全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (5) : 727 - 734
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 11 - 03; 修回日期 : 2008 - 04 - 07
基金项目 : 教育部博士点基金项目 (20040022022) ; 科技部国家转基因专项项目 (JY032B228)3 并列第一作者 ; 3 3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zqx1bjfu@yahoo1com1cn)
利用双 T2DNA载体系统获得无选择标记转基因菊
花
孙　磊 3 , 张启翔 3 3 , 周　琳 3 , 陆　苗 , 蔡　明
(北京林业大学园林学院 , 国家花卉工程技术研究中心 , 北京 100083)
摘 　要 : 为获得具有无选择标记的转基因菊花 , 构建了一个双 T2DNA超级双元载体 pCAMB IA13012
gus, 其中一个 T2DNA结构域中含有选择标记基因 hpt, 另一个 T2DNA结构域中含有目的基因 gus, 而且两
个 T2DNA结构顺序相连 , 中间没有其他插入序列。利用农杆菌介导转化菊花幼嫩茎尖薄层细胞 , 共获得
506个抗性植株 , 通过 PCR和 Southern杂交检测表明共转化率为 3814% , 对其中 17个同时整合了 hpt和 gus
基因的植株自交获得的 T1代株系进行检测 , 发现约有 1518%的 T1代植株中不含选择标记基因 hpt, 结果表
明双 T2DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记转基因植物。
关键词 : 菊花 ; 转基因 ; 双 T2DNA; 共转化 ; 无选择标记
中图分类号 : S 68211 + 1　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520727208
Genera ting M arker2free Tran sgen ic Chrysan them um by A grobac te rium M e2
d ia ted Tran sforma tion w ith Tw in T2D NA B inary Vectors
SUN Lei3 , ZHANG Q i2xiang3 3 , ZHOU L in3 , LU M iao, and CA IM ing
(N ational F low er Engineering Technology Research Cen ter, College of Landscape A rch itecture, B eijing Forestry U niversity, B eijing
100083, Ch ina)
Abstract: In this study, we constructed a super binary vector to evaluate the potential of the twin T2DNA
system for generating selectable marker2free p rogeny p lants in chrysanthemum p lants. The first T2DNA of the
vector, contains the hygromycin phosphotransferase ( hpt) selectable gene, while the second T2DNA , bears
theβ2glucuronidase gene ( gus) , featuring the gene of interest. The two T2DNA regions were located adjacent
to each other with no intervening region. 506 resistant chrysanthemum p lants were then obtained by A grobacte2
rium 2mediated transformation with this vector, analysis of transgene inheritance was facilitated by PCR amp lifi2
cation and Southern blot from leaf tissue, the p rimary co2transformation frequency was 3814%. A total of sev2
enteen hpt2resistant/ gus2active T0 p lants were evaluated for segregation in the next generation, and among
these, app roximately 1518% had transgene inserts which segregated in the T1 p rogeny to yield chrysanthemum
p lants without selectable marker gene. Overall, the twin T2DNA system s appeared to be a useful app roach to
generate marker free transgenic p lants, thereby elim inating public concerns regarding p roliferation of antibiotic
and herbicide resistance genes in the environment.
Key words: chrysanthemum; transgenic; twin T2DNA; co2transformation; marker2free
利用基因工程技术将一些外源基因导入观赏植物中 , 可以使一些观赏性状得到改良。通过转基因
方法已经培育出了一些品质优良的菊花品种 , 但是转基因植物的安全性问题逐渐受到人们关注 , 因为
在遗传转化过程中普遍使用的标记基因会对环境和人类健康产生一定的威胁 (Dale, 1992; Cleave et
al. , 1999) , 还影响转基因产品的商品化进程 (贾士荣 , 1997) ; 因此 , 培育无选择标记基因的安全
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转基因植物成为植物基因工程发展的一大趋势。
共转化法利用目的基因和标记基因的共同整合 , 以及后代中目的基因和标记基因的分离来获得无
选择标记的转基因植物 , 是一种简单而有效的手段。
本研究构建了一个双 T2DNA超级双元载体 pCAMB IA13002gus, 其中一个 T2DNA结构域中含有选
择标记基因 hpt, 另一个 T2DNA结构域中含有目的基因 gus, 而且两个 T2DNA结构顺序相连 , 中间没
有其他插入序列。
作者利用农杆菌介导法转化地被菊品种 ‘七月桃花 ’, 受体材料为幼嫩茎尖薄层细胞 , 通过后代
的筛选获得了不含标记基因而只含 gus基因的转基因菊花。
1　材料与方法
111　材料
以北京林业大学胖龙温室的地被菊品种 ‘七月桃花 ’为试材 , 选取 20～25 d苗龄的无菌苗中上
部充分展开的幼嫩叶片为外植体。
质粒 pCAMB IA1300和 pCAMB IA1301植物表达载体由澳大利亚 CAMB IA组织惠赠。根癌农杆菌
EHA105由本实验室保存。试验所用的 DNA限制性内切酶 , 聚合酶 , 连接酶及 DNA分子质量标记均
购自 Takara公司 ; Southern杂交试剂盒购自 Roche公司 ; 乙酰丁香酮 (AS) 购自 Fluka公司 ; 抗生素
等主要生化试剂购自上海生物工程有限公司 ; 引物由北京奥科生物技术公司合成 , 其它试剂为国产分
析纯。
培养条件 : 温度为 24 ℃, 光强 2 000～2 400 lx, 光照时间为 16 h·d - 1。
分化培养基为 : MS + 62BA 2 mg·L - 1 +NAA 015 mg·L - 1。
共培养基为 : MS + NAA 015 mg·L - 1。
筛选培养基为 : MS + 62BA 2 mg·L - 1 +NAA 015 mg·L - 1 + Cef 250 mg·L - 1 + hyg 10 mg·L - 1。
生根培养基为 : 1 /2MS + Cef 250 mg·L - 1 + hyg 10 mg·L - 1。
不同培养基均附加蔗糖 310% , 琼脂 0155%。
112　双 T2D NA表达载体的构建
采用 Sambrook和 Russell (2001) 所述的 DNA操作方法构建双 T2DNA表达载体 pCAMB IA 13002
gus。载体构建策略如图 1所示 , 其中 pCAMB IA 1301的 T2DNA区域含有 hpt基因和 gus基因 , pCAM2
B IA 1300的 T2DNA区域只含有 hpt基因 , 用限制性内切酶 X hoⅠ和 H indⅢ双酶切 pCAMB IA 1301,
Klenow酶补平后自连 , 得到去除 hpt基因和多克隆位点的质粒 pCAMB IA 13012hpt2, 然后用 SacⅡ和
S phⅠ双酶切 , 切下的 T2DNA片段用 Klenow酶补平后插入 pCAMB IA 1300的 S acⅡ位点 , 得到 pCAM2
B IA 13002gus。用 N heⅠ酶切鉴别插入方向的正确性。
113　植物遗传转化
将构建好的植物表达载体 pCAMB IA 13002gus用液氮冻融法导入农杆菌 EHA105中 , 接种于含有
Km 50 mg·L - 1的液体 LB培养基中 , 28 ℃振荡培养过夜 , 然后取其中 1～2 mL接种于 50 mL LB液体
培养基中进行二次过夜活化。当 OD值达到 016时 , 4 000 ×g离心 5 m in, 收集菌体 , 并悬浮于等体
积的液体 MS培养基中 , 添加 100μmol·L - 1的乙酰丁香酮 , 28 ℃振荡培养 2 h后用于浸染。
将遗传转化的受体材料地被菊品种 ‘七月桃花 ’的幼嫩茎尖 , 沿横向切成 1～2 mm厚的薄层 ,
置于 25 ℃, 2 400 lx, 16 h·d - 1光照的条件下预培养 2 d, 然后用制备好的菌液浸染 10 m in, 用无菌
滤纸吸去多余的菌液 , 接种于共培养基中 , 黑暗条件下 25 ℃共培养 3 d后 , 转入抑菌培养基中培养 7
d, 抑制农杆菌的过度生长 , 接着转入分化筛选培养基上诱导抗性芽 , 每隔 30 d更换 1次培养基 , 当
抗性芽生长至 2～3 cm时转移至生根筛选培养基中。
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对获得的 T0代抗性植株 , 取其幼嫩叶片进行 gus组织化学检测 , 随机挑选具有 hpt抗性和 gus活
性的植株进行自交 , 获得的后代为 T1代。随机挑选 T1代植株的幼嫩叶片进行 hpt抗性检测和 gus组织
化学检测 , 进一步分子检测 hpt基因和 gus基因在 T1代的分离情况 , 统计 T1代各种表型的数量和获得
的无选择标记植株。
图 1　双 T2D NA载体构建策略
F ig. 1　D iagram of the con struction of tw in T2D NA vector
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114　转基因植株的分子检测
以改进的 CTAB法 (Doyle & Doyle, 1987) 提取转化植株幼嫩叶片的总 DNA , PCR反应的总体
积为 50μL, 扩增 gus基因的反应条件是 94 ℃预变性 4 m in, 然后 94 ℃ 40 s, 52 ℃ 40 s, 72 ℃
1 m in, 30个循环 , 最后 72 ℃ 10 m in, 预期 PCR产物片段为 917 bp; 扩增 hpt基因的反应条件是
94 ℃预变性 4 m in, 然后 94 ℃ 40 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 50 s, 30个循环 , 最后 72 ℃10 m in, 预期 PCR
产物片段为 584 bp。反应产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增引物 hpt1: 5′2GATGTTGGCGACCTCG2
TATT23′, hpt2: 5′2TCGTTATGTTTATCGGCACTTT23′, gus1: 5′2AACTGAACTGGCAGACTATCC23′, gus2:
5′2TGAGCGTCGCAGAACATTA23′。
Southern分析时 , 取 30μg植物基因组 DNA, 用适当的限制性内切酶消化 ( EcoRⅠ或 H indⅢ) ,
018%琼脂糖凝胶电泳进行分离 , 变性中和后转移到带正电荷的尼龙膜上 ( Hybond2N + , Amersham
Pharmacia B iotech)。将标记过的 PCR产物做为探针在 42 ℃预杂交 2 h后 , 进行杂交过夜 , 2 ×SSC +
011% ×SDS室温下洗膜两次 , 每次 10 m in, 然后再在 015 ×SSC + 011% ×SDS中 65 ℃洗两次 , 每次
15 m in, 以 CDP2STAR为发光底物进行显色反应 , FUJ I X -光胶片曝光后检测杂交信号。每次试验至
少重复 2次。
2　结果与分析
211　双 T2D NA表达载体 pCAM B IA 13002gus的酶切鉴定
对重组质粒 pCAMB IA 13002gus进行 N heⅠ酶切 , 获得约 913 kb和 3 kb两个片段 (图 2) , 说明从
质粒 pCAMB IA 13012hpt2切下的 T2DNA按照从右边界至左边界的顺序插入到 pCAMB IA 1300的 SacⅡ
位点 , 含 gus和 hyg基因的双 T2DNA植物表达载体的构建与预期设计的结果一致。
图 2　双 T2D NA表达载体 pCAM B IA 13002gus的酶切鉴定
M: DNA分子质量标记 DL 15000; 1: pCAMB IA 13002gus经 N heⅠ单酶切 ;
2: 质粒 pCAMB IA 13002gus。
F ig. 2　D igesting iden tif ica tion of the pla sm id pCAM B IA 13002gus
M: DNA molecular marker DL 15000; 1: pCAMB IA 13002gus digested with N heⅠ;
2: p lasm id pCAMB IA 13002gus.
212　含 hp t基因和 gus基因的共转化菊花的获得
　　一共使用了 958个薄层切片受体材料 , 经过遗传转化 , 不定芽再生获得抗性植株 , 部分抗性植株
通过 gus检测呈阳性 (图 3)。
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图 3　转基因植株的再生
A. 抗性芽 ; B. 抗性芽生根 ; C. 转基因植株 ; D. gus基因组织化学检测。
F ig. 3　Regenera tion of tran sgen ic plan ts
A. Resistant shoot; B. Rooting of the resistant shoot; C. Transgenic p lant;
D. H istological analysis of exp ression of the gus gene.
首先对抗性芽进行计数和分析 , 结果表明在 3个重复中 , 获得的平均转化率为 5218% , 一共获
得 506个抗性植株。对具有潮霉素抗性的植株进一步用 PCR检测 hpt基因和 gus基因的共转化情况 ,
在随机挑选的 10个抗性植株中都能特异性地扩增出 hpt片段 , 与质粒阳性对照相同 , 但是对 gus基因
的扩增结果表明 , 只在部分株系中检测到 gus基因的存在 (图 4)。平均共转化率为 3814%。
图 4　T0代 hpt基因和 gus基因共转化的 PCR分析转基因植株的再生
M: 分子质量标记 DL 2000 ( Takara) ; 1: 质粒 pCAMB IA 13002gus作为阳性对照 ; 2: 非转化植株作为
阴性对照 ; 其中 B212, L25, L28, Y223为共转化株系 , 分别对 hpt和 gus基因
扩增后 , 同一植株的扩增产物混合后 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
F ig. 4　Ana lysis of T0 tran sforman ts for hpt and gus gene
M: Molecular marker DL 2000 ( Takara) ; 1: Plasm id pCAMB IA 13002gus as positive control; 2: Non2transgenic p lants
as negative control; L ine B212, L25, L28, Y223 were co2transformants, the amp lification for hpt and gus genes were
carried out respectively and then the p roducts of the same p lants were m ixed and analyzed
by electrophoresis in a 1% agarose gel.
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随机挑取 7个发生共转化的植株以基因组 DNA为模板 , 先用 EcoRⅠ酶切 , 以 hpt基因为探针进
行 Southern杂交 (图 5, A)。
然后以同样的模板用 H indⅢ酶切 , 以 gus基因为探针进行 Southern杂交 (图 5, B)。
在 PCR检测获得的共转化植株中均有 hpt和 gus基因特异信号的出现 , 而在未转化的植株中没有
发现杂交信号 , 说明 hpt和 gus基因确实整合到植物基因中。
另外 , 从图 5中还可以看出两个基因的整合位点和插入基因组的拷贝数各不相同。
图 5　T0代共转化植株的 Southern杂交分析
A. DNA用 EcoRⅠ酶切 , 以 hpt基因为探针进行杂交 ; B. DNA用 H indⅢ酶切 ,
以 gus基因为探针进行杂交。1为未转化植株 , 其他为共转化植株 ,
其中株系 B21, L28, Y220为单拷贝插入 , 其他株系两个基因
的整合位点不同 , 拷贝数呈现各种比例。
F ig. 5　Southern hybr id iza tion of genom ic D NA from T0 co2tran sforman ts
A. Genom ic DNA were digested with EcoRⅠ and p robed with hpt gene; B. Genom ic DNA
were digested with H indⅢ and p robed with gus gene. 1, non2transgenic
p lants, others were co2transformants, B21, L28, Y220
with single copy, others with multip le cop ies.
213　无选择标记转基因植株的获得
将同时含有 hpt基因和 gus基因的共转化植株转移至温室栽培 , 随机挑选其中 17个 T0代植株进
行自交产生 T1代后对 T1代植株的基因组 DNA进行 PCR检测。
结果表明 , L220株系没有获得 hpt - / gus +的后代 , 可能是 gus基因和 hpt基因连锁在同一染色体
上没有发生分离所致 ; 其余株系都能获得无选择标记的转基因植株 , 其中 L25株系无标记基因的植株
出现频率平均值为 15178% , 最高值为 36173% (表 1)。
这比 Xing等 (2000) 报道的烟草 (78% ～100% ) 和水稻 ( 80% ) 的低 , 但比大豆的高。这样
获得无选择标记转基因菊花后 , 还可以用同样的系统二次导入其他基因。
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表 1　T0代植株转化效率和共转化率统计
Table 1　Tran sforma tion and co2tran sforma tion frequenc ies of T0 plan ts
转化株系
T0 p lant
T1代株数
Number of T1 p lant
hpt + /gus + hpt + /gus - hpt - /gus + hpt - /gus -
无标记基因株出现频率 /%
Frequency of marker free
transgenic p lant
B21 145 106 5 14 20 9167
B25 146 107 0 28 11 19118
B212 150 140 8 1 1 0167
B226 152 133 13 3 3 1197
L23 151 99 2 50 0 33111
L25 147 83 4 54 6 36173
L28 148 83 28 20 17 13151
L29 145 122 0 23 0 15186
L210 145 102 9 34 0 23145
L217 143 114 11 16 2 11119
L219 150 137 2 11 0 7133
L220 153 73 0 0 80 0
L227 150 124 0 13 13 8167
Y22 148 85 5 51 7 34146
Y23 147 138 0 9 0 6112
Y220 152 38 52 33 29 21171
Y223 150 44 48 37 21 24167
合计 Total 2 522 1 728 187 397 210
平均 Average 15178
　　注 : 潮霉素抗性记为 + , 潮霉素敏感记为 - , gus活性记为 + , gus非活性记为 - 。
Note: Hygromycin resistant is scored as + , hygromycin sensitive is scored as - , gus active is scored as + , gus inactive is scored as - 1
3　讨论
目前有很多方法获得无选择标记转基因植物 , 每种方法都有各自的优缺点。Komari等 ( 1996)
用双 T2DNA研究共转化时 , 构建了分别含有抗生素基因和 gus基因的超级双元载体用于水稻转化 ,
共转化率达到了 47% , 经过后代的有性杂交筛选 , 选择标记基因与目的基因约有一半能独立分离。
McKnight等 (1987) 用 T2DNA载体共转化烟草 , 一个 T2DNA结构含有基因 nptⅡ, 另一个 T2DNA含
有胭脂碱合成酶 ( nopaline synthase, nos) 基因。在获得的 11株 nptⅡ阳性转基因植株中 , 有 3株整合
有 nos基因 , nptⅡ和 nos在这 3株转基因烟草后代中发生了分离。Daley等 (1998) 应用双质粒法构
建了两个双元载体 pCGN2789和 pCGN2790, 将其共同转入同一个农杆菌菌株后用此菌株转化烟草细
胞 , 得到的 T0代转化植株共转化率接近 50% , 后代产生去除标记基因的植株占共转化的 50% , 表明
基因转入植物基因组后插入了不同的位点。
早期的研究者认为 , 双 T2DNA共转化植物细胞共转化频率和分离比率的不同 , 是由转化用菌株、
转化植株、所用的质粒、转化方法等因素不同造成的。de Neve等 (1997) 认为共转化体系中目的基
因与选择标记基因的存在形式与转化过程中所用的转化方法和外植体的选择无关 , 而主要与细菌菌株
的浓度和生理状态、载体的特点、受体植株的生理状态和对转化的敏感程度等有关。因此 , 目的基因
与选择标记基因以连锁的形式存在严重影响了剔除选择标记基因的几率 , 阻碍了无选择标记基因的转
化植株的获得。
本研究利用双 T2DNA 载体系统获得了 3814%的共转化率 , 并且通过自交选择获得的后代有
1517%是不含选择标记的 , 独立共转化率低于前人的研究 , 其原因可能是由于目的基因与抗性选择标
记基因整合的位点比较近或整合于同一个位点 , 而较难获得无抗性选择标记基因的转基因植株 (Dep
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icker et al. , 1985; de B lock et al. , 1989; de Buck et al. , 1999; Afolabi et al. , 2004; B reitler et al. ,
2004)。
双 T2DNA载体系统去除选择标记基因简单易行 , 只要有含目的基因和选择标记基因的载体即可
用于转化获得无标记基因的转化植株。但是 , 如果目的基因和选择标记基因没有可以容易识别的性状
和简便的检测方法 , 获得去除选择标记基因的转基因植株非常繁琐耗时。本研究利用 PCR的方法筛
选去除标记基因的转化植株 , 每一代转基因植株均需进行大量的 DNA提取和 PCR检测工作 , 不仅延
长了获得无选择标记纯合转基因植株的周期 , 而且限制了检测的群体范围。因此需要大力发展目的基
因和选择标记基因的简便检测方法。
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