属作物的核型发表，多数是分析有丝分裂期经过不同染色方法处理的染色体 (Fukui
et a1．，1998；Hasterok&Maluszynska，2000；Kulak et a1．，2002；申书兴 等，2006；张成合 等，
2006)，也有少数是分析减数分裂期的染色体 (Mackowiak&Heneen，1999)，核型分析的方法包括常
规的Gimesa染色、C一带、G一带等和近年来发展的特异序列 (如45S rDNA、5S rDNA等)作探针的
荧光原位杂交 (FISH)。基因组原位杂交 (GISH)作为 FISH技术的改进技术，是分析自然多倍体、
杂种植物和它们的回交后代的起源、基因组组成及基因内重排的一个有用工具。在芸薹属作物上，利
用基因组原位杂交技术分析A、B和C基因组问的亲缘关系的研究已有报道 (Snowdon et a1．，1997，
2002；李宗芸 等，2002，2003)，但迄今还没有被用于染色体的识别和核型分析中。
本研究以大白菜基因组 DNA和结球甘蓝基因组 DNA为探针，分别在大白菜和结球甘蓝的中期染
色体上进行基因组原位杂交，并基于 GISH信号对大白菜和结球甘蓝进行核型分析，旨在为研究 A、
C基因组问的亲缘关系和精确鉴别两个基因组及其杂种中不同染色体提供依据。
1 材料与方法
1．1 材料及其染色体制片
供试材料为二倍体大白菜 ‘85．1M’和二倍体结球甘蓝 ‘中甘 11’。染色体制片参照 Song和
Gustafson(1995)的方法，略作修改。当根尖长至 1 am左右时，切取生长旺盛的根尖约 0．2 mm于
0．002 mol／L 8一羟基喹啉中预处理2 h，重蒸水充分洗净后用新鲜卡诺固定液4~C下固定24 h，水洗
后置于2％酶混合液 (纤维素酶：果胶酶=1：1)中，25~C下酶解约2．5 h。水洗并固定后采用火焰干
燥法制片，一20℃保存备用。
1．2 基因组 DNA的提取及标记
采用 CTAB法提取大白菜和甘蓝的基因组总 DNA，DIG-Nick Translation kit试剂盒对基因组 DNA
进行标记，具体标记方法参照Roche公司提供的产品使用说明进行。点印迹法检测标记效果。
1．3 原位杂交
参照杭超等 (1999)的方法略做修改。制备好的染色体标本，在 60~C烘箱内烤 1 h，70~C下用 2
倍柠檬酸钠氯化钠缓冲液 (2×SSC)配制的70％去离子甲酰胺变性2．5 min，立即在 一20~C下预冷的
70％、95％、100％酒精系列浸洗脱水各 5 min。在染色体变性的同时配制杂交液，75~C下变性5 min，
迅即置于冰上至少 5 min，备用。酒精系列浸洗脱水后取出的标本在空气中充分干燥，之后加杂交液
和盖片在保湿盒中37℃下杂交 16～21 h。
1．4 杂交信号的荧光检测
杂交后用2×SSC依次在室温、37~C各浸洗 10 min，接着在室温下用2×SSC和 1倍磷酸盐缓冲液
(1×PBS)各浸洗 5 min。后依次加羊抗地高辛荧光素抗体、兔抗羊 FITC偶联物，37~C下每个程序控
制反应1 h，每次抗体反应后用1×PBS在室温下各浸洗3次，每次5 min。
1．5 图像检测及分析
杂交检测后染色体制片用 2 Ixg／mL DAPI复染。在荧光显微镜 (Zeiss Axioskop40)下观察，用
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园 艺 学 报 34卷
2．2 甘蓝基因组总DNA在大白菜和甘蓝中期染色体上的原位杂交结果
以甘蓝基因组总DNA为探针分别对大白菜和甘蓝的中期染色体进行原位杂交，杂交结果和信号
模式图如图版，3、4所示。
从图版中可以看出，以甘蓝的基因组总DNA为探针，在其自身染色体上杂交，杂交信号沿染色
体全长分布，单从信号图就可以清楚地看出l8条染色体的完整形态；只是在近着丝粒区和两堆染色
体短臂的末端信号强度比其它区域要强，表现为增强的信号带 (图版，3A和3B)。甘蓝基因组总
DNA在大白菜2O条染色体的近着丝粒区和2个NORs区也均有较强的杂交信号，而在染色体的其他
部位信号十分微弱，几乎观测不到 (图版，4A和4B)。
2．3 基于 GISH图像的核型分析
依据染色体的大小、臂比、随体的有无及GISH信号的特征，对大白菜和结球甘蓝的核型进行了
分析和比较。
由表 1和图版，5、6可见，大白菜的核型类型为基本对称性核型，核型公式为 2n=2x=10 m+
10 sm (2SAT)，其中有5对染色体 (1、2、5、6、8号)的臂比值在 1．01与 1．70之间，属于中部着
丝点类型 (m)，5对染色体 (3、4、7、9、10号)的臂比值在 1．71与3．0之间，为近中部着丝点类
型 (sm)，其中第 3号为带随体染色体 (SAT)，其臂比值类型和排序与前人研究不同 (Koo et a1．，
2004；申书兴 等，2006)。
结球甘蓝的核型类型为基本不对称性核型，核型公式为 2n=2x=18=8m+10sm (2SAT)，由4
个中部着丝点染色体 (2、4、6、7号)和 5个近中部着丝点染色体 (1、3、5、8、9号)组成，其
中第6号为带随体染色体，与前人研究结果相同 (李懋学和张赞平，1996；张成合 等，2006)。此
外，GISH信号在大白菜或结球甘蓝各对同源染色体上均表现出明显的特异性 (图版，5、6)，从而为
其核型分析的准确性提供了可靠依据。
表 1 大白菜和结球甘蓝体细胞中期染色体的核型参数
Table 1 Major characters of karyotype of the Chinese cabbage and cabbage metaphase chromosomes
大白菜 Chinese cabbage
结球甘蓝 Cabbage
9．96+7．16=17．12
7．56+4．74=12．3O
8．46+2．94=11．40
6．77+3．8O=10．57
5．39+4．8O=1O．19
5．39+3．88=9．27
5．53+2．65=8．18
4．62+2．88=7．40
4．51+2．42=6．93
4．14+2．38=6．52
9．11+4．65=13．76
6．59+5．96=12．55
8．5O+3．59=12．09
6．59+5．1O=11．69
7．78+3．58=11．36
7．47+2．66=1O．13
6．oo+3．6l=9．6l
5．26+4．19=9．45
6．70+2．66=9．36
1．39
1．59
2．87
1．78
1．12
1．39
2．09
1．6O
1 86
1．73
1．96
1．11
2．37
1．29
2．18
2．8O
1．66
1．26
2．51
sm(SAT)
Sm
Sm
Sm
sm(SAT)
l 2 3 4 5 6 7 8 9 O
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6期 郄丽娟等 ：大白菜和结球甘蓝基因组原位杂交及核型分析
3 讨论
在芸薹属作物上，Snowdon等 (1997，2002)和李宗芸等 (2002，2003)研究结果都表明 A、c
基因组亲缘关系较近，DNA序列间有着较高的同源性，利用 GISH不能区分 A、c基因组。本试验
中，无论用大白菜基因组 DNA作探针与甘蓝基因组染色体原位杂交，还是用甘蓝基因组 DNA作探针
与大白菜基因组染色体原位杂交，所有染色体上均有较强的信号出现，说明 A与 c基因组间确实存
在着高度的同源性，这和前人的研究结果一致。但是从大白菜、甘蓝基因组总 DNA为探针分别与二
者染色体杂交结果来看，信号在染色体上的分布及大小还是有区别的，如大白菜基因组总 DNA在大
白菜染色体上的分布区域较在甘蓝上的分布区域大得多；甘蓝基因组总 DNA在大白菜染色体上仅富
集于近着丝粒处，而在甘蓝染色体上除在近着丝粒处富集成带外，在染色体长短臂上也弥散着杂交信
号，这反映了A与 c基因组间 DNA序列分布的差异。因此，根据大白菜或甘蓝任何一个物种的基因
组总DNA在两个物种染色体上 GISH杂交图型的差异，可以将两个物种的染色体区分开来，这为分
析两个物种远缘杂交及回交后代中不同染色体的来源奠定了基础。
从理论上来讲，基因组 DNA在自身染色体上的原位杂交，杂交信号应该很强并位于整条染色体
上，这在小麦 (林小虎 等，2005)、棉花 (郝林 等，2006)等作物上的研究已被证实。而在本研究
中，以大白菜基因组总DNA为探针在两个物种上杂交时，杂交信号主要集中于近着丝粒区域 ，甘蓝
基因组总 DNA在甘蓝染色体上虽然沿全长分布，但也是仅在其亚着丝粒区域有很强的信号带，在其
它区域信号很弱，在前人的研究中对这一现象也有描述 (Snowdon et a1．，1997；Benabdlmouna et a1．，
2001)，推测可能是由于重复序列集中分布在染色体亚着丝粒区域，容易杂交，而染色体末端区域富
含低或单拷贝序列，不易与探针杂交之故。如此说来，对 A与 c基因组间有明显差异的解释是 c基
因组的染色体臂上可能分布着一部分重复序列，而 A基因组的染色体臂上则很少。这也说明A、c基
因组虽然同源性高，但在长期的物种分化和进化过程中出现了较大差异，形成两个物种。
芸薹属作物的染色体很小，相邻染色体形态又非常相似 (Fukui et a1．，1998)，因此不同研究者
所得出的染色体的长度和臂比值是不同的。此外，由于长短臂异染色质含量不同，染色体在有丝分裂
中期浓缩程度的不同使单个染色体的鉴别变的不确定，也使染色体在核型中的排序变的不一致，从而
导致了在早期芸薹属物种核型研究中存在不同的命名和染色体编号 (Olin—Fatih& Heneen，1992；
Maluszynska& Heslop—Harrison，1993；Cheng et a1．，1995；Hasterok& Maluszynska，2000；Koo et a1．，
2004)，同时这也可能是本研究中大白菜染色体的编号与前人研究不同的原因。尽管如此，GISH信号
在大白菜或结球甘蓝各对同源染色体上所表现出的明显的特异性，为今后不同研究者在这两个物种核
型分析中染色体编号的统一奠定了基础，从而也为芸薹属其他物种的核型分析提供了借鉴。因此，在
芸薹属作物上，GISH技术将成为核型分析的一种有效的方法。
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