全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 431 - 436
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 08 - 23; 修回日期 : 2007 - 03 - 12
基金项目 : 安徽省自然科学基金项目 (070411010) ; 安徽省科技厅重点项目 (04023069)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hxl@ njau1edu1cn)
蝴蝶兰叶片离体培养胚状体的发生及组织学观察
崔广荣 1, 2 , 侯喜林 13 , 张子学 2 , 张从宇 2 , 胡能兵 2 , 刘跃成 2
(1 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095; 2 安徽科技学院植物科学系 , 安徽凤阳 233100)
摘 　要 : 以蝴蝶兰试管苗幼叶为外植体 , 以 1 /2MS为基本培养基 , 研究了不同浓度 6 - 苄基腺嘌呤
(62BA)、腺嘌呤硫酸盐 (Ad)、萘乙酸 (NAA) 及其组合对胚状体发生的影响 , 同时也探讨了蔗糖浓度及
椰汁添加量对胚状体形成的影响。结果表明 : 细胞分裂素 62BA对胚状体的诱导效果较 Ad好 , NAA与二者
配合使用可提高胚状体的发生率 , 其最佳浓度组合为 62BA 410 mg/L + Ad 210～410 mg/L + NAA 110～210
mg/L。蔗糖 20～40 g/L +椰汁 200 mL /L有利于胚状体的形成。组织学观察表明 , 胚状体起源于叶片气孔
附近的上表皮细胞或上表皮下方的叶肉组织细胞 , 为单细胞起源 , 其发育过程与一般植物胚状体发生发育
特征相似 , 最终发育成为类原球茎。
关键词 : 蝴蝶兰 ; 叶片 ; 胚状体 ; 组织培养 ; 组织学观察 ; 原球茎
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220431206
Eff ic ien t Soma tic Em bryogenesis from L eaf Explan ts of Pha laenopsis in V itro
Culture and H istolog ica l O bserva tion s
CU I Guang2rong1, 2 , HOU Xi2lin13 , ZHANG Zi2xue2 , ZHANG Cong2yu2 , HU Neng2bing2 , and
L IU Yue2cheng2
(1 College of Horticulture, N an jing A gricu ltura l U niversity, N anjing 210095, China; 2 Plant Science D epartm en t of A nhu i Science
and Technology U niversity, Fengyang, A nhu i 233100, China )
Abstract: The leaves of Phalaenopsis were used as exp lants and cultured in the 1 /2MS basic medium
with different kinds of p lant growth regulators for somatic embryos induction. The effects of different concentra2
tions of three kinds of p lant growth regulators of 62BA , Ad, NAA and their combinations on somatic embryo2
genesis were studied in in vitro culture. Meanwhile, the influences of the concentrations of sucrose and coco2
nut water on somatic embryogenesis were studied, too. The results showed that the effects of cytokinins 62
benzyladenine (62BA ) was better than adenine sulphate (Ad) in embryoid induction. The auxin A2naphtha2
lene acetic acid (NAA ) combined with given concentrations of 62BA and Ad could effectively raise the fre2
quency of somatic embryogenesis. The op timum p lant growth regulator combination for somatic embryogenesis
was 62BA 410 mg/L +Ad 210 - 410 mg/L +NAA 110 - 210 mg/L. 20 - 40 g /L sucrose and 200 mL /L co2
conut water added in the medium was of benefit to somatic embryogenesis. The results of histological observa2
tions indicated that somatic embryos originated from upper ep iderm is and mesophyll single cell nearby stoma.
The course of somatic embryos development was sim ilar to other p lants. Finally, the somatic embryos became
p rotocorm2like body.
Key words: Pha laenopsis; Leaf; Somatic embryo; Plant tissue culture; H istological observation; Proto2
corm2like body
蝴蝶兰 ( Phalaenopsis) 的人工繁殖主要通过种子无菌发芽和组织离体培养 (刘真华 等 , 2005;
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
魏琪 等 , 2006) 两条途径进行。离体茎尖、叶片等经培养后产生类原球茎 ( Protocorm2like body,
PLB )。类原球茎的发生途径可通过愈伤组织 ( Park et al. , 2003) 或由茎尖、幼叶等器官直接产生
(Begum et al. , 1994; Ishii et al. , 1998; Chen et al. , 1999)。许多研究者认为兰花体细胞胚胎的发
生是 PLB形成的早期阶段 , 蝴蝶兰类原球茎的诱导过程就是典型的体细胞胚胎发生过程 (Begum et
al. , 1994; Chen et al. , 1999, 2006; 秦凡和周吉源 , 2003)。关于蝴蝶兰叶片离体培养直接诱导胚
状体虽有少数报道 (Begum et al. , 1994; Chen et al. , 2006) , 但诱导效率不高 , 所用植物生长调节
剂也是价格极为昂贵的 TDZ等。本试验以蝴蝶兰试管苗幼叶片段为外植体 , 系统研究了最为常用的
几种植物生长调节剂的不同浓度及其组合、新鲜椰汁、蔗糖浓度等多种因子对胚状体发生的影响 , 建
立了蝴蝶兰叶片离体培养胚状体高效发生体系 ; 同时对发生胚状体的叶片进行了组织学观察 , 试图阐
明蝴蝶兰类原球茎发生发育的组织细胞学特征及其分化成苗的一些组织培养特性 , 为进一步研究兰花
胚状体形成的机制以及完善工厂化育苗技术提供一定的参考依据。
1　材料与方法
材料为安徽科技学院通过花梗芽培育的蝴蝶兰试管苗 , 品种为条纹花系 ‘霍娅淑女 ’, 所用外植
体为 3～4片叶试管苗的顶部两片叶。基本培养基为 1 /2MS, 添加 410 g/L琼脂粉作为凝固剂 , 高压
灭菌前用 110 mol/L KOH溶液调节 pH 515。植物生长调节剂组合、蔗糖浓度、添加椰汁量等见表 1～
4。将叶片切成约 1 cm见方接种于不同的培养基上 , 每处理 10瓶 , 每瓶接种 4块 , 叶片正面向上。
培养室温度 (25 ±1) ℃, 光照强度约 1 500 lx (光源为 40 W日光灯 ) , 光照时间 12 h /d。
待叶片表面出现芽点状突起时 , 制作常规石蜡切片 , 切片厚度 8μm , 番红、固绿染色 , 光学显
微镜下拍照 (O lympus2CY30, Japan)。接种后 50 d统计胚状体或愈伤组织发生情况。形成率 =形成
胚状体块数 /接种外植体总块数。
2　结果与分析
211　植物生长调节剂对叶片胚状体诱导的影响
21111　62BA和 NAA及其组合的影响 　如表 1所示 , 62BA对胚状体的形成起关键作用 , 单独使用
62BA或与 NAA配合使用 , 均能诱导原球茎或愈伤组织的形成 , 但 NAA单独使用时则不能。
表 1　62BA和 NAA对蝴蝶兰叶片诱导胚状体的影响
Table 1　Effects of 62BA and NAA on soma tic em bryogenesis from Pha laenopsis leaf
处理号
Treatment code
62BA
(mg/L)
NAA
(mg/L)
形成胚状体时间
Time of somatic
embryogenesis formed ( d)
胚状体数
Number of somatic
embryogenesis
形成率
Somatic embryogenesis
formed rate ( % )
愈伤组织
Callus
I21 010 010 0 010e 2
I22 010 110 0 010e 2
I23 010 210 0 010e 2
I24 210 010 0 010e +
I25 210 110 47 2 510d +
I26 210 210 45 5 1215cd + +
I27 410 010 40 9 2215bc 2
I28 410 110 40 12 3010b 2
I29 410 210 40 15 3715a 2
I210 810 010 38 7 1715c 2
I211 810 110 37 16 4010a 2
I212 810 210 37 15 3715a 2
　　注 : 基本培养基为 1 /2MS +蔗糖 20 g/L +椰汁 200 mL /L; “ + ”表示有极少量愈伤组织 , “ + + ”表示有少量愈伤组织 , “2”表
示无愈伤组织 ; 小写字母表示 5%水平上差异显著。
Note: Basic medium is 1 /2MS + sucrose 20 g/L + coconut water 200 mL /L; “ + ”means few of calli; “ + + ”means a few of calli; “2”
means no callus; D ifferent small letters mean significance at P < 0105.
234
　2期 崔广荣等 : 蝴蝶兰叶片离体培养胚状体的发生及组织学观察 　
62BA在低浓度 (210 mg/L) 单独作用时 , 只能形成极少量的愈伤组织 , 而与 NAA配合使用时 ,
既有少量愈伤组织又有少数胚状体形成。62BA在较高浓度 (410～810 mg/L ) 时 , 均有胚状体产生 ,
但无 NAA配合使用时 , 胚状体的形成率相对较低 , 而有 NAA 配合使用时形成率显著提高 , 可达
3715% ～4010%。另外 , 叶片表面产生肉眼可见胚状体的培养时间随 62BA浓度的提高而缩短。虽然
NAA单独使用不能诱导出胚状体或愈伤组织 , 但其与 62BA的配合使用能有效提高胚状体的形成率。
在所有的处理中 , 从接种后 3 d起 , 叶片伤口处的分泌物逐渐褐化 , 随着培养时间的延长 , 褐化程度
逐渐加重 , 最终使培养基褐变 (图版 , A) , 各处理间无明显差异。
21112　Ad和 NAA及其组合的影响 　如表 2所示 , 不同浓度 Ad (腺嘌呤硫酸盐 ) 及其与 NAA的配
合使用对蝴蝶兰叶片胚状体的发生影响较大。Ad在单独使用时不能诱导胚状体的形成或形成率低。
与 NAA配合使用时 , 只有在浓度为 210 mg/L和 410 mg/L时胚状体的形成率相对较高 , 而在高浓度
810 mg/L时胚状体的形成率反而降低 , 培养的部分叶片在培养后期有黄化现象。总体来看 Ad的诱导
效果较 62BA差 , 不能诱导愈伤组织的形成。Ad在高浓度时能缩短胚状体发生的培养时间 , 这一点与
62BA作用效果相似。NAA在与较低浓度的 Ad配合使用时也能有效促进胚状体的形成。
表 2　Ad和 NAA对蝴蝶兰叶片诱导胚状体的影响
Table 2　Effects of Ad and NAA on soma tic em bryogenesis from Pha laenopsis leaf
处理号
Treatment code
Ad
(mg/L)
NAA
(mg/L)
形成胚状体时间
Time of somatic
embryogenesis formed ( d)
胚状体数
Number of somatic
embryogenesis
形成率
Somatic embryogenesis
formed rate ( % )
愈伤组织
Callus
II21 010 010 0 010e 2
II22 010 110 0 010e 2
II23 010 210 0 010e 2
II24 210 010 0 010e 2
II25 210 110 47 4 1010c 2
II26 210 210 47 7 1715b 2
II27 410 010 45 6 1510b 2
II28 410 110 45 10 2510a 2
II29 410 210 36 11 2715a 2
II210 810 010 33 2 510d 2
II211 810 110 32 4 1010c 2
II212 810 210 33 3 715cd 2
　　注 : 基本培养基为 1 /2MS +蔗糖 20 g/L +椰汁 200 mL /L; “2”表示无愈伤组织。
Note: Basic medium is 1 /2MS + sucrose 20 g/L + coconut water 200 mL /L ; “2”means no callus.
21113　62BA、Ad和 NAA组合的影响 　表 3的结果表明 , 62BA、Ad和 NAA的组合能显著提高胚状
体的发生率 , 表现出较强的协同效应。其中处理 Ⅲ25的诱导率达到了 6510% , 诱导率最低的处理 Ⅲ2
8也达到了 3715%。62BA 410 mg/L、Ad 210～410 mg/L、NAA 110～210 mg/L的组合较为适宜。
表 3　62BA、Ad和 NAA组合对蝴蝶兰叶片诱导胚状体的影响
Table 3　Effects of 62BA, Ad and NAA on soma tic em bryogenesis from Pha laenopsis leaf
处理号
Treatment code
62BA
(mg/L)
Ad
(mg/L)
NAA
(mg/L)
形成胚状体时间
Time of somatic
embryogenesis formed ( d)
胚状体数
Number of somatic
embryogenesis
形成率
Somatic embryogenesis
formed rate ( % )
愈伤组织
Callus
Ⅲ21 410 210 110 35 24 6010 a 2
Ⅲ22 410 410 110 35 20 5010 b 2
Ⅲ23 810 210 110 40 16 4010 c 2
Ⅲ24 810 410 110 41 17 4215 c 2
Ⅲ25 410 210 210 33 26 6510 a 2
Ⅲ26 410 410 210 32 25 6215 a 2
Ⅲ27 810 210 210 40 19 4715 b 2
Ⅲ28 810 410 210 39 15 3715 d 2
　　注 : 基本培养基为 1 /2MS +蔗糖 20 g/L +椰汁 200 mL /L; “2”表示无愈伤组织。
Note: Basic medium is 1 /2MS + sucrose 20 g/L + coconut water 200 mL /L ; “2”means no callus.
334
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
212　蔗糖浓度及椰汁对叶片胚状体诱导的影响
关于蔗糖浓度及椰汁对蝴蝶兰类原球茎诱导的影响相关研究已有一些报道 (鲁雪华 等 , 2002;
何松林 等 , 2003; Chen et al. , 2006) , 但结果不尽相同 , 除了与品种、外植体、培养条件等不同因
素有关外 , 培养基中的植物生长调节剂种类和浓度是不可忽视的重要因素。表 4结果表明 , 在经过 62
BA、Ad和 NAA优化组合的培养基中添加椰汁添加 200 mL /L较为合适。在椰汁添加量不变的情况
下 , 随着蔗糖浓度增加 , 胚状体形成率也有增大的趋势。在椰汁添加量为 200 mL /L时 , 培养基中蔗
糖浓度为 20～40 g/L时较适合胚状体的形成。
表 4　蔗糖及椰汁对叶片胚状体诱导的影响
Table 4　Effects of sucrose and coconut wa ter on soma tic em bryogenesis from Pha laenopsis leaf
处理号
Treatment code
椰汁
Coconut water
(mL /L)
蔗糖
Sucrose
( g/L)
形成胚状体时间
Time of somatic
embryogenesis formed ( d)
胚状体数
Number of somatic
embryogenesis
形成率
Somatic embryogenesis
formed rate ( % )
愈伤组织
Callus
IV21 100 10 40 18 4510c 2
IV22 200 10 35 18 4510c 2
IV23 400 10 32 17 4215cd 2
IV24 100 20 39 20 5010bc 2
IV25 200 20 33 27 6715a 2
IV26 400 20 32 22 5510b 2
IV27 100 40 37 21 5215b 2
IV28 200 40 33 28 7010a 2
IV29 400 40 33 25 6215ab 2
　　注 : 基本培养基为 1 /2MS + 62BA 410 mg/L +Ad 210 mg/L +NAA 210 mg/L; “2”表示无愈伤组织。
Note: Basic medium is 1 /2MS + 62BA 410 mg/L +Ad 210 mg/L +NAA 210 mg/L; “2”means no callus.
213　胚状体发生发育的组织学观察
叶片形成绿色芽点状胚状体和黄绿色愈伤组织的部位主要位于叶片表面和切口边缘 (图版 , A、
B) , 胚状体的形成主要起源于叶片上表皮气孔附近的单细胞或上表皮细胞下方的一些叶肉细胞 (图
版 , E、F)。Chen等 (2006) 也证明蝴蝶兰叶片胚状体起源于叶片上表皮的单细胞 , 但他们未见胚
状体起源于叶肉细胞。发生胚状体的原始细胞的细胞质浓厚 , 染色较深 , 与周围其余细胞有着较为明
显的界限 (图版 , E、F) , 这与一般的体细胞胚胎发生的特征类似。原始细胞经过多次分裂后 , 较快
地形成细胞较小、胞质浓厚的多细胞球形胚 (图版 , G、H ) , 但仍与其它组织有较紧密的联系。叶
表皮形成的多细胞胚继续发育成拳头状突起的心形胚 (图版 , I、J ) , 整个胚体随着发育的推进 , 与
周围其它组织的联系越来越疏松 , 处于联结部位的其它叶肉组织细胞拉长变大 , 成为结构疏松的薄壁
组织 (图版 , J、K箭头所示 ) , 这一方面可能与迅速膨大的体细胞胚营养物质的运输有关 , 另一方面
也为发育长大成为原球茎个体易于从母体叶片的分离奠定了组织学基础。突起的心形胚继续发育 , 其
周边的细胞分裂生长迅速 , 中间逐渐凹陷 , 最终形成类似于典型的植物茎尖生长点结构状的心形胚。
这种体胚已是相当成熟 , 进一步发育即形成较大的颗粒状的原球茎 (图版 , C)。另外 , 发育中的胚
状体一些细胞也可作为新的胚状体发生的原始细胞 , 形成新的胚状体 (图版 , L ) , 这可能是原球茎
不断分裂形成一团类似桑葚果状类原球茎的细胞组织学基础。
214　原球茎增殖及分化成苗
将叶片诱导形成的胚状体 (或类原球茎 ) 连同部分叶片切下在上述筛选的诱导效果最好的培养
基中继代培养 (图版 , B ) , 直至形成肉眼可见的嫩绿色、颗粒状的原球茎 (图版 , C) , 再转瓶于含
有不同种类、浓度激素的分化苗培养基中培养 (数字未列 )。约 3周 , 类原球茎从顶部分化出 1～2
片幼叶 (图版 , D)。总的来看蝴蝶兰类原球茎分化苗较为容易 , 低浓度激素甚至不加任何外源激素
均可有效再生成苗 , 且随着培养时间的延长 , 再生成苗率不断提高。
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　2期 崔广荣等 : 蝴蝶兰叶片离体培养胚状体的发生及组织学观察 　
3　讨论
62BA、Ad和 NAA配合使用能有效诱导蝴蝶兰叶片胚状体的发生 , 其最佳浓度组合为 62BA 410
mg/L +Ad 210～410 mg/L +NAA 110～210 mg/L。在此植物生长调节剂条件下 , 蔗糖浓度及椰汁的
添加量对胚状体的诱导率会产生一定的影响 , 蔗糖 20～40 g/L +椰汁 200 mL /L较为适合蝴蝶兰叶片
胚状体的形成。组织学观察表明 , 胚状体起源于叶片气孔附近的上表皮细胞或上表皮下方的叶肉组织
细胞 , 为单细胞起源。其发育过程与一般植物胚状体发生发育特征相似 , 最终形成为成熟的胚状体
———类原球茎。蝴蝶兰类原球茎比较易于分化发育成新的植株。
本试验的结果从组织学的角度进一步证明了蝴蝶兰离体培养叶片胚状体或类原球茎的发生可从上
表皮单细胞或靠近上表皮的叶肉细胞起源 , 其发生发育过程同一般的植物相似。但就胚细胞起源来
看 , 又与其它植物不同 , 胚细胞仅起源于叶片上表皮细胞或上表皮下方的一些叶肉细胞 , 而未见叶片
下表皮细胞起源的胚细胞 , 其原因还有待于进一步的研究。
本试验结果与秦凡和周吉源 (2003) 研究认为 62BA在促进蝴蝶兰体细胞胚胎发生过程中起着决
定作用的观点一致 , 62BA在较高浓度下与 Ad、NAA相互配合使用时获得了高效的胚状体诱导体系。
这 3种植物生长调节剂的配合使用 , 特别是 62BA和 Ad的配合使用对文心兰原球茎的诱导、增殖和
丛芽的诱导、增殖也有较强的 “加性效应 ” (崔广荣 等 , 2004, 2005)。这些结果提示我们 , 这 3种
植物生长调节剂的优化组合有可能对其它兰花尤其是洋兰胚状体的发生、原球茎的诱导、增殖有较好
的促进作用 , 这还有待进一步的试验证明。
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图版说明 : A. 叶片表面形成芽点状突起的胚状体 (箭头所示 ) ; B. 连同叶片切下的胚状体继代培养 ; C. 继代增殖生长的原球茎 ;
D. 原球茎分化苗 ; E. 起源于气孔附近叶片上表皮细胞的多细胞胚 (箭头所示 , 40 ×) ; F. 起源于气孔附近叶片上表皮细胞和叶肉细
胞的多细胞胚 (箭头所示 , 100 ×) ; G. 起源于叶肉细胞的圆球胚 (箭头所示 , 100 ×) ; H. 来源于叶肉细胞的球形胚从叶片表面突起
( 40 ×) ; I. 发育成熟过程中与周围组织联系较为紧密的心形胚 ; J. 发育成熟胚与其它组织联系疏松 (40 ×) ; K. 类似于植物茎尖生长
点结构的成熟心形胚 (40 ×) ; L. 胚体上又发生次生胚 (箭头所示 , 100 ×)。
Explana tion of pla tes: A. Embryoid formed in the upper surface of leaf exp lants ( arrow) ; B. Embryoid subcultured in the op timum medium ;
C. Protocorm2like body ( PLB) p roliferation in subculture; D. Plantlets regeneration from PLB s; E. Somatic embryos originated from upper ep i2
derm is single cell nearby stoma ( arrow, 40 ×) ; F. Somatic embryos originated from upper ep iderm is and mesophyll single cell nearby stoma ( ar2
row, 100 ×) ; G. Poly2cell somatic embryos originated from mesophyll cell ( arrow, 100 ×) ; H. Globular embryoid p rotruding from the surface of
leaf exp lants (40 ×) ; I. Heart2shaped embryoid linked closely with other tissue during development (40 ×) ; J. Mature heart2shaped embryoid
linked loosely with other tissue (40 ×) ; K. Mature heart2shaped embryoid sim ilar to the structure of p lant shoot2tip ( arrow, 40 ×) ; L. Seconda2
ry somatic embryo on the embryoid ( arrow, 100 ×) .
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