全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (3) : 507～510
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 05 - 20; 修回日期 : 2005 - 07 - 01
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30200187)3 通讯作者 Author for correspondence
应用多重 RT - PCR检测草莓斑驳病毒和草莓轻型
黄边病毒
张志宏　杨洪一 3 　代红艳　李　贺　肖　敏
(沈阳农业大学园艺学院 , 辽宁沈阳 110161)
摘 　要 : 建立了多重 RT - PCR同时检测草莓斑驳病毒 ( SMoV) 和草莓轻型黄边病毒 ( SMYEV ) 的技
术体系 , 对草莓田间植株和试管苗都可以有效进行检测。多重 PCR引物根据引物之间的互补性及引物的
Tm值进行筛选。适宜的 PCR缓冲液的浓度为 2 ×, 退火温度为 57℃, 延伸温度为 66℃。分别利用单一
PCR和多重 PCR对微茎尖培养获得的草莓品种宝交早生的 11个株系进行了脱毒效果鉴定。
关键词 : 多重 RT - PCR; 病毒检测 ; 草莓
中图分类号 : S 66814; S 43211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0320507204
D etection of Strawberry m ottle v irus and S traw berry m ild ye llow edge virus by
M ultiplex RT 2PCR
Zhang Zhihong, Yang Hongyi3 , Dai Hongyan, L i He, and Xiao M in
(College of Horticulture, Shenyang A gricultural U niversity, Shenyang, L iaoning 110161, China)
Abstract: A multip lex reverse transcrip tase polymerase chain reaction (RT - PCR) assay was developed
for simultaneously detecting Strawberry mottle virus ( SMoV ) and S traw berry m ild yellow edge virus ( SMY2
EV). Both field2grown strawberries and m icrop lants were detected effectively. The p rimers of multip lex PCR
were selected by p rimer2p rimer interactions and melting temperature. In multip lex PCR for detecting SMoV
and SMYEV, the app rop riate concentration of PCR buffer was 2 ×, and the app rop riate temperatures for an2
neal and extension were 57℃ and 66℃ respectively. Eleven lines of strawberry ( F ragaria ×ananassa) culti2
var‘Hokowase’, which were obtained by m ini shoot tip culture in vitro, were screened for virus elim ination
by standard RT - PCR and multip lex RT - PCR.
Key words: Multip lex RT - PCR; V irus detection; Strawberry
病毒对无性繁殖的多年生草本植物草莓 ( Fragaria ×ananassa) 危害严重 , 导致植株矮化 , 匍匐茎
减少 , 果实品质变劣 , 减产 30% ～80%。侵染草莓的 20多种病毒中草莓斑驳病毒 ( Strawberry mottle
virus, SMoV) 和草莓轻型黄边病毒 (S traw berry m ild yellow edge virus, SMYEV) 分布较广 , 危害较重。
解决病毒危害草莓生产的关键是大面积推广应用无病毒苗 , 实行无病毒化生产。病毒检测手段是
病毒研究的一个重要环节。多重 PCR (Multip lex polymerase chain reaction) 是在 1次 PCR反应中加入
多于 1对的引物 , 特异性地扩增多个基因位点的反应。与常规的单一 PCR相比 , 多重 PCR可以同时
检测多种病毒或区分病毒的不同株系 , 极大地提高检测效率 , 降低检测成本。由于草莓病毒多为混合
侵染 , 综合表现症状 , 利用单一 PCR对多种病毒进行系统检测的工作量较大 , 因而多重 PCR在草莓
病毒检测中的优越性更为明显。
本研究在利用单一 RT - PCR检测 SMoV和 SMYEV的基础上〔1, 2〕, 通过调节和优化影响多重 RT
- PCR的因子 , 旨在探索建立利用多重 RT - PCR技术同时检测 SMoV和 SMYEV的技术体系。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
1　材料与方法
111　植物材料、试剂和引物
春香 (Harunoka)、高斯克 ( Governor Simcoe)、布兰登堡 (B randenburg) 等草莓品种生长于露
地。通过单一 RT - PCR检测证明带有 SMoV和 SMYEV的草莓品种宝交早生 (Hokowase) 生长于温
室。通过 015 mm微茎尖培养获得的宝交早生的 11个株系离体保存于 100 mL三角瓶中。
反转录酶 M 2MLV为 Invitrogen公司产品 , Taq DNA 聚合酶 ( TaKaR a LA TaqTM )、dNTPs、RNA酶
抑制剂、DNA Marker购于 TaKaRa公司 , 其它药品为国产分析纯。
根据 GenBank中 SMoV (登录号 AJ311875, AJ311876) 和 SMYEV (登录号 D12517) 的基因组序
列和文献 〔1～4〕分别设计和合成针对 SMoV、 SMYEV 和 ndh B 基因 (mRNA 专化内标 ) 的引物
(表 1)。
表 1　扩增 SM oV、SMY EV及内标片段的引物对
Table 1　The pr im er pa irs for am plify ing segm en ts of SM oV, SMY EV and in terna l con trol
引物对
Primer pairs
序列
Sequence (5pi→3pi) 目的片段来源Source of target fragment 大小Size ( bp)
D1 /D2
　
TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG(正义引物 Sense p rimer)
ATTCGGTTCACGTCCTAGTCTCAC (反义引物 Antisense p rimer)
SMoV
　
461
　
D1 /D3
　
TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG(正义引物 Sense p rimer)
TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG(反义引物 Antisense p rimer)
SMoV
　
219
　
C1 /C2
　
GGACCTACGGATCTTGGAAGT(正义引物 Sense p rimer)
ACCCGCACAACTTGTCGGAGG(反义引物 Antisense p rimer)
SMoV
　
461
　
Y1 /Y2
　
GTGTGCTCAATCCAGCCAG(正义引物 Sense p rimer)
CATGGCACTCATTGGAGCTGGG(反义引物 Antisense p rimer)
SMYEV
　
271
　
YT1 /YT2
　
CCGCTGCAGTTGTAGGGTA (正义引物 Sense p rimer)
TTTTTTTTTTTTTTTAAGGAAAAAGAAAAACAAAC (反义引物 Antisense p rimer)
SMYEV
　
932
　
YT1 /Y2
　
CCGCTGCAGTTGTAGGGTA (正义引物 Sense p rimer)
CATGGCACTCATTGGAGCTGGG(反义引物 Antisense p rimer)
SMYEV
　
861
　
N1 /N2
　
GGACTCCTGACGTATACGAAGGATC (正义引物 Sense p rimer)
AAACAACGCTTGTAAGGAGTCC (反义引物 Antisense p rimer)
ndh B
　
571
　
112　RNA的提取和 RT - PCR
从待检测草莓植株上取幼嫩的叶片 , 采用 CTAB法提取总 RNA〔1〕。反转录反应体积为 20μL, 其
中包括模板 1μL, 反转录酶 M 2MLV 60 U, 随机 9引物 (50μmol·L - 1 ) 和 OL IGO dT引物 (50μmol
·L - 1 ) 各 015μL, 其它成分与操作步骤参考 Invitrogen反转录酶说明书 , 37℃反转录 215 h。取 1μL
进行 PCR反应 , 反应体积 20μL, 含 115 mmol·L - 1 MgCl2 , 012 mmol·L - 1 dNTPs, Taq酶 1 U。对于
单一 PCR反应 , 缓冲液浓度为 1 ×, 引物为 012μmol·L - 1 ; 对于多重 PCR反应 , 缓冲液浓度为 2 ×,
引物对 D1 /D3、Y1 /Y2、N1 /N2的浓度依次为 0127、0120和 0102μmol·L - 1。单一 PCR反应程序分
别为 : (1) 引物对 D1 /D3, 94℃ 2 m in, 94℃ 30 s, 55℃ 40 s, 72℃ 60 s, 35个循环 , 最后 72℃延伸
5 m in; (2) 引物对 N1 /N2的反应程序与 D1 /D3的相同 ; (3) 引物对 Y1 /Y2的退火温度为 56℃, 其
它与 D1 /D3的相同。多重 PCR的反应程序为 : 94℃ 2 m in; 94℃ 30 s, 57℃ 40 s, 66℃ 2 m in, 35个
循环 ; 最后 72℃延伸 5 m in。用含 EB的 116%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2　结果与分析
211　多重 PCR引物的筛选
采用单一 RT - PCR技术 , 引物对 D1 /D2、D1 /D3和 C1 /C2分别从感染 SMoV的草莓植株中稳定
805
　3期 张志宏等 : 应用多重 RT - PCR检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒 　
地扩增出 SMoV的特异片段〔1〕; 引物对 Y1 /Y2和 YT1 /YT2分别从感染 SMYEV的草莓植株中稳定地
扩增出 SMYEV的特异片段〔2〕; 引物对 N1 /N2从草莓病毒指示植物和草莓品种的反转录产物中扩增出
了 571 bp的 ndh B基因特异片段 , 而未加反转录酶则没有任何扩增产物 , 说明 ndh B基因存在于草莓
中 , 跨越内含子的引物设计是有效的 , ndh B基因适合作为草莓 RNA病毒检测的内标〔1〕。
引物对 D1 /D2的退火温度为 50℃, 远低于其它引物对的退火温度 , 因而不宜作为多重 PCR反应
的引物。利用软件 OM IGA 210对其它引物进行引物互补性测试 , 发现引物 C12Y1、C12YT1、C12N1、
C12N2、C22YT1、C22YT2、C22Y1间存在着较大的互补性 , 因此这些引物不适合互相组合来作为多重
PCR反应的引物。此外 , 利用软件 DNAMAN计算引物 Tm值的结果表明 , D1、D3、Y1、Y2、N1、
N2的 Tm值较一致。基于此 , 本研究选择引物对 D1 /D3、Y1 /Y2和 N1 /N2作为多重 PCR检测 SMoV
和 SMYEV的引物。在相同的 PCR反应体系和反应程序 (94℃ 2 m in; 94℃ 30 s, 54℃ 40 s, 72℃ 2
m in, 35个循环 ; 72℃延伸 5 m in) 下 , 这些引物单独扩增时都可以得到较好的扩增效果 (图 1)。
212　引物浓度、退火温度和 PCR缓冲液浓度对
多重 PCR反应的影响
以被 SMoV和 SMYEV混合侵染的草莓品种宝
交早生为试材 , 进行基于内标的多重 PCR 检测
SMoV和 SMYEV 的体系建立和优化研究。按照
012μmol·L - 1的终浓度等量加入引物 D1 /D3、
Y1 /Y2和 N1 /N2, 采用 50℃的退火温度 , 结果显
示内标片段过强 , SMoV 片段较弱 , 而且未能扩
增出 SMYEV 片段。增加 SMYEV 引物的浓度
(012～016 μmol·L - 1 )、降低内标引物的浓度
(0105～0115μmol·L - 1 ) 未能有效解决该问题 ;
当 SMYEV引物浓度提高至 018μmol·L - 1时 , 虽
能扩增出 SMYEV片段 , 但是有大量弥散的碎片 ,
而且 SMoV片段和内标片段消失。
图 1　单一 PCR中不同引物对的扩增
M: DNA Marker DL2000; 1: 利用引物对 D1 /D3扩增 SMoV;
2: 利用引物对 Y1 /Y2扩增 SMYEV; 3: 利用引物
对 N1 /N2扩增内标。
F ig. 1　The am plif ica tion w ith d ifferen t pr im er pa irs in
standard PCR
M: DNA marker DL2000; 1: Amp lification of SMoV with p rimer
pair D1 /D3; 2: Amp lification of SMYEV with p rimer pair Y1 /Y2;
3: Amp lification of internal control with p rimer pair N1 /N2.
　　当引物浓度为 012μmol·L - 1时 , 对退火温度和延伸温度进行调节。降低退火温度至 46℃, 扩增
效果未见提高 ; 而提高退火温度至 57℃, 可以扩增出 SMYEV的特异片段。在多重 PCR反应中 , 延
伸温度也是重要的因素 , 高的延伸温度 (72℃) 可能更利于单一片段的扩增。因此 , 在退火温度为
57℃的条件下 , 对不同的延伸温度 (65～72℃) 进行试验 , 结果表明延伸温度为 66℃时扩增效果最
佳 , 且扩增结果较稳定 , 但是短片段扩增效果仍相对较差。
PCR缓冲液浓度可以调节大小片段扩增产物间的强弱。由于高盐浓度会影响长片段扩增产物的
变性解链〔5〕, 通常长片段扩增产物在低盐浓度下扩增效果较好 , 而短片段扩增产物在高盐浓度下扩
增结果较好。在退火温度为 57℃、延伸温度为 66℃的情况下 , 对 PCR缓冲液浓度 (015～315 ×) 对
扩增效果的影响进行比较 , 结果显示 2 ×PCR缓冲液最优。
进一步对引物浓度进行优化 , 得到检测 SMoV和 SMYEV的多重 PCR体系的最终优化结果为 : 加
入 2 ×PCR 缓冲液 , 引物 D1 /D3、Y1 /Y2和 N1 /N2的浓度依次为 0127、0120和 0102μmol·L - 1。
PCR反应程序为 94℃ 2 m in; 94℃ 30 s, 57℃ 40 s, 66℃ 2 m in, 35个循环 ; 最后 72℃延伸 5 m in。
213　利用多重 RT - PCR检测草莓样品
利用多重 RT - PCR对沈阳农业大学草莓试验园露地保存的春香、高斯克、布兰登堡进行病毒检
测 , 结果表明均感染有 SMYEV而没有感染 SMoV。
对被 SMYEV和 SMoV混合侵染的宝交早生进行微茎尖 (015 mm ) 培养脱毒处理 , 然后对获得的
11个株系分别利用单一 RT - PCR和多重 RT - PCR进行脱毒效果鉴定。结果显示 , 单一 RT - PCR和
905
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
多重 RT - PCR 进行脱毒效果检测的结果一致
(图 2) , 有 6个株系脱除了 SMoV和 SMYEV , 有
3个株系仅脱除了 SMoV, 另两个株系没有脱毒。
3　讨论
单一 PCR中效果极佳的引物作为多重 PCR的
引物时 , 很可能因为引物间相互作用而未能建立多
重 PCR体系〔6〕。Bariana等〔7〕在检测豆类病毒中 ,
加入内标引物后则多重 PCR扩增出较多非特异片
段 , 且未能通过优化反应体系来解决。因此 , 慎重
选择引物可以使反应更容易优化 , 特别在扩增多个
片段时。合理选择引物后 , 对单个或多个目的片段
不能良好地扩增是多重 PCR中最主要的问题〔5, 8〕。
总体来讲 , 提高 PCR缓冲液浓度、调节退火温度
可能增加短扩增产物的量 , 而增加延伸时间、降低
PCR缓冲液浓度可能增加长扩增产物的量。在本研
究中 , 单独增加某对引物的量对反应的影响较复
杂 , 该引物对应的扩增产物未必增加 , 且易引起其
它扩增片段的缺失或弥散 , 即使扩增产物增加了 ,
其重复性也不好。只有当其它因子较适合时 , 再调
节引物的量才有较好的效果。
图 2　利用单一 PCR和多重 PCR检测草莓微茎尖组培苗
M: DNA marker DL2000; 1～11: 通过微茎尖培养获得
的草莓品种宝交早生的 11个株系。
a: 利用单一 PCR检测 SMoV; b: 利用单一 PCR检测 SMYEV;
c: 利用多重 PCR检测 SMoV和 SMYEV。
F ig. 2　Strawberry m icroplan ts ar isen from m in i shoot tip
culture were screened for v irus elim ina tion by standard
RT - PCR and m ultiplex RT - PCR
M: DNA marker DL2000; 1 - 11: Eleven lines obtained by m ini
shoot tip culture of strawberry cultivar‘Hokowase’; a: The
detection of SMoV by standard RT - PCR; b: The detection
of SMYEV by standard RT - PCR; c: The detection of
SMoV and SMYEV by multip lex RT - PCR.
　　多重 PCR比单一 PCR中的退火温度低 4～6℃一般有更好的扩增效果 , 短扩增条带弱或缺失多采
用降低退火温度来解决〔5〕, 而本研究中提高退火温度反而增加了弱带的亮度 , 这可能在于高的退火
温度抑制了长内标片段的扩增 , 从而利于短片段的扩增。
参考文献 :
1　杨洪一 ,张志宏 ,杜国栋 ,代红艳 ,高秀岩. 利用内标为基础的 RT2PCR技术检测草莓斑驳病毒. 植物病理学报 , 2005, 35 (2) : 116～122
Yang H Y, Zhang Z H, Du G D, Dai H Y, Gao X Y. RT2PCR detection Strawberry mottle virus based internal control. Acta Phytopathologica
Sinica, 2005, 35 (2) : 116～122 ( in Chinese)
2　杨洪一 , 张志宏 , 高秀岩 , 杜国栋 , 代红艳 , 李　贺. 草莓轻型黄边病毒的 RT2PCR检测及其 3pi端序列分析. 园艺学报 , 2005, 32
(3) : 403～407
Yang H Y, Zhang Z H, Gao X Y, Du G D, Dai H Y, L i H. Detection of S trawberry m ild yellow edge virus with RT2PCR and analysis of the
sequences of 3piterm inal region. Acta Horticulturae Sinica, 2005, 32 (3) : 403～407 ( in Chinese)
3　Thomp son J R, W etzel S, Klerks M M, VaÍkováD, Schoen C D, Λpak J, Jelkmann W. Multip lex RT2PCR detection of four aphid2borne
strawberry viruses in F ragaria spp. in combination with a p lant mRNA specific internal control. Journal of V irological Methods, 2003, 111
(2) : 85～93
4　Thomp son J R, Jelkmann W. Strain diversity and conserved genome elements in S trawberry m ild yellow edge virus. A rchives ofV irology, 2004,
149 (10) : 1897～1909
5　Henegariu O, Heerema N A, D louhy S R, Vance G H, Vogt P H. Multip lex PCR: critical parameters and step2by2step p rotocol. B ioTech2
niques, 1997, 23 (3) : 504～511
6　迪芬巴赫 , 德维克斯勒. PCR技术实验指南. 北京 : 科学出版社 , 1998. 88～119
D ieffenbach C W , Dveksler G S. PCR p rimer: a laboratory manual. Beijing: Science Press, 1998. 88～119 ( in Chinese)
7　Bariana H S, Shannon A L, Chu P W G. Detection of five legume viruses in one sensitive multip lex polymerase chain reaction test. Phytopa2
thology, 1994, 84 (10) : 1201～1205
8　黄银花 , 胡晓湘 , 徐慰倬 , 高　宇 , 冯继东 , 孙　汉 , 李　宁. 影响多重 PCR扩增效果的因素. 遗传 , 2003, 25 (1) : 65～68
Huang Y H, Hu X X, Xu W Z, Gao Y, Feng J D, Sun H, L i N. The factors affecting the efficiency of multip lex PCR. Hereditas, 2003, 25
(1) : 65～68 ( in Chinese)
015