全 文 ：园 艺 学 报 2007，34(6)：1579—1584
Acta Horticulturae Sinica
桃果实蛋白质双向电泳影响因素的研究
王一鸣 ，花宝光 ，王有年 ，孟海玲
(‘北京农学院生物技术系，北京 102206； 北京市农业应用新技术重点实验室，tL-~,102206； 北京农学院蛋白质组
学研究平台，北京 102206)
摘 要：以 ‘大久保’桃 (Prunuspe~wa L．‘Okubao’)果实为试材，通过比较不同上样量、不同上
样缓冲液、不同平衡缓冲液、不同染色方式等条件下的双向电泳图谱，探讨以上各因素对桃果实双向电泳
图谱效果的影响。结果表明考马斯亮蓝染色后的电泳图谱虽然蛋白质点的数量少于银染色后的图谱，但背
景较为清晰，适用于蛋白质组分析。采用固相 pH梯度 17 cm胶条 ，100 tg蛋白质上样量 ，样品于粉溶于
375}xL含有硫脲、磺基三甲基胺乙内脂3一l0的上样缓冲液中，等电聚焦后用含有磷酸三丁酯的平衡缓冲液
还原，进行 SDS—PAGE，银染色得出的双向电泳图有蛋白点 1 209个，纹理较少，适用于桃果实蛋白质组学
分析且兼容于下游技术的蛋白质质谱鉴定。
关键词：桃；果实；蛋白质；双向电泳
中图分类号：S 662．1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2007)06—1579-06
Studies on Influence Factors of Protein Two·dimensional Electr0ph0resis in
Prunus persica Fruit
WANG Yi．ming ，HUA Bao—guang ．WANG You—nian ．and MENG Hai—ling
(‘Department ofBiotechnology，Bering University ofAgriculture，Beqing 102206，China； Belting Key Laboratory ofNew Tech—
nology in Agriculture Application，Belting 102206，China； Platform of Proteomics，Belting University ofAgriculture，Bering
102206． 舳 )
Abstract：Peach(PⅢ凡 persica L．‘Okubao’)fruit was adopted in this experiment．Comparing differ—
ent efects of two—dimensional electrophoresis(2一DE)gels that were involved with quantitative loading of sam—
ple，sample buffer，equilibration buffer and the type of staining to explore influence factors of 2一DE patterns
on peach fruit．Although the two—dimensional gel stained by coomassie brilliant blue had gained less protein
spots than the gel stained by silver，it had a clear background intensity and was applicable to the proteomic
study．Furthermore，approximately 100 g of protein was brought to a final volume of 375 IxL sample buffer
which contained thiourea and sulf0hobetaine 3—10 and loaded on 17 am immobilized pH gradients strip．then
the strip was incubated in equilibration bufer with tributyl phosphine after isoelectric focusing．The two—di—
mensional gel stained by silver detected 1 209 protein spots and had slight streaks．The results demonstrated
that the protocol was suited to proteomic analysis of peach fruit and compatibled with protein identification by
mass spectrometry of downstream processing．
Key words：Pru凡 persica；Fruit；Protein；Two—dimensional electrophoresis
双向电泳 (two—dimensional electrophoresis，2一DE)作为蛋白质组研究的核心技术之一，是目前常
收稿日期：2007-07—25；修回日期：2007—10—20
基金项目：北京市自然科学基金重点项目 (6071001)；北京市科委区县专项资金项 目 (2006)；北京市都市农业学科群项 目
(XK100190553)；北京市属 市管高校人 才强教计划 项 目 (PXM2007-014207-044536)；北京 市属市管 高校引进 人才计划项 目
(PXM2007-014207-044538)
}通讯作者 Author for correspondence(E—mail：wyn195 1@126．COB)
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用的惟一能够连续在一块胶上分离数干种蛋白质的方法，也是目前分辨率最高的工具之一，广泛应用
于生物学研究的各个方面。影响双向电泳图谱效果的因素很多，有研究者在水稻、苜蓿和一些盐生植
物上采用不同蛋白质提取方法、不同等电聚焦 (IEF)电泳上样量、不同分离胶浓度、不同 pH范围
的固相 pH梯度 (immobilized pH gradients，IPG)胶条进行蛋白质双向电泳图的比较，结果令人较为
满意，为后续试验提供了借鉴 (Zhen et a1．，2005；李肖芳 等，2006；王玉琪和彭新湘，2006)。
果树果实中含有大量的多糖及色素、酚、醌等次生代谢产物，给果树蛋白质双向电泳研究增加了
难度。过去曾经有人报道过使用管状载体两性电解质凝胶电泳研究果实蛋白质组学的结果 (曹尚银
等，2005)，对研究果树蛋白质组有一定的推动作用，但由于方法的局限性，很难实现对蛋白质组的
研究需要。因此对应用 IPG—IEF与 SDS—PAGE系统双向电泳研究果树蛋白质组方法的需求就显得十分
迫切。作者采用 IPG—IEF为第 1向，垂直 SDS—PAGE为第2向，以发育中期的桃果实为试材，探索适
用于全细胞蛋白质组分离的双向电泳技术，为研究桃树果实发育蛋白质组乃至果树蛋白质组提供方
便。
l 材料与方法
1．1 试验材料
以 ‘大久保’桃 (Prunus persica L． ‘Okubao’)硬核期的果实为材料。样品采自北京市郊果园。
现蕾期选取树势健壮，生长较为一致，株行距为4 in×6 Il的6年生桃树 10株，常规栽培管理，于内
果皮硬核期从每株树外围长势相似的 1年生结果枝上采30个果实，放人手提冰箱带回实验室，准备
进行蛋白质的提取。
1．2 仪器
PROTEAN IEF System水平电泳系统、PROTEAN 1I XL Cel垂直电泳系统和 Mini—PROTEAN 3 E—
lectrophoresis Cel垂直电泳仪 (美国Bio—Rad公司)；PowerLook 2100XL扫描仪 (美国UMAX公司)。
1．3 试剂
pH 3～10线性 7 cm和 pH 3～10线性 17 Cln固化 IPG干胶条、磷酸三丁酯 (TBP)、两性电解质
pH 3—10购自美国 Bio—Rad公司；磺基三甲基胺乙内脂 3—10 (SB3—10)购自美国Amresco公司；碘乙
酰胺购自德国Merck公司；三氯乙酸 (TCA)等药品为国产分析纯级。
1．4 溶液配制
上样缓冲液 I：尿素5 mol·L～、硫脲2 mol·L～、40 mmol·L～Tris、20 mg·L～CHAPS、65
mmol·L～DTY、20 mg·L～SB3—10、0．2％载体两性电解质、溴酚蓝0．001％。
上样缓冲液Ⅱ：尿素 8 mol·L～、40 mmol·L～Tris、40 mg·L～CHAPS、65 mmol·L～DTY、
0．2％载体两性电解质、溴酚蓝0．001％。
胶条平衡缓冲液储液：0．375 mol·L。。Tris—HC1(pH 8．8)、尿素6 mol·L～、20％甘油、2％
SDS，一20℃保存。胶条平衡缓冲液I：使用前向10 mL平衡缓冲液储液中加200 mg DTY。胶条平衡
缓冲液Ⅱ：使用前向 10 mL平衡液储液加250 mg碘乙酰胺。胶条平衡缓冲液m：使用前向平衡缓冲
液储液中加TBP至终浓度为5 mmol·L～。
1．5 总蛋白质提取与定量
总蛋白质提取参照 Tal等 (2006)的方法。将提取出来的蛋白质干粉，以 1 mg：25 L比例加入
水化上样缓冲液，充分浸泡，37℃助溶 30 min，其间振荡 2次，21 000×g、28~(2下离心2次，各 45
min，取上清液进行双向电泳或参照 Bradford法 (Ramagli，1999)进行蛋白质定量。
1．6 等电聚焦电泳
参照Sary等 (2004)的方法设置等电聚焦程序，每根7 cln胶条限制电流30 A，17 cln胶条限
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制电流5O A。等电聚焦结束后将 IPG胶条在平衡缓冲液中平衡后进行第2向 SDS—PAGE电泳。
1．7 SDS-PAGE与染色
分离胶浓度为 12％。按如下参数进行电泳：2O℃恒温下，Mini垂直电泳 75 V 15 min，150 V
2．5 h；PROTEAN 1I XL Cel垂直电泳系统 100 V 25min，300 V 3．5 h。
考马斯亮蓝法染色时先用超纯水洗胶3次，每次5 min，再加入足量考马斯亮蓝 R-250染色液染
色 1 h，然后用脱色液脱色至背景干净为止。银染色采用 Yan等 (2000)的方法，所用溶液染色时现
配，碳酸钠溶液在未加甲醛前4℃预冷。
1．8 图像扫描与数据分析
采用 PowerLook 2100 XL扫描仪对凝胶进行图像扫描，PDQuest 2-DE 8．0．1分析软件 (美国 Bio．
Rad公司)对图像进行分析：定义蛋白质点的大小、强弱，检测和统计蛋白质点数目，计算蛋白质点
的等电点等，同时对图像进行强度校正、背景消减、ID校正、建立平均凝胶分析等。
2 结果与分析
2．1 上样缓冲液和染色方式对2-DE图谱的影响
图 1，A和图 1，B分别为含 220 g蛋白质的样品溶于上样缓冲液 I和上样缓冲液 Ⅱ中，同时采
用 7 cm胶条进行等电聚焦电泳和 SDS．PAGE，经考马斯亮蓝 R-250染色后的图谱，图 1，A背景较为
清晰，图 1，B上半部分蛋白点有拖尾现象。经 PDQuest 2一DE 8．0．1软件分析，使用 Normailization方
法，在 Local regression模式下 Floating Bal 47背景抽提，Median 3×3噪声过滤类型，点检测灵敏度
13．7849，图1，A显示共检测出符合高斯模型的有效蛋白点242个，图1，B显示共检测出297个。
图 1，C和图1，D分别为含8O g蛋白质的样品溶于上样缓冲液 I和上样缓冲液 Ⅱ，其他条件不变，
经银染色后的图谱，图1，C得出615个点，图1，D得出644个点，比图1，C多出4．72％。通过比
较发现，使用上样缓冲液 I的电泳图谱虽然点的数量少于上样缓冲液 Ⅱ的电泳图谱，但背景较清晰，
特别是应用考马斯亮蓝染色时 (图 1，A)，已排除了背景干扰，完全适用于蛋白质组分析。从图 1，
C和图 1，D来看，采用长度为7 cm的胶条不足以清晰、独立地区分蛋白质点，因此需要进一步用更
长的胶条来进行蛋白质双向电泳。
图l 不同上样缓冲液与不同染色方式的2-DE图谱比较
A，B．样品分别溶于上样缓冲液 I和上样缓冲液 Ⅱ，考马斯亮蓝 R一250染色；
C，D．样品分别溶于上样缓冲液 I和上样缓冲液 Ⅱ，银染。
Fig． 1 Comparison of 2-DE patterns witll diferent sample bufer and staining protocol
A．B．The samples were dissolved in sample bufer I(contain thiourea and SB3—10)and sample bufer I respectively
then gels were stained by coomassie briliant blue R．250：C，D．The samples were dissolved in sample bufer I
(conrain thiourea and SB3．10)and sample bufer I respectively，then gels were stained by silver．
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2．2 不同平衡缓冲液与上样量对 2-DE图谱的影响
选择上样缓冲液 I作为蛋白样品的裂解液，上样量250 txg，采用 17 cm胶条进行等电聚焦电泳，
图2，A为胶条等电聚焦结束经平衡缓冲液 I还原 15 rain，再用平衡缓冲液 Ⅱ烷基化 15 rain，SDS．
PAGE后银染色得出的结果，其纵向纹理较多，背景噪声大。图2，B为胶条等电聚焦结束经平衡缓
冲液Ⅲ平衡 15 rain，SDS—PAGE后银染色得出的结果，其纹理情况好于图 2，A，但仍有明显纵向条
纹。图2，A有效蛋白点为 1 267个，图2，B为 1 281个，二者相比较蛋白质点的数量差异变化不显
图2 不同平衡缓冲液与不同上样量的2-DE图谱比较
A．250 lag上样量，等电聚焦结束后胶条经平衡缓冲液 I、Ⅱ两步平衡 ；
B．250 Ixg上样量，等电聚焦结束后胶条经平衡缓冲液 Ⅲ一步平衡；
C．100 Ixg上样量，等电聚焦结束后胶条经平衡缓冲液Ⅲ平衡；D：图2，c的高斯图谱。
Fig．2 Comparison of 2-DE patterns witll diferent equilibration bufer and quantitative loading of sample
A．250 g protein was loaded on the strip．The strip was incubated in equilibration bufer I(contain DTT)and I
(contain iodoacetamide)after IEF．B．250 Ixg protein was loaded on the strip．The strip was only incubated
in equilibration buffer II(contain TBP)after IEF；C．100 Ixg protein was loaded on the strip．
The strip was inCUbated in equilibration bufer II(contain TBP)after IEF：D．The gaussian pattern of Fig．2，C．
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6期 王一呜等：桃果实蛋白质双向电泳影响因素的研究 1583
著。选择上样缓冲液 I作为蛋白样品的裂解液，上样量为 100 I．zg，采用 17 cm胶条进行等电聚焦电
泳，在平衡缓冲液Ⅲ中平衡 15 min，其他条件不变，银染色后，图2，c背景噪声降低了许多，纵向
条纹主要出现在 pH 4．5～6．0范围内，但对图谱的分析并没有产生过多影响。全图发现有效蛋白点
1 209个，虽然少于图2，A和图2，B，但从整体上减少了不确定点出现的可能。通过比较发现使用
平衡缓冲液Ⅲ进行胶条平衡得出的电泳图谱效果好于使用平衡缓冲液 I与平衡缓冲液 Ⅱ得出的电泳图
谱效果，而且没有损失图谱上的蛋白质点；上样量从 250 I．zg减少至 100 I．zg后，去除了部分重叠的蛋
白质点，因此点的数量并没有明显下降，电泳图谱的效果好很多。
模糊的、重叠的或条纹中的点不能被精确量化，PDQuest软件会把原始图像上这样的点过滤后按
照高斯曲线转化成三维的高斯点，再由高斯点合成理想的高斯图像，去除图谱上的干扰背景，使蛋白
点能更精准的被识别。图2，D是由图2，c转化成的高斯图，可以看出高斯图中蛋白点较为圆润、
突出，背景清晰，可满足蛋白组学双向电泳分析的需要。
3 讨论
3．1 样品制备
样品的制备是双向电泳成功与否的关键 (Blackstock&Weir，1999)。植物组织含有大量的色素 、
酚类、醌类等次生代谢物质，如果样品处理不当，这些物质将会严重干扰等电聚焦结果。本试验中采
用 TcA一丙酮沉降蛋白，所得样品干粉溶于上样缓冲液。上样缓冲液 I含有硫脲和 SB3-10，硫脲与
尿素结合会使蛋白质的溶解性更好，尤其是疏水性膜蛋白 (Pasquali，1997)，SB3-10同样也可有效
溶解蛋白。结果表明干粉溶于含有硫脲和 SB3-10裂解液后，蛋白质含量为2．27 mg·g FM，溶于不
含硫脲和SB3．10的裂解液时，蛋白质含量为 1．18 mg·g—FM，由此可见上样缓冲液中的组分对蛋白
质的溶解有很大帮助，从图谱来看，图1，A和图 1，C背景效果与蛋白点的分离效果也好于图 1，B
和图 1，D。
3．2 图谱的背景
试验结果表明在其它条件一致情况下，胶条平衡缓冲液组分不同会影响图谱的背景纹理。图2，
A中所用平衡缓冲液中含有 DTI。DTI作为还原剂，在蛋白质与 SDS充分结合的同时，它可以断裂二
硫键。平衡缓冲液Ⅱ中的碘乙酰胺可以烷基化自由的 DTr和蛋白质所带的自由巯基，而 DTr中的巯
基带有电荷，在二次平衡不完全时会在第2向SDS．PAGE中产生条纹的假象，银染后观察会更明显。
TBP不带电荷，在 SDS．PAGE过程中不迁移 (Sjelqvist el a1．，1993)，这也正是图2，B背景效果好
于图2，A的原因。
在其它条件一致的情况下，上样量的多少也会影响图谱的背景纹理。图2，B上样量为 250 I．zg，
图2，c上样量为100 I．zg，上样量过大会使蛋白点发生重叠，合适的上样量会让图的背景更为清晰，
但会丢失分子量20．1～29．0 kD部分的少量低丰度蛋白。IPG胶条的 pH范围亦会对图谱的背景产生
影响，对于试材中中性偏酸性蛋白，使用 pH 5～8或酸碱范围更窄的胶条对等电点、分子量的分离和
双向电泳图谱背景的效果应该都会更好 (王一鸣 等，2007)。
3．3 染色
本研究表明考马斯亮蓝染色后的电泳图谱可完全满足蛋白质组研究的需要。考马斯亮蓝染色法虽
然灵敏度低于银染色或荧光检测，但操作简便，蛋白点清楚、突出，染色背景及对比度好，且与下游
蛋白质质谱鉴定方法兼容，应用空间仍然很大；为满足高通量差异蛋白组分析，从成本考虑，试验初
期银染色的地位首屈一指，但银染背景深，噪声大，不易控制。
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References
Bjelqvist B，Pasqali C，Ravier F，Sanchez J C，Hochstrasser D． 1993．A nonlinear wide-range immobilized pH gradient for two-dimensional
electrophoresis and its definition in a relevant pH scale．Electrophoresis，14：1357—1365．
Blackstock W P，Weir M P． 1999． Proteomics：quantitative and physical mapping of cellular proteins
． Trends of Biotechnology，17 (3)：121
一 l27．
Cao Shang。yin，Zhang Qiu—ming，Guo Jun-ying，Chen Yu-ling．2005．Progress in proteomics technology and its application on fruit tree．Jour-
nal of Fruit Science，22(2)：138—142．(in Chinese)
曹尚银，张秋明，郭俊英，陈玉玲．2005．蛋白组学研究技术及其在果树学中的应用．果树学报，22(2)：138—142．
Li Xiao。fang，Han He。ping，Wang Xu-chu，Fan Peng—xiang，Li Yin-xin．2006． A protein extraction method suitable for two-dimensional elec-
trophoresis an alysis of halophytes．Acta Ecologica Sinica
， 26 (6)：1848—1853．(in Chinese)
李肖芳，韩和平，王旭初，范鹏祥，李银心．2006．适用于盐生植物的双向电泳样品制备方法．生态学报，26(6)：1848一
l853．
Pasquali C，Fialka I，Huber L A． 1997． Preparative two-dimensional gel electrophoresis of membrane proteins
． Electrophoresis，l8 (14)：
2573—2581．
Ramagli L S． 1999．2-D proteome analysis protocols． In：Link A J．Methods in molecular biology．Vo1．1 12．Totowa：Humana Press：99—
103．
Sarry J E，Sommerer N，Sauvage F X，Bergoin A，Rossignol M，Albagnac G．Romieu C．2004． Grape berry biochemistry revisited upon pro—
teomic analysis of the mesocarp．Proteomics，4(1)：201—215．
Tal I，Cynthia M B，Ramu S S，Yong H H，Carmen C，Montserat S，Jocelyn K C ．2006．Sample extraction techniques for enhanced pro-
teomic analysis of plant tissues． Nature Protocols，1：769—774．
Wang Yi-ming，Hu Hao，Wang You—nian，Li Yi-song，【ju Yue-ping． 2007．Effects of two immobilized pH gradients strips on protein two-di-
mensional electrophoresis of peach(Prunus persica)mesocarp．Joumal of Beijing University of Agriculture，22 (2)：13—16． (in Chi—
nese)
王一呜，胡 吴，王有年，李奕松，刘悦萍．2007．两种固相 pH梯度胶条对桃果实蛋白质双向电泳的影响．北京农学院学报，
22 (2)：l3一l6．
Wang Yu-qi，Peng Xin-xiang．2006． A two-dimensional electrophoresis protocol suitable for proteomic study of rice leaves．Joumal of Plant Physi—
ology and Molecular Biology，32(2)：252—256．(in Chinese)
王玉琪，彭新湘．2006．适用于水稻叶片蛋白质组分析的双向电泳技术．植物生理与分子生物学学报，32(2)：252—256．
Yan J X，Robin W ，Tom B，Harry R A，Westbrook J A，Wheeler C H，Dunn M J．2000． A modified silver staining protocol for visualilization
of protein compatible with matrixassited laser desorption／ionization and electrospray ionization mass spectrometry．Electrophoresis，21(17)：
3666—3672．
Zhen T L，Aaron M E，Bonnie S W ，Richard A D，Pedro J M，Lloyd W S．2005． A two-dimensional eleetrophoresis proteomic reference map
and systematic identification of 1367 proteins from a cell suspension culture of the model legume Medicago truncatula．Molecular & Cellular
Proteomics， 4： 1812 —1825．
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