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Cryopreservation of in Vitro Shoot Tips of Banana by Vitrification and Its Regeneration

香蕉茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生



全 文 :园  艺  学  报  2006, 33 (3) : 501~506
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 11; 修回日期 : 2005 - 10 - 02
基金项目 : 广东省自然科学基金资助项目 (05103391)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yiganjun@ vip11631com)
第一作者现工作单位 : 湖北省农业科学院果树茶叶研究所
香蕉茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生
吴黎明 1, 2  曾继吾 1  彭抒昂 2  易干军 13 周碧容 1  吴元立 1
(1广东省农业科学院果树研究所 , 广东广州 510640; 2华中农业大学园艺林学学院 , 湖北武汉 430070)
摘  要 : 以香蕉 (M usa spp. ) 为试材 , 对其离体培养茎尖玻璃化法超低温保存影响因素进行研究。结
果表明 , 不定芽在 MS + 310~510 mg/L 62BA + 011 mg/L NAA的培养基上分化较好。香蕉茎尖超低温保存
较佳体系是 : 210~310 cm的茎尖在含 014 mol/L蔗糖培养基上预培养 2 d, 剥取带 1~2个叶原基的茎尖
(长 110~115 mm) , 室温 (25℃) 下装载液 (MS + 2 mol/L甘油 + 014 mol/L蔗糖 ) 装载 20~30 m in, 然后
用玻璃化溶液 ( PVS2 ) 于 0℃下处理 40 m in, 换 1次 PVS2后迅速投入液氮。保存至少 1 h后 , 在 40℃水浴
中化冻 90 s, 用 112 mol/L蔗糖培养液洗涤 2次 , 每次 10 m in, 然后转入含 013 mol/L蔗糖的 MS培养基上 ,
暗培养 10~15 h后转移到含 015 mg/L 62BA的 MS培养基中 , 暗培养 1周后转移到正常光下 , 3个香蕉品种
(巴西蕉、广东香蕉 2号、广东粉蕉 1号 ) 的成活率分别为 7519%、4010%和 6916% , 再生率分别为
6314%、3510%和 6314%。再生植株生长和分化正常 , 生根后可移栽成活。
关键词 : 香蕉 ; 茎尖 ; 超低温保存 ; 玻璃化法
中图分类号 : S 66811  文献标识码 : A  文章编号 : 05132353X (2006) 0320501206
Cryopreserva tion of in V itro Shoot T ips of Banana by V itr if ica tion and Its
Regenera tion
W u L im ing1, 2 , Zeng J iwu1 , Peng Shupiang2 , Yi Ganjun13 , Zhou B irong1 , and W u Yuanli1
(1 Fru it R esearch Institu te, Guangdong A cadem y of A gricu ltura l Science, Guangdong, Guangzhou 510640, China; 2 College of
Horticulture, Huazhong A gricultura l U niversity, W uhan, Hubei 430070, Ch ina)
Abstract: Shoot tip s excised from healthy in vitro p lants of three Banana cultivarswere successfully cryo2
p reserved with the vitrification technique. A suitable p rocedure was established as follows: 3 - 4 weeks after
subculture, shoot tip s about 2 - 3 cm in length were p recultured for 2 days on MS medium supp lemented with
014 mol/L sucrose. D issected shoot ap ices about 110 - 115 mm in length with one or two leaf p rimordium
were loaded with a m ixture of 2 mol/L glycerol p lus 014 mol/L sucrose for 20 - 30 m in at room temperature.
These excised shoot tip s were sufficiently dehydrated in a highly concentrated p lant vitrification solution for 40
m in at 0℃. And then p lunged directly into liquid nitrogen and conserved for at least 1 h. After rap id thawing
in water at 40℃ for 90 s, the tip swere rinsed with 112 mol/L sucrose solution for 20 m in at room temperature
and then p lated on MS medium supp lemented with 015 mg/L 62BA. The cryop reserved materialswere cultured
in darkness for one week so that they could grow quickly. Successfully cryop reserved shoot tip s resumed growth
within 10 days of p lating and developed shootswithin 1 month without intermediary callus formation. This sim2
p le p rotocol was successfully app lied to the three cultivars belonging to two genom ic group s of banana. The
survival rate of shoot tip swas 7519% , 4010% , 6916% , and regrowth rate reached 6314% , 3510% , 6314%
respectively. A lmost all the shoot tip s formed roots and were successfully transferred to soil in pots. The p lant2
lets could normally root and survive after transp lantation.
Key words: Banana; Shoot2tip; Cryop reservation; V itrification
香蕉种质保存通常采用建立种质资源圃 , 进行田间活体保存。但该保存方法需要大量人力、物
园   艺   学   报 33卷
力 , 受多种外界环境条件影响 , 且易受到许多病虫害的侵袭 , 导致种质资源丢失。此外 , 常规离体保
存需要经常继代 , 易污染和变异 , 有不可克服的缺点和不足。玻璃化法超低温保存是目前植物细胞和
组织长期稳定保存的理想方法 , 能节省空间 , 避免污染和继代 , 克服体细胞变异 , 并且设备简单 , 操
作简便。迄今 , 利用玻璃化法已成功保存了苹果、梨〔1〕、杏〔2〕、柑橘〔3〕、柿〔4〕、樱桃〔5〕、马铃薯〔6〕、
番木瓜〔7〕等离体茎尖。本研究以香蕉为试材 , 研究影响香蕉茎尖玻璃化法超低温保存的一些因素 ,
以期为香蕉茎尖超低温保存提供理论和实践借鉴。
1 材料与方法
111 材料及茎尖初始培养
供试材料采自国家种质资源广州香蕉圃 , 品种为 : 广东香蕉 2号 〔M usa acum ina ta (AAA group )
‘Dwraf Cavendish’‘Guangdong 2’〕、巴西蕉 〔M usa acum ina te ( AAA group ) ‘Dwraf Cavendish’
‘Baxi’〕、广东粉蕉 1号 〔M usa ×parad isiaca (ABB group) ‘Da J iao’‘ Guangfen 1’〕。
以无病害的香蕉吸芽为材料 , 去掉根和外层叶鞘 , 用自来水冲洗干净 , 经常规灭菌后将茎尖接种
在初代培养基上。香蕉最佳外植体为芽的顶端分生组织部分〔8〕。诱导出芽的培养基以 MS为基本培养
基 , 附加不同浓度的 62BA和 NAA , 蔗糖 30 g/L , 琼脂 618 g /L , 用 1 mol/L的 HCl或 NaOH调节 pH
到 518, 经 121℃高压灭菌 15 m in。培养温度为 (25 ±2) ℃, 光照 14 h /d。
112 玻璃化保存方法
11211 茎尖剥离  选取继代培养 20~30 d的健康植株 , 在无菌条件下取 110~115 mm大小的茎尖 ,
为防止茎尖干燥 , 剥离后立即置于 011 mol/L蔗糖的 MS培养基上。
11212 茎尖预培养  将剥离的茎尖放在 MS + 210 g/L 62BA + 012 g /L IAA + 5g/L 琼脂 + 014 mol/L
蔗糖的培养基上进行预培养。预培养时间设 (0、1、2、3、5、7 d) 6个处理 , 然后对预培养中蔗糖
浓度设 (0、013、014、015、017 mol/L) 5个处理。
11213 装载  将预培养后的茎尖在室温下装载不同时间 ( 0、20、30、40 m in) , 装载液为 MS + 2
mol/L甘油 + 014 mol/L蔗糖 , pH 518, 并经高温灭菌。
11214 脱水 (Dehydration) 处理  将茎尖从装载液中转移至无菌滤纸上停留 30 s, 然后转入低温
(0℃) 下 , 在玻璃化液 ( Plant V itrification Solution, PVS2 ) 中进行脱水处理 ( 0、10、20、30、40、
50、60 m in) , PVS2的成分为 MS + 30%甘油 + 15%乙二醇 + 15%二甲基亚砜 + 014 mol/L蔗糖 , pH
调至 518, 并经高温灭菌。
11215 液氮保存  将处理后的茎尖装入 2 mL 冷冻管中 , 换 1 次新鲜 PVS2后迅速投入液氮
( - 196℃) 中保存 , 保存时间不少于 1 h。
以预培养蔗糖浓度、预培养时间、装载液处理时间、PVS2处理时间 4因素进行正交试验 (每因
素 3个水平 ) 并对 4因素进行单因子试验 , 每处理至少 10个茎尖 , 3次重复。
11216 解冻处理和再培养 将材料从液氮中取出后 , 在 40℃水浴中迅速解冻 90 s, 然后吸去 PVS2 ,
用 MS + 112 mol/L蔗糖液洗涤两次 , 每次 10 m in。先在 MS + 013 mol/L蔗糖培养基上暗培养 10~15 h
后 , 再在 MS + 015 mg/L 62BA的恢复培养基上暗培养 1周 , 然后转入光下培养。半个月后统计成活
率 (转为绿色茎尖占每次试验材料总数的百分率 ) , 转为绿色为成活 , 否则为死亡 ; 1个月后统计再
生率 (直接再生成芽的茎尖占每次试验材料总数的百分率 ) , 再生植株移入温室内栽培。
113 数据统计分析
试验结果由 SAS 6112版本统计软件分析 , 差异显著性采用邓肯氏新复极差测验方法来评估。
2 结果与分析
211  62BA对香蕉茎尖离体培养的影响
3 个香蕉品种茎尖接种到附加不同浓度的 6 2BA和NAA的培养基上培养 ,结果 (表 1 )表明 , 6 2BA
205
 3期 吴黎明等 : 香蕉茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生  
对茎尖有明显的促进作用 , 低浓度时产生的丛芽少 , 浓度高时丛芽增多 , 但超过 610 mg/L时基部产
生较多愈伤组织块 , 再生芽继代时不易切割 , 且生长较弱 (图版 , A、B )。3个品种对 62BA浓度的
反应也有区别 , 巴西蕉、广东香蕉 2号以 510 mg/L为佳 , 广东粉蕉 1号则以 310 mg/L较佳。
表 1 62BA对香蕉不定芽分化的影响
Table 1 Effect of banana shoot m ultiplica tion trea ted by 62BA
处理号
Code
62BA
(mg/L)
NAA
(mg/L)
分化倍数 Multip le of buds
巴西蕉
Baxi(AAA)
广东香蕉 2号
Guangdong 2 (AAA)
广东粉蕉 1号
Guangfen 1 (ABB)

Bud
愈伤块
Callus
Ⅰ 110 011 115 113 114 少 A few 无 No
Ⅱ 210 012 118 211 216 少 A few 无 No
Ⅲ 310 011 218 314 211 较多 More 无 No
Ⅳ 510 011 410 318 216 较多 More 少量 A little
Ⅴ 610 011 519 415 510 较多 More 较多 More
212 超低温保存正交试验结果
将预培养蔗糖浓度、预培养时间、装载液装载时间、PVS2脱水时间 4因素 , 按每因素 3水平设计
正交试验 L9 34 (表 2)。对数据进行分析 ( SAS 6112版本统计 ) 显示 , 正交试验的 4因子主次顺序
为 : PVS2 处理时间、蔗糖浓度、装载时间、预培养时间 , 4因子各水平之间差异显著 , 试验的最佳
处理组合是香蕉茎尖在含 014 mol/L蔗糖培养基上预培养 2 d, 室温下装载液装载 20~30 m in, 0℃
PVS2处理 40 m in。
表 2 超低温保存正交试验结果
Table 2 Results from orthogona l exper im en t
处理号
Treatment No1 蔗糖Sucrose (mol /L) 预培养时间Preculture time ( d) 装载时间Loading time (m in) PVS2处理时间PVS2 treatment time (m in) 成活率Survival rate ( % )
1 013 (1) 1 (1) 20 (1) 20 (1) 2519
2 013 (1) 2 (2) 30 (2) 30 (2) 4010
3 013 (1) 3 (3) 40 (3) 40 (3) 5119
4 014 (2) 1 (1) 30 (2) 40 (3) 6018
5 014 (2) 2 (2) 40 (3) 20 (1) 3014
6 014 (2) 3 (3) 20 (1) 30 (2) 4117
7 015 (3) 1 (1) 40 (3) 30 (2) 4019
8 015 (3) 2 (2) 20 (1) 40 (3) 6512
9 015 (3) 3 (3) 30 (2) 20 (1) 3312
T1 3913 b 4215 b 4412 a 2918 c
T2 4413 a 4512 a 4417 a 4019 b
T3 4614 a 4213 b 4111 b 5913 a
  注 :括号内数字表示处理水平。T值表示同列中对应相同水平的平均值 ,同列内相同字母表示经邓肯氏新复极差测验在 0105水平
上差异不显著。Note: The number in bracketmeans treatment level. T means the average percentages of the same levelwithin columns. Difference with2
in columns by Duncanpis multip le range test at P =0105.
213 超低温保存单因子试验
设计单因子试验 , 利用正交试验结果 , 只变化单因子 , 其它处理按最佳处理组合进行。
21311 预培养蔗糖浓度和预培养时间 预培养对提高植物材料超低温保存后的成活率有很大影响〔9〕。
本试验采用 MS基本培养基附加不同浓度的蔗糖进行预培养。由图 1可知 , 巴西蕉茎尖超低温保存成
活率随蔗糖浓度的增加先增后减 , 当蔗糖为 014和 015 mol/L时 , 成活率分别为 7519%和 6813% , 当
蔗糖为 017 mol/L时 , 成活率降至 2217%。同时 , 预培养时间也明显影响保存效果 (图 2)。不进行
预培养 , 保存后成活率仅为 3814% , 预培养 1 d, 成活率为 6217% , 预培养 2 d, 保存效果最好 , 成
活率达 7519%。但随着预培养时间延长 , 成活率迅速下降 , 当预培养 7 d时 , 成活率仅为 2812% ,
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对照也降至 5313%。可能是茎尖在预培养过程中增强了细胞的渗透性 , 使茎尖能适应随后的 PVS2的
快速脱水过程 ; 而培养时间过长 , 蔗糖浓度过高 , 对细胞产生了渗透胁迫。
21312 装载液装载时间  在用 PVS2进行快速脱水前 , 用高浓度的装载液 (MS + 2 mol/L甘油 + 014
mol/L蔗糖 ) 进行处理 , 以初步降低组织的含水量 , 从而可以避免由于渗透压变化太强而对材料造成
的伤害。这是一个渗透保护的处理过程 , Matsumoto等〔4〕用此装载液处理柿的休眠芽茎尖 , 获得了极
高的成活率 (9215% )。本试验采用装载液对巴西蕉茎尖进行预处理 , 结果表明 , 预培养 2 d后的茎
尖在装载液中处理 20~30 m in, 保存后成活率可达 6817% , 而不处理的成活率仅为 2518% (图 3)。
21313  PVS2处理  据报道 , PVS2处理时间是影响超低温保存的关键因素〔10〕, 在 0℃条件下处理比在
室温下可减轻冰冻保护剂对材料的毒害〔1〕。本研究中将预培养和预处理后的巴西蕉茎尖在 0℃条件下
在 PVS2中处理 0~60 m in, 结果 (图 4) 表明 , 未经 PVS2处理的 , 保存后茎尖全部死亡 ; 经 30 m in
处理的 , 成活率为 6216% , 而处理 40 m in的高达 7519% , 但处理时间延长 , 成活率又迅速下降 , 60
m in时 , 降至 2615%。同时 , 对照 ( PVS2处理但不经液氮保存 ) 的成活率一直呈下降趋势 , 处理 60
m in后成活率低至 3111%。其主要原因是 PVS2的二甲基亚砜的毒害和过度脱水对材料的伤害。
21314 保护液  以广东粉蕉 1号 (ABB) 茎尖为材料 , 研究不同冰冻保护液对香蕉超低温保存后成
活率的影响。从表 3可知 , PVS2处理香蕉茎尖后 , 超低温保存后效果好 , 用 PVS3处理成活率为 0,
PVS4和 PVS1的保存效果也不理想。因此 , PVS2处理比较适应于香蕉超低保存。
21315 超低温保存时间  结果 (表 4) 表明 , 广东粉蕉 1号 (ABB ) 茎尖保存 1 h、1 d、1周、10
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 3期 吴黎明等 : 香蕉茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生  
周的成活率都在 60%以上 , 彼此之间差异不显著 , 说明香蕉在液氮中保存的时间长短不影响保存效
果。理论上讲 , 生物材料在液氮条件下 , 其生理代谢基本停止 , 所以保存时间长短不会影响保存结
果 , 这与 N iino等〔5〕所报道的樱桃超低温保存后的结果一致。
表 3 不同的超低温保护液对香蕉茎尖超低温保存后成活率的影响
Table 3 Effect of ABB shoot ap ices exposed to d ifferen t
cryoprotectan t solution s on surv iva l ra te
处理
Treatment
甘油
Gly
( % )
乙二醇
EG
( % )
二甲基亚砜
DMSO
( % )
蔗糖
Sucrose
(mol/L)
PEG
( % )
茎尖成活率
Survival rate
( % )
PVS1 22 13 15 13 3013 ±015 b
PVS2 30 15 15 0140 69. 6 ±2. 5 a
PVS3 50 1146 0 ±0 c
PVS4 35 20 0160 212 ±319 c 表 4 超低温保存时间对成活率的影响Table 4 Effect of d ifferen t tim es con serv ingin liqu id n itrogen on surv iva l ra te保存时间Conserving time 茎尖成活率Shoot tip s survival rate ( % )1 h 6916 ±215 a1 d 6618 ±312 a1week 6516 ±511 a10 weeks 6415 ±511 a
214 超低温保存后的形态发生和植株再生
将保存材料从液氮中取出 , 迅速化冻并洗涤后 , 接种到恢复培养基 (MS + 015 mg/L 62BA ) 上 ,
半个月后一部分茎尖呈白色或褐变 , 一部分茎尖愈伤化 , 分生组织和叶原基无序生长 , 最后死亡 , 大
部分茎尖则直接成芽 , 通过继代培养能再生成丛芽 (图版 , C、D、E) , 再生芽可在生根培养基上诱
导生根 (图版 , F) , 经炼苗后移栽到温室 , 再生植株在形态上与对照无异 (图版 , G)。最后移栽到
营养钵中进一步生长 (图版 , H)。
215 香蕉茎尖超低温保存品种间的差异
应用正交试验和单因子试验优化的香蕉超低温保存条件和方法 , 对三种香蕉品种的茎尖进行了超
低温保存。由表 5可知 , 巴西蕉和广东粉蕉 1号的成活率分别为 7519%和 6916% , 再生率均为
6314% , 而广东香蕉 2号较低 , 成活率和再生率仅为 4010%和 3510% , 品种之间差异显著。
表 5 不同品种间应用超低温保存茎尖后的成活率和再生率的差异
Table 5 Surv iva l and regenera tion ra te of cryopreserva tion shoot2tips from d ifferen t cultivars of banana ( % )
品种或基因型 Cultivars or genotype
成活率 Survival rate
超低温保存 Cryop reservation 对照 Control
再生率 Regeneration rate
超低温保存 Cryop reservation 对照 Control
巴西蕉 Baxi(AAA) 7519 ±317 a 7915 ±319 a 6314 ±314 a 7315 ±113 a
广东香蕉 2号 Guangdong 2 (AAA) 4010 ±215 c 8316 ±417 a 3510 ±319 b 7315 ±410 a
广东粉蕉 1号 Guangfen 1 (ABB) 6916 ±215 b 7919 ±210 a 6314 ±710 a 6918 ±310 a
3 讨论
玻璃化法超低温保存关键技术在于进行快速冷冻及解冻过程中 , 使材料形成玻璃化状态 , 避免细
胞内冰晶的形成 , 该技术已经成功应用于多种果树〔11〕。香蕉对低温较为敏感 , 用此法进行超低温保
存时 , 材料在处理过程中如何诱导脱水是成功保存茎尖的关键。本研究过程中未对香蕉进行低温预培
养 , 而是采用高糖预培养的方式 , 避免了冷害的发生。另外 , 在 PVS2快速脱水前 , 采用装载液对材
料进行渗透性处理 , 提高了成活率。利用保护剂 PVS2处理 , 是香蕉超低温保存的关键步骤 , 它可以
使茎尖组织进一步脱水 , 溶液中的保护剂 (二甲基亚砜、甘油、乙二醇等 ) 和渗透调节物质迅速进
入到组织细胞中 , 以便在快速冷冻时茎尖组织形成玻璃化状态 , 减轻伤害 , 达到保护的作用。
香蕉茎尖超低温保存后 , 多数茎尖可以直接生长并再生成植株 , 这种通过器官发生的途径可减少
变异发生的频率。目前从再生植株的形态上看 , 与对照无异 , 但再生植株的遗传稳定性如何 , 现正在
从细胞及分子水平上进一步研究。超低温保存过程中 , 导致茎尖死亡、愈伤化等原因 , 有待从细胞显
微及亚显微结构上进一步研究 , 以探明相关机理 , 以便优化超低温保存体系。
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图版说明 : A. 茎尖继代产生的丛生芽 ; B. 62BA浓度过高时的增殖情况 ; C、D. 超低温保存后茎尖直接成芽 ( C. 恢复培养 3周 ; D.
恢复培养 6周 ) ; E、F. 超低温保存苗的增殖、生根情况 ; G. 再生植物移栽入温室 , 左边为对照 ; H. 超低温保存后在温室中生长两个
月的情况。
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p reserved shoot2tip s (6 weeks) ; E and F. Proliferation and rooting of p lantlets after cryop reservation; G. Transp lantation in green2house, left un2
treated control; H. Regeneration p lantlet developed from cryop reserved shoot2tip s after two months.
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