全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (4) : 842～844
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 05 - 24; 修回日期 : 2005 - 09 - 19
基金项目 : 江西省科技厅重点科研资助项目 (963007)3 现工作单位河南科技学院园艺系
玻璃化法超低温保存猕猴桃离体茎尖及其植株再生
徐小彪 1 　辜青青 1 　蔡祖国 13 　邓小梅 2 　张秋明 3
(1 江西农业大学农学院 , 江西南昌 330045; 2 江西林业科学院生物技术研究所 , 江西南昌 330032; 3 湖南农业大学园
艺园林学院 , 湖南长沙 410128)
摘 　要 : 以中华猕猴桃矮型种质为离体培养材料 , 建立试管无性系 , 对其离体茎尖的玻璃化法超低温保
存技术进行研究 , 探讨猕猴桃种质长期保存的适宜途径。结果表明 , 含 1～2个叶原基 (115～215 mm) 的茎
尖 , 在 5%二甲基亚砜 (DMSO) + 5%蔗糖 +MS培养基上预培养 4 d后 , 于室温下用 2 mol/L甘油 + 014 mol/
L蔗糖预处理 30 m in, 再在 0℃下用玻璃化液 ( PVS2 ) 脱水处理 40 m in并迅速投入液氮中 , 保存 24 h后接种
至继代培养基上再培养 , 成活率和再生率分别为 5617%和 5116%。再生植株生根后可移栽成活。
关键词 : 猕猴桃 ; 茎尖 ; 玻璃化法 ; 超低温保存
中图分类号 : S 66314　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0420842203
Cryopreserva tion of in V itro Cultured K iw ifru it Shoot2tips by V itr if ica tion
and the ir Regenera tion
Xu Xiaobiao1 , Gu Q ingqing1 , Cai Zuguo1 , Deng Xiaomei2 , and Zhang Q ium ing3
(1A gronom y College of J iangxi A gricultural U niversity, N anchang, J iangx i 330045, Ch ina; 2 Institu te of B iotechnology Re2
search, J iangxi A cadem y of Forestry Sciences, N anchang, J iangx i 330032, Ch ina; 3 College of Horticulture and Gardening, Hu2
nan A gricultural U niversity, Changsha, Hunan 410128, China)
Abstract: Experiments were conducted to p rovide an app rop riate means for long2term p reservation of ki2
wifruit germp lasm using cryop reservation by vitrification. Shoot2tip s of a dwarf genotype of kiwifruit were cul2
tured in vitro to obtain asep tic clones. The results showed that shoot2tip s 115 - 215 mm in length with one or
two leaf p rimordium were p recultured in 5% DMSO + 5% sucrose +MS medium for 4 days. Pretreated shoot2
tip s with 2 mol/L glycerol + 014 mol/L sucrose for 30 m in at room temperature, followed by dehydration with
PVS2 (30% glycerol + 15% ethylene glycol + 15% DMSO + 014 mol/L sucrose) for 40 m in at 0℃ and rap id2
ly put into liquid nitrogen for 24 h. The defrosted shoot2tip s were then inoculated onto subculture medium.
The survival and regeneration rate of shoot2tip s treated in this way was 5617% and 5116% respectively. The
p lantlets could normally root and survive after transp lanting.
Key words: Kiwifruit; Shoot2tip; V itrification; Cryop reservation
1　目的、材料与方法
猕猴桃 (A ctind ia ch inensis Planch) 以种子保存后代性状易发生分离 ; 田间活体保存难以避免自
然灾害和病虫危害 ; 常规的离体保存方法需经常继代 , 容易污染和发生体细胞变异 , 故选择超低温技
术来保存猕猴桃种质具有实际意义。玻璃化法超低温保存已成功应用于柑橘〔1〕、柿〔2〕、番木瓜〔3〕、
扁桃〔4〕、樱桃〔5〕等组织和细胞保存。现以矮型中华猕猴桃特异种质为材料 , 研究玻璃化法超低温保
存离体茎尖的方法和途径 , 以期为猕猴桃资源的可持续利用提供借鉴。
供试材料为中华猕猴桃矮型种质 ‘赣猕 5号 ’, 以离体培养的试管无性系为材料进行超低温保
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　4期 徐小彪等 : 玻璃化法超低温保存猕猴桃离体茎尖及其植株再生 　
存。于 7月中旬选取生长健壮的当年生幼嫩茎段 (长约 10 cm) , 4℃下保存 5 d后用洗洁精溶液浸泡
5 m in, 70%的酒精漂洗 30 s, 无菌水冲洗 1次 , 用 011%的升汞灭菌约 10 m in后无菌水冲洗 4～6次 ,
置于无菌滤纸上 , 将其切成 110～115 cm的单芽茎段 , 迅速接种于诱导培养基 (MS +BA 210 mg/L +
NAA 011 mg/L) 上 , 每瓶接种 1～2个外植体。增殖培养基为 MS +BA 110 mg/L +NAA 011 mg/L , 生
根培养基为 1 /2 MS + IBA 015 mg/L。
低温锻炼 : 选取继代 20 d的猕猴桃嫩梢 (长约 1 cm) , 继代到含蔗糖 3%的 MS (1 /2N) 培养基上 ,
5℃低温下锻炼 6周 ; 经低温锻炼的猕猴桃嫩梢 , 在解剖镜下切取含有 1～2个叶原基的茎尖 (长 115～
215 mm) , 于 5% DMSO + 5%蔗糖 +MS培养基上进行预培养〔1, 3〕, 预培养时间依处理不同而异。每处理
20个茎尖 , 3次重复。预培养后的茎尖转移到 118 mL的冷冻管中 , 每管 10个 , 室温下加入装载液 (2
mol/L甘油 + 014 mol/L蔗糖 ) 处理 30 m in〔2, 3〕之后用 PVS2〔6〕溶液于 0℃下处理不同的时间。移去原液 ,
换 1次新鲜的 PVS2溶液 , 然后将冷冻管装在金属套 (2管 ) 上迅速投入到液氮中。每处理 2管共 20个
茎尖 , 3次重复 ; 保存 24 h后 , 从液氮中取出冷冻管 , 于 40℃下迅速化冻 1 m in, 用 112 mol/L的蔗糖
+MS培养基洗涤 2次 , 每次 10 m in。然后取出茎尖转入继代培养基上进行再培养 , 1周后统计其成活率
(茎尖颜色恢复为绿色 , 部分长芽的茎尖占总茎尖数的百分率 ) , 1个月后统计其植株再生率 (再生成嫩
梢的茎尖数占总茎尖数的百分率 )〔3〕。转入到生根培养基上诱导生根后移入温室炼苗。
2　结果分析与讨论
211　预培养对猕猴桃茎尖超低温保存效果的影响
预培养对提高超低温保存后的成活率有较大的影响。本试验表明 , 猕猴桃离体茎尖于 5% DMSO
+ 5%蔗糖 +MS培养基上分别预培养 0～7 d对超低温保存后的效果有显著影响 (表 1)。在预培养初
期 (1～4 d) , 成活率逐渐增加 , 但后期 (5～7 d) 迅速下降。预培养 4 d以后 , 由于 DMSO的毒害
作用 , 材料叶片开始变黄、脱落 , 7 d后叶片全部变黄 , 此时剥下茎尖进行再培养 , 不能再生。预培
养以 4 d最佳 , 成活率和再生率分别达 5214%和 5012%。
表 1　不同预培养时间对猕猴桃茎尖超低温
保存效果的影响
Table 1　Effect of d ifferen t preculture tim e on
cryopreserva tion of k iw ifru it shoot2tips ( % )
预培养时间
Preculture time ( d)
成活率
Survival rate
再生率
Regeneration rate
1 1212 ±611a 817 ±419a
2 817 ±819b 2513 ±713b
3 4316 ±915d 4019 ±912d
4 5214 ±918e 5012 ±916e
5 4215 ±917d 3917 ±717d
6 3117 ±817c 2815 ±614c
7 2616 ±716b 2318 ±513b 表 2　不同 PVS2处理时间对猕猴桃茎尖超低温保存效果的影响Table 2　Effect of d ifferen t trea tm en t tim e w ith PVS2 oncryopreserva tion of k iw ifru it shoot2tips ( % )PVS2处理时间PVS2 treatment time (m in) 成活率Survival rate 再生率Regeneration rate10 1115 ±618a 912 ±413a20 1618 ±715b 1416 ±517b30 4912 ±912d 4618 ±718d40 5617 ±916e 5116 ±910e50 4616 ±918d 4315 ±718d60 2119 ±718c 1817 ±517c
212　PVS2 处理对猕猴桃茎尖超低温保存效果的影响
PVS2 溶液处理可以进一步使组织脱水 , 由于 DMSO等对脂溶性物质有很大的穿透力 , 使一些易
形成玻璃化状态的分子 (DMSO、EG、Gly) 很快进入到茎尖组织 , 一旦快速冷冻 , 茎尖组织形成玻
璃化状态 , 可以减轻伤害 , 成活率得以提高〔1〕。但 DMSO等会对材料造成伤害 , 不同程度地降低成
活率 , 低温 (0℃) 比室温可以减少该溶液对材料的毒害〔2〕。由表 2可知 , 将预培养 4 d的经 2 mol/L
Gly + 014 mol/L蔗糖预处理 30 m in的茎尖 , 置于 PVS2 溶液中处理 , 40 m in的最佳 , 成活率和再生率
分别为 5617%和 5116%。
213　猕猴桃超低温保存后再生植株的形成
离体茎尖液氮中保存 24 h后 , 于 40℃下迅速化冻。用 112 mol/L的蔗糖 +MS培养基洗涤 2次 ,
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
每次 10 m in。然后转入继代培养基上进行再培养 , 1周后可获得 5617%的成活率 , 1个月后其植株再
生率为 5116%。解冻后进行恢复培养 2周 , 茎尖叶原基处长出新芽 (图版 , A)。继代培养 12周 , 大
部分茎尖萌发幼苗 (图版 , B ) , 几乎没有愈伤组织的形成。最后将再生植株转入到生根培养基上进
行生根培养 (图版 , C) , 生根后移入到温室内炼苗 (图版 , D)。
猕猴桃茎尖超低温保存较适宜的程序为 : 继代 20 d的 1 cm长嫩梢 , 接种到含蔗糖 3%的 MS培
养基上 , 5℃低温下锻炼 6周。切取 115～215 mm的茎尖 , 于 5% DMSO + 5%蔗糖 +MS基本培养基
上预培养 4 d, 在室温下用 2 mol/L甘油 + 014 mol/L蔗糖预处理 30 m in, 再于 0℃下用 PVS2 脱水处理
40 m in, 换一次新鲜的 PVS2 溶液后 , 迅速投入到液氮中。保存 24 h后 , 在 40℃水浴中化冻 , 用 3%
蔗糖 +MS基本培养基洗涤两次后接种到恢复培养基上 , 可获得 5617%的成活率和 5116%的再生率。
体细胞无性系变异在组织培养中常常存在 , 因此 , 有必要进一步从染色体倍性、细胞的超微结构
和 DNA分子标记等对超低温保存后的体细胞无性系变异进行探讨。
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图版说明 : A. 超低温保存后茎尖直接成芽 ; B. 丛生幼苗 ; C. 生根苗 ; D. 再生苗炼苗。
Explana tion of pla tes: A. Buds regenerated from cryop reserved shoot2tip s; B. Cluster seedlings; C. Rooted p lantlet; D. Regenerating p lantlets
in green2house.
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