全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1185～1192
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 11 - 11; 修回日期 : 2006 - 07 - 26
基金项目 : 国家科技部 ‘十五’攻关项目 (2004BA713B09205)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: marongcai@baafs1net1cn)
扁桃 SL F基因和 S2RN ase基因的克隆及表达分析
郭振宇 1, 2 　常凤启 1 　谢　华 1 　徐　勇 1 　马荣才 1, 23
(1 北京农业生物技术研究中心 , 北京 100089; 2 首都师范大学生命科学学院 , 北京 100037)
摘 　要 : 以扁桃 ‘Pioneer’品种为材料 , 利用 RT2PCR及 RACE技术 , 克隆了 1个新的 SLF ( S Locus
F2box ) 基因 ( PdSL F1) 和两个新的 S 2RN ase基因 ( PdSm 和 PdSn) 的 cDNA。PdSL F1全长 1 331 bp, 编码
376个氨基酸 ; PdSm 全长 826 bp, 编码 228个氨基酸 ; PdSn基因全长 878 bp, 编码 227个氨基酸。与公共
数据库中的序列进行相似性比较 , 发现这 3个基因所编码的氨基酸序列与其它蔷薇科植物相应基因的氨基
酸序列均具有较高的一致性 , PdSLF1为 7012% ～8418% , S2RNase为 59% ～8319%。PdSLF1基因在花药
中专一性表达 , 而 PdSm 和 PdSn基因在雌蕊中专一性表达。
关键词 : 扁桃 ; 自交不亲和 ; 基因 ; 克隆 ; S2RNase
中图分类号 : S 66211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621185208
C lon ing and Expression Ana lysis of the SL F and S 2RN ase Genes in A lm ond
Guo Zhenyu1, 2 , Chang Fengqi1 , Xie Hua1 , Xu Yong1 , and Ma Rongcai1, 23
(1B eijing A gro2B iotechnology Research Center, B eijing 100089, Ch ina; 2L ife Science College, Capita l N orm al U niversity, B eijing
100037, Ch ina)
Abstract: U sing RT2PCR and Rap id Amp lification of cDNA Ends (RACE) techniques, cDNA s for one
novel SL F (S Locus F2box) ( PdSL F1) gene and two novel alleles of S 2RN ase genes ( PdSm and PdS n) were
cloned from almond ( P runus du lcis M ill. ) cultivar‘Pioneer’, and their exp ression patterns were investigated
in anthers, p istils, petals, sepals and leaves. PdSL F1 was 1 331 bp in length encoding a p rotein of 376 am ino
acids. The comp lete cDNA of PdSm was 826 bp encoding 228 am ino acids and PdSn 878 bp encoding 227
am ino acids. Compared the deduced p rotein sequences with those registered in GenBank, PdSLF1, PdSm and
PdSn p roteins shared high identities with other SLF (7012% - 8418% ) and S2RNase (59% - 8319% ) p ro2
teins, respectively. Furthermore, the results of sem i2quantitative RT2PCR analysis showed that PdSLF1 ex2
p ressed exclusively in anthers, and two alleles of S 2RN ase, PdSm and PdSn, exclusively in p istils, which sug2
gested that they may participate in self2incompatibility in almond.
Key words: A lmond; Self2incompatibility; Gene; Cloning; S2RNase
扁桃 ( P runus du lcis M ill. ) 的大多数品种都是高度自交不亲和的 , 异花授粉效率低 , 使得其产量
低。研究其自交不亲和的分子机制 , 有助于选育自交亲和的扁桃品种。不亲和性在遗传上受 S位点复
等位基因控制。雄蕊和雌蕊分别受不同的 S基因控制 , 即花粉 S基因和雌蕊 S基因〔1〕。雌蕊中控制自
交不亲和反应基因都编码一种具有核酸酶活性的糖蛋白 , 即 S2RNase。花粉 S基因的鉴定及特性研究
则是理解基于核酸酶配子体自交不亲和 ( GSI) 分子机制的关键之一〔2〕。近年来 , 越来越多的证据表
明 , 一种 F2box蛋白基因 ———SL F (S Locus F2box) , 具有花粉 S基因所应有的特点 , 即 : 在花粉中专
一性表达 ; 具有很高的单体基因型专一的序列多态性 ; 与 S 2RN ase基因高度连锁 , 因此该基因很可能
就是植物自交不亲和的花粉决定因子。F2Box蛋白是泛素连接酶 ( SCF comp lex) 家族的成员 , 这提示
泛素 - 26S蛋白酶体蛋白质降解系统在雌蕊分辨自身与非自身花粉中起着中心作用〔3～6〕。
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由于 S2RNases的核酸酶活性对于植物自交不亲和功能是必需的 , 因而人们普遍认为植物雌蕊 S2
RNases降解了自身花粉管的 RNA, 导致自身花粉在柱头中的生长受阻。有两个模型 , 即守卫者
( gatekeeper) 模型〔7〕和抑制剂 ( inhibitor) 模型〔8〕, 试图解释 S2RNase与花粉 S基因相互作用可能的
分子机制。按照抑制剂模型 , SLF /SFB和同源 S2RNase专一性结构域 ( SD ) 之间的相互作用可以在
一定程度上阻止自身 S2RNase的泛素化 , 而 SLF /SFB与非同源 S2RNase之间由于 SD不匹配 , 不能相
互作用 , 使得非同源 S2RNase被泛素化 , 从而实现 S等位基因专一性的降解。Q iao等〔4〕发现了一个具
有花粉 S基因特点的 F2box基因 , 其产物 AhSLF2S2蛋白与 S2RNases蛋白之间可以相互结合。该蛋白
可能通过与 SCF复合物其它组分 ( skp1) 的结合 , 形成有功能的泛素连接酶 ( E3) , 专一性的泛素化
非同源的 S2RNase, 唯独保留同源 S2RNase的活性 , 从而诱发自交不亲和反应〔4〕。
扁桃 S 2RN ase为复等位基因 , 目前已经从不同的扁桃栽培种中克隆了多个 S 2RN ase基因〔9, 10〕。作
者从扁桃栽培品种 ‘Pioneer’中克隆了 1个 F2box基因和 2个 S 2RN ase基因的 cDNA序列 , 并对这 3
个基因在扁桃不同组织中的表达进行了研究。
1　材料与方法
试材为扁桃 ‘Pioneer’中期花蕾及幼嫩叶片 (取自陕西杨凌西北农林科技大学园艺学院扁桃实
验地 )。采用 TE23D法〔11〕提取 5种组织 (雌蕊、花药、花瓣、萼片、叶片 ) 的总 RNA。
SL F和 S 2RN ase基因 cDNA的克隆 : 根据公共数据库中目的基因的同源基因 , 设计简并性引物
P1U (MCAACCKCAAAAGATGACATT) 和 P1L ( GCATGCCCTCCTCCTCACAA ) , 用来扩增 SL F基因的
cDNA 部分序列 ; 简并引物 P3U ( CARTTYGTBCARCARTGGCC ) 和 P3L ( TACCACTTCATGTAA2
CAACTGAG) , 用来扩增 S 2RN ase基因 cDNA部分序列。PCR扩增程序为 94℃预变性 4 m in, 94℃ 1
m in, 退火温度分别为 50℃和 57℃, 72℃ 1 m in, 35个循环 , 最后 72℃延伸 10 m in。ExTaq酶及 dNTP
均购自 TaKaRa公司 (日本 )。PCR产物克隆测序后 , 根据序列结果 , 设计扁桃 SL F基因 3’RACE特
异引物 SLF2GSP1 (AGAACCCCTCCAATCAGCACTAAC) 和 SLF2GSP2 ( TTCGCGGTTTATAGTCTTAG)。
用 BD SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒 (BD B iosciences, Clontech) 进行 3’RACE和 5’RACE扩
增 , 具体操作过程依据产品说明书进行。
SLF蛋白和 S2RNase蛋白序列分析 : 利用 DNASTAR软件的 MegA lign程序对推测的扁桃 SLF和 S2
RNase蛋白序列与金鱼草、矮牵牛、扁桃其它栽培种、酸樱桃和甜樱桃等植物的同源氨基酸序列进行
相似性比对 , 并绘制系统进化树。
与扁桃 SLF推测蛋白进行相似性比对及系统进化分析的蛋白质为 (括号内为其 GenBank登录
号 ) : A ntirrh inum , AhSLF4 ( CAD56661 ) , AhSLF5 ( CAD56664 ) ; P. infla ta, PiSLF1 (AAS79484 ) ,
PiSLF2 ( AAS79485 ) ; P runus du lcis, PdSFBa ( AB096758 ) , PdSFBb ( AB092966 ) , PdSFBc
(AB092967) , PdSFBd (AB079776) ; P. m um e, PmSLF1 (AB081648) , PmSLF7 (AB101440) ; P. avi2
um , PaSFB1 ( AB111518 ) , PaSFB2 ( AB111519 ) , PaSFB5 ( AB111520 ) ; P. arm eniaca, ParSFB1
(AAT69247)。
与 S2RNase推测蛋白比对及系统进化分析的蛋白质为 (括号内为其 GenBank登录号 ) : P. infla2
ta , PiS1 ( S20989 ) , PiS2 ( AAG21384 ) ; PdSa ( BAA95317 ) , PdSb ( T12078 ) , PdSc ( T12076 ) ,
PdSe (AAF82612) , PdSf ( AAL35959 ) ; P. avium , PaS1 ( CAC27784 ) , PaS23 ( AAP92437 ) ; P.
m um e, PmSf (BAC56114) ; P. sa licina, PsSa (BAA95157) ; P. cerasus, PcSa (BAB84687)。
半定量 RT2PCR分析 : 根据基因的全长 cDNA序列 , 分别设计扁桃 SL F和 S 2RN ase基因特异引物 ,
进行目的基因在组织中的差异表达分析。扁桃 SL F的引物为 P1L和 P2U ( TTGGCGGTTGAGGTTTAT2
AGTCTTAA ) ; S 2RN ase基因的引物为 P4U (CGCGTCAAGCGACCTTGCTCCAATCC) 和 P4L ( GTATTG2
CATTAGGTTAAGTGTTCG) , 以及 P5U ( CTTAGTAGCAAACCTTCCAACCAACA ) 和 P5L ( TTTTGT2
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　6期 郭振宇等 : 扁桃 SLF基因和 S2RN ase基因的克隆及表达分析 　
GTCGCACTTGGTACTATC) , 分别用来扩增 S 2RN ase基因的两个等位基因 ; 使用蛋白延伸因子 EF21α
作为内部参照 , 其引物为 EF21αU (AATTGCCTTTGTTCCCATCTCTG) 和 EF21α L ( TGGGCTCCTTCT2
CAATCTCCTTAC)。100 ng总 RNA 的反转录反应依照 SuperScrip tTM RNase H - Reverse Transcrip tase
( Invitrogen) 使用说明进行。RT2PCR反应程序为 94℃预变性 4 m in, 94℃变性 1 m in, 退火温度分别
为 50℃、55℃和 60℃, 72℃延伸 55 s, 30个循环 , 最后 72℃延伸 10 m in。每个基因的 RT2PCR分析
重复 3次。
2　结果与分析
211　扁桃 SL F基因的克隆和序列分析
利用所设计的扁桃 SL F的引物进行 PCR扩增 , 得到与预期长度相吻合的 PCR扩增产物。通过扩
增产物的回收、克隆、验证和双向测序 , 得到扁桃 SL F基因 CDS的 5pi端。根据测序结果 , 设计扁桃
SL F基因特异引物进行 3’RACE扩增 , 并与前面获得的 5’端进行拼接 , 即获得 1 331 bp的 cDNA
序列 (命名为 PdSL F1, GenBank登录号为 DQ099896)。PdSL F1编码区长度为 1 128 bp , 起于第 14
位 , 止于 1 141位 , 推测编码 376个氨基酸 (图 1)。
图 1　PdSL F1 cD NA及推测的氨基酸序列
F ig. 1　Sequences of PdSL F1 cD NA and its deduced am ino ac ids
212　S 2RN ase基因的克隆和序列分析
利用所设计的 S2RNase引物进行 PCR扩增 , 得到与预期长度相吻合的扩增产物。通过回收、克
隆、验证和双向测序 , 得到 S 2RN ase基因 CDS的中间部分。又经 5’RACE与 3’RACE后 , 将所得
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序列与前面获得的 cDNA部分序列拼接 , 即获得两个 S 2RN ase基因 (等位基因 ) 全长 , 分别命名为
PdSm ( GenBank登录号 DQ099895) 和 PdSn (DQ093825)。其中 PdSm 全长 826 bp, 编码区为 684
bp, 起于 60位 , 止于 743位 , 编码 228个氨基酸。PdSn全长 878 bp , 编码区为 681 bp, 起于 91位 ,
止于 771位 , 编码 227个氨基酸 (图 2, 图 3)。
图 2　PdSm cD NA及推测的氨基酸序列
F ig. 2　Sequences of PdSm cD NA and its deduced am ino ac ids
图 3　PdSn cD NA及推测的氨基酸序列
F ig. 3　Sequences of PdSn cD NA and its deduced am ino ac ids
213　PdSL F1和 S2RNa se蛋白的同源性比对和蛋白结构分析
把 PdSL F1基因编码的氨基酸在 NCB I上进行蛋白质比对 , 结果表明 , PdSLF1蛋白与蔷薇科的梅
( P runus m um e) 的 SLF蛋白、甜樱桃 ( P runus avium ) 的 SLF及扁桃的 SFB蛋白 , 均具有较高的一致
性 (图 4)。其中 , PdSLF1蛋白与梅的 SLF1一致性最高 , 为 8418%。与扁桃的 SFBa一致性最低 , 为
7012%。不同蛋白区段的序列保守程度变化很大。PdSLF1蛋白具有 F2box蛋白的基本结构 , 即在蛋
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　6期 郭振宇等 : 扁桃 SLF基因和 S2RN ase基因的克隆及表达分析 　
白的 N端有一段由 43个氨基酸组成的 F2box标签 (图 4中方框标识部分 ) , 保守性较高。该蛋白还含
有两个变异区及两个高变区 , 均以方框标出。
图 4　PdSL F1蛋白与其它 SL F蛋白的序列比对
V1和 V2: 变异区 ; HVa和 HVb: 高变区。
F ig. 4　A lignm en ts of PdSL F1 prote in w ith other SL F prote in s
V1 and V2: Variable regions; HVa and HVb: Hypervariable regions.
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把 S 2RN ase基因编码的氨基酸在 NCB I上进行蛋白质比对 , 结果表明 , 蔷薇科植物梅的 S2RNase
蛋白、甜樱桃的 S2RNase蛋白及扁桃的 S2RNase蛋白 , 具有较高的一致性 (图 5)。其中 , PdSm与
PdSn之间的一致性为 7513% , 前者在第 49位比后者多一个缬氨酸残基。
PdSm与其它 S2RNase的一致性变化幅度较大 , 为 59% ( PdSa) ～8319% ( PaS23)。PdSn与其
它 S2RNase的一致性变化幅度较小 , 为 6211% ( PdSa) ～7414% ( PdSb)。
不同蛋白区段序列的保守程度变化较大 , 包含 5个保守区 ( C1～C5 ) 和一个高变区 ( HV )
(图 5)。在 S2RNase的 N末端 , 还含有一段由 26个氨基酸组成的信号肽。信号肽部分以下划线标
出。
图 5　PdSm和 PdSn蛋白与其它 S2RNa se蛋白的序列比对
C1～C5: 保守区 ; HV: 高变区。
F ig. 5　A lignm en ts of PdSm and PdSn w ith other S2RNa se prote in s
C1 - C5: Conservative regions; HV: Hypervariable region.
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214　PdSL F1和 S2RNa se蛋白的系统进化分析
对 15个 SLF /SFB蛋白和 14个 S2RNase蛋白的氨基酸序列进行系统进化分析 , 结果如图 6和图 7
所示。SLF /SFB和 S2RNase在蔷薇科李属植物中具有较高的一致性。本实验室所克隆的 PdSLF1与
PmSLF1具有最相近的系统进化关系 , PdSm与 PsSa、PdSn与 PdSf具有最相近的系统进化关系。
图 6　PdSL F1蛋白的系统进化分析
F ig. 6　Phylogenetic tree of PdSL F1 prote in sequences
w ith the known SL F /SFB sequences
图 7　S2RNa se蛋白的系统进化分析
F ig. 7　Phylogenetic tree of S2RNa se prote in sequences
w ith the known S2RNa se sequences
215　PdSL F 1和 S 2RN ase基因的半定量 RT2PCR
表达分析
提取扁桃不同组织的总 RNA, 以 EF21α基因
作为内部参照 , 进行半定量 RT2PCR分析 , 结果
见图 8。
PdSL F1基因在扁桃的花药中专一性表达 , 在
雌蕊、花瓣、萼片和叶片中没有表达 ; 两个 S 2
RN ase基因在雌蕊中专一性表达 , 在花药、花瓣、
萼片和叶片中均没有表达。
图 8　扁桃 PdSL F1和 S2RN ase半定量 RT2PCR分析
1: 雌蕊 ; 2: 花药 ; 3: 花瓣 ; 4: 萼片 ; 5: 叶片。
F ig. 8　Expression ana lysis of PdSL F1, PdSm and
PdSn using sem i2quan tita tive RT2PCR m ethod
1. Pistil; 2. Anther; 3. Petal; 4. Sepal; 5. Leaf.
3　讨论
茄科 ( Solanaceae)、蔷薇科 (Rosaceae) 和玄参科 ( Scrophulariaceae) 植物具有配子体自交不亲
和 ( GSI) 机制 , 它们的雌蕊决定因子都被确定为 S - 核糖核酸酶 ( S2RNase)。近年来 , 它们的花粉
决定因子也被逐渐确定 , 在扁桃〔12〕、梅 ( P runus m um e)〔3〕以及甜樱桃和酸樱桃 ( P. avium 和 P.
cerasus)〔13〕等多种蔷薇科植物中均发现了在花粉中专一性表达的 SL F /S FB 基因 , 这类基因具有很高的
单体基因型 (Hap lotype) 专一的序列多态性 , 并且与 S 2RN ase基因高度连锁。
本文图 4的结果表明 , 扁桃的 SLF蛋白 ( PdSLF1) 具有所有 F2box蛋白的基本结构 , 此外 , 该蛋
白还含有两个变异区及两个高变区 , 其中一个变异区及两个高变区均位于蛋白的 C - 末端 , 此特点与
PdSLF1蛋白的功能相对应 , 即它可能通过 N -末端的 F2box标签与 Skp1亚基的结合 , 从而与 SCF复
合物的其它组分相作用。C - 末端含有的高度变异的蛋白质作用结构域 , 则与靶蛋白结合 , 并赋予
SCF复合物以专一性〔14〕。
图 5的结果表明 , 从扁桃中克隆的 S 2RN ase基因 , 其编码的蛋白与蔷薇科其它植物的 S2RNase蛋
白具有较高的相似性。而且 PdSm和 PdSn与其它 S2RNase一样 , 包含 5个保守区 (C1～C5) 和 1个
高变区 (HV )〔9, 10〕。
此外 , S2RNase在 N端有一个 26个氨基酸的信号肽 , S2RNase在该信号肽的引导下向细胞质基质
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分泌 , 并在授粉过程中进入花粉管细胞。
半定量 RT2PCR的结果表明 , PdSL F1基因在扁桃的花药中专一性表达 , 两个 S 2RN ase基因在雌
蕊中专一性表达。Q iao等〔4〕用金鱼草作为试验材料 , 研究发现了一个具有花粉 S基因特点的 F2box基
因 AhSL F2S2 , 该基因在花粉和绒毡层细胞中专一性表达。此外 , Sijacic等〔6〕在矮牵牛中 , 鉴定了作
为花粉决定因子的 P iSL F基因 , 该基因在花药、成熟花粉和花粉管中都有表达 , 而在叶片、花瓣、萼
片、根、花柱、子房等组织中没有检测到表达。因此 , 扁桃中的 PdSL F1和 PdSm、PdSn符合作为自
交不亲和相关基因的表达特点。此外 , F2Box蛋白是泛素连接酶 ( SCF comp lex) 家族的一员 , 因此泛
素蛋白 - 26S蛋白酶体途径可能参与以 S2RNase为基础的配子体自交不亲和系统〔3, 12, 13〕。
本研究克隆了扁桃 PdSL F1及 S 2RN ase基因 , 这一研究只是初步的 , 还需要分离鉴定更多的参与
扁桃自交不亲和的基因并验证它们之间的相互关系。
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