全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (1) : 65～69
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 06 - 19; 修回日期 : 2004 - 09 - 16
基金项目 : 武汉市科技攻关项目 (20025007170)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: mzbao@mail1hzau1edu1cn)
农杆菌介导 C ry1Ac基因转化菊花
蒋细旺 1, 2 　包满珠 13 　吴家和 3 　张献龙 3 　田颖川 4
(1 华中农业大学园艺林学学院 , 武汉 430070; 2 江汉大学医学与生命科学学院 , 武汉 430056; 3 华中农业大学作物遗
传改良国家重点实验室 , 武汉 430070; 4 中国科学院微生物研究所 , 北京 100080)
摘　要 : 用农杆菌介导法 , 以茎段 (节间 ) 为外植体 , 将含有苏云金芽孢杆菌 (B t) 毒蛋白 C ry1A c基
因的植物遗传载体导入菊花 (切花菊 ) 品种 ‘日本黄 ’中 , 得到 126株抗性植株 , PCR检测及基因组 DNA
的 Southern杂交分析表明 C ry1A c基因已整合到菊花总 DNA中 , 共获得 6株转基因植株。利用棉铃虫做转基
因植株的盆栽和叶片平皿试验 , 发现其中 2株对棉铃虫具有很高抗性 , 校正死亡率达 90%以上 ; 1株对棉
铃虫具有高抗性 , 校正死亡率达 80%以上 ; 3株对棉铃虫抗性较明显 , 校正死亡率 4417% ～6019%。
关键词 : 菊花 ; 苏云金芽孢杆菌 ; C ry1A c基因 ; 抗虫性 ; 转基因植株 ; 棉铃虫 ; 根癌农杆菌
中图分类号 : S 68211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0120065205
Tran sforma tion of Chrysan them um w ith a Syn thetic C ry1A c Gene M ed ia ted
by A grobac te rium tum efac iens
J iang Xiwang1, 2 , Bao Manzhu13 , W u J iahe3 , Zhang Xianlong3 , and Tian Yingchuan4
(1 College of Horticulture and Forestry Science, Huazhong Agricultural U niversity, W uhan 430070, China; 2 College of M edicine and
L ife Science, J ianghan U niversity, W uhan 430056, China; 3 The N ational Key Labrotary of Crops Genetic Im provem ent, Huazhong
A gricultural U niversity, W uhan 430070, China; 4 Institu te of M icrobiology, Chinese Academ y of Science, B eijing 100080, China)
Abstract: A synthetic B t (B acillus thuring iensis) C ry1Ac gene was introduced into the genome of cut
flower chrysanthemum (Ch rysan them um m orifolium ) cultivar‘Japanese Yellow’in vitro with exp lants of in2
ternodal segmentsmediated by A grobacterium tum efaciens. Results of PCR and Southern blot analysis indicated
that C ry1Ac gene were integrated as one copy into the genome of chrysanthemum. Six transgenic lineswere ob2
tained in total. Upon insect bioassay using Helioth is arm igera (Hubner) in the pot2culture and in petri di2
shes, two of the screened p lants were demonstrated to be very highly resistant to the insect larvae, the correc2
ted mortality of insect larvae was higher than 90% in five days. One individual line showed strong resistance,
the corrected mortality of insect larvae was higher than 80%. Three transformed lines showed relative strong
resistance, the corrected mortality of insect larvae was ranged from 4417% to 6019%.
Key words: Chrysanthemum; B t (B acillus thuringensis) ; C ry1A c gene; Insect2resistant; Transgenic
p lants; Helioth is arm igera; A g robacterium tum efaciens
菊花 〔D endran them a m orifolium Tzvel. (Ch rysan them um m orifolium Ramat. ) 〕的虫害很多 , 我国的
菊花虫害有 11目 26科 52种〔1〕。自 Lem ieux〔2〕第 1次成功利用农杆菌介导法诞生第 1株转基因菊花
以来 , 为利用新基因资源改良菊花品种提供了新的手段和途径 , 使其在花色、花期、花型等方面都得
到了极大的改观和发展。傅荣昭等〔3〕将兔防御素 N P21基因导入菊花 , 获得了抗卡那霉素植株。
Takatsu等〔4〕将水稻几丁质酶基因用农杆菌介导法转移到菊花中 , 获得了 3株经 EL ISA检测对菊花灰
霉病 (B otry tis cinerea) 有极强抗性的植株。
苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因 (B t2toxin) 是最常用的抗虫基因。该转基因抗鳞翅目、鞘翅目等害
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
虫的研究在棉花、水稻等农作物以及杂交杨 Populus trem ula ×P. trem u loides、桉树等林木和园林植物
中已获得了成功。Wordragen等〔5〕用带有含 B t的 C ry1A b基因的质粒 pTiBO542转化菊花叶片 , 产生了
抗卡那霉素和表达 GUS的 17个抗性瘤 , 用它喂饲幼虫 , 结果在幼虫体内发现了 C ry1A b基因成分 , 转
基因菊花的第 2代植株能强烈抑制烟蚜夜蛾 (Helioth is virescens) 幼虫生长。Dolgov等用含 B t基因的
质粒转化菊花叶盘 , 获得 4株对蜱螨目 (蛛形纲 ) 二点叶螨 ( Tetranychus u rticae) 有抗性的转化植
株〔6〕; 还有用含 B t基因的质粒研究建立菊花高效遗传转化体系的报道〔7〕。日本学者 Shinoyama等〔8〕
也用携带含 C ry1Ab基因的质粒转化菊花 , 获得了抗烟蚜夜蛾的转化植株。
本研究将 B t的 C ry1A c基因通过根癌农杆菌介导法导入菊花中 , 并进行了抗虫性试验。
1　材料与方法
111　材料和培养基
材料为菊花中切花菊品种 ‘日本黄 ’的无菌苗 (由江汉大学医学与生命科学学院提供 ) ; 棉铃虫
(Helioth is arm igera) 由华中农业大学植保系提供。农杆菌菌株为 LBA4404, 质粒为 pB I12BT, 含有
N PT Ⅱ基因、CaMV35S启动的 C ry1A c基因 , 见图 1。各种限制性内切酶购自大连宝生物公司 , Taq酶
购自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室。抗生素购自武汉华美生物公司 ; 尼龙膜购自 Amer2
sham公司 ; 其它化学试剂均为分析纯。PCR之 N PT II引物由上海生工生物工程有限公司合成 , 引物
序列分别为 : 正向引物 1: 5pi2AGACAATCGGCTGCTCTGAT23pi; 反向引物 2: 5pi2TCATTTCGAAC2
CCCAGAGTC23pi。
图 1　质粒 pB I12BT的 T2D NA结构简图
F ig. 1　D iagram of T2D NA reg ion s of pla sm id pB I12BT
分化培养基 MS1为 : MS +BA 210 mg/L +NAA 015 mg/L , pH 610; 共培养培养基 MS2: 1 /2 MS
+ NAA 015 mg/L, pH 516; 筛选培养基 MS3: MS +BA 210 mg/L +NAA 015 mg/L +头孢霉素 300 mg/
L +卡那霉素 ( Km) 40 mg/L, pH 610; 筛选培养基 MS4: MS +BA 210 mg/L +NAA 015 mg/L +头孢
霉素 100 mg/L +卡那霉素 20 mg/L , pH 610; 生根培养基 MS5: 1 /2 MS +NAA 011 mg/L +卡那霉素
20 mg/L , pH 610。培养温度为 ( 25 ±2) ℃, 日光灯光源 , 光照强度为 2000 lx, 光周期为 14 h /d。
YEB液体培养基 (胰化蛋白胨 5 g /L +酵母浸膏 1 g /L +牛肉浸膏 5 g /L +MgSO2 01493 g/L, pH 710)。
每培养皿 20～30个茎段 (节间 ) 外植体 , 重复 5次。
112　农杆菌介导转化方法
取培养 3～4周的无菌苗节间为外植体 , 在 MS1上预培养 2～3 d。在含有 50 mg/L卡那霉素
( Km ) 的 LB平板 (胰化蛋白胨 10 g/L +酵母提取物 5 g/L +NaCl 10 g /L +琼脂 15 g/L , pH 710) 上
挑取含 B t基因的农杆菌单菌落 , 接种于 10 mL含有 50 mg/L Km的 YEB中 , 26℃, 180 r/m in过夜培
养至对数中期 (OD约为 016)。将预培养 2～3 d的外植体在上述菌液中浸泡 10～15 m in后 , 置于无
菌滤纸上吸干 , 在低盐、低 pH的 MS2上共培养 2～3 d, 保持温度 23℃。将共培养后的材料转入 MS3
中培养 3周 , 再转入 MS4中培养 2～3月 , 每 3周继代 1次。最后将卡那霉素抗性植株在生根培养基
MS5中进行生根培养 , 再将生根植株移栽上盆管理。
113　卡那霉素抗性植株的 PCR分析和 Southern杂交分析
用改良 SDS法从卡那霉素抗性植株提取 DNA进行 PCR检测。将转基因菊花植株的基因组 DNA
用 EcoRⅠ酶切消化并进行琼脂糖凝胶电泳、转膜和杂交 , 分子探针为用 32 P2α2dCTP标记的 N PTⅡ基
因片段〔9〕。
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　1期 蒋细旺等 : 农杆菌介导 C ry1A c基因转化菊花 　
114　转基因植株的抗虫活性测定
参照赵荣敏等〔10〕的方法 , 在盆栽 1个月的菊花苗 (8～10片叶 , 高 8～15 cm ) 上放置 8头二龄
棉铃虫 , 用玻璃罩盖住 , 1周内连续观察。重复 2次。参照 Tian等〔11〕的方法 , 采用盆栽 4个月菊花
(株高 30～45 cm ) 植株中部的离体叶片在封闭平皿中喂养 (平皿中放 1张滤纸 , 滴 5～8滴蒸馏水保
湿 )。每皿 1～2片叶 , 5头一龄棉铃虫 , 2 d换 1次叶片 , 重复 3次。3、5、7 d后检查死亡情况 , 将
未死昆虫称重并鉴定虫龄。计算死亡率 , 校正死亡率 , 蜕皮指数 , 幼虫平均体重及毒力。校正死亡率
( % ) = (供试昆虫死亡率 -对照昆虫死亡率 ) / (1 - 对照昆虫死亡率 ) ×100。蜕皮指数 = (1龄 ×头数
+ ⋯⋯ + n龄 ×头数 ) /总头数。毒力 (毒效 ) =对照蜕皮指数 /处理蜕皮指数 - 1 (数字愈高毒力愈强 )。
2　结果与分析
211　菊花的卡那霉素抗性植株的获得
1522个节间外植体在经过预培养、共培养和筛选培养后 , 约 1个月 , 未转化成功的外植体即使
有再生芽 , 也会白化死亡 ; 而经受一定浓度卡那霉素考验而直接再生成的抗性芽有 172个 , 再经卡那
霉素 20 mg/L的培养基中生根后 , 上盆 , 共得到 126株抗性植株。部分植株再生结果见图版 , A。
212　转化植株的 PCR检测
用 N PTⅡ基因的引物对生根抗性植株分批进
行 PCR检测 , 共有 15株扩增出了预期的目的片
段 , 大小为 768 bp。部分 PCR检测结果见图 2。
213　转化植株的 Southern杂交验证
将 15株 PCR扩增结果呈阳性的植株 , 先用
N PTⅡ基因制备的探针进行斑点杂交 (未列出 ) ,
有 6株呈阳性反应。然后再将 6个斑点杂交成功的
转化植株的 DNA做 Southern杂交验证 , 结果表明 ,
它们均呈阳性反应 (图 3, lane 2～7) , 出现特异
性杂交带 , 且含有 1个拷贝数的外源基因。而未转
化的植株则无特异性杂交带 ( lane 1) , 表明外源基
因已成功地整合到 ‘日本黄’的基因组中。
Southern杂交后计算的菊花抗虫转基因的转
化率为 418% , 与 Dolgov等〔7〕和 Shinoyama等〔8〕
获得的转化频率 (4% , 512% ) 大致相同。
214　转基因菊花植株对棉铃虫的抗性
对 6株转基因的菊花植株进行了盆栽和叶片
杀棉铃虫试验 , 结果表明 6株转基因的菊花植株
对棉铃虫的抗性有较大的差异。其中有 2株 (序
号 3, 4 ) 对棉铃虫具有极高抗性 , 虫取食量极
少 , 仅咬食几个小洞 , 叶片几乎不受伤害 , 害虫
个体极小 , 3 d内死亡 , 校正死亡率 90%以上 ,
与 C ry1A c基因在毛白杨〔11〕和烟草〔12〕中的表达一
样具有很强毒性 , 说明该基因在菊花中表达的蛋
白质是比较稳定的。另 1株 (序号 2) 对棉铃虫
具有高抗性 , 叶片有轻微损伤 , 棉铃虫吞食后 ,
爬动少 , 静息时间长 , 5 d内死亡 , 校正死亡率
图 2　菊花抗性植株的 PCR检测
M. 表示Φx174 HaeⅢ酶切 DNA分子量标准 ; 1: 未转
化的植株 , 即阴性对照 ; 2: 阳性对照 ; 3～4: 为
假转化体 ; 5～8: 转基因植株。
Fig. 2　PCR analysis of kanamycin resistant chrysanthemum plants
M: Φx174 HaeⅢ digested DNA marker; 1: non2transgenic
p lant; 2: DNA from p lasm id; 3 - 4: DNA from escaped p lants;
5 - 8: four transgenic p lants with amp lified fragment of 768 bp.
图 3　菊花转基因植株的 Southern杂交检测
M. λH indⅢ酶切 DNA分子量标准 ; 1为阴性对照 ;
2～7为转基因植株。
F ig. 3　Southern blot iden tif ica tion of tran sgen ic
chrysan them um plan ts
M: λH indⅢ digested DNA marker; 1: non2transgenic p lant
as negative control; 2 - 7: DNA from transformants.
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80%以上。另 3株 (序号 5, 6, 7) 对棉铃虫抗性较明显 , 虫体取食较多 , 对叶片伤害较重 , 甚至自
残 , 5 d内死亡 , 校正死亡率 4417% ～6019% (图版 , B和 C)。统计分析结果见表 1 ( P > 0101)。
表 1　转基因菊花植株叶片的毒力测定
Table 1　Tox ic ity test of leaves from tran sgen ic chrysan them um plan ts
转基因植株
Plant lines
校正死亡率
Corrected mortality( % )
蜕皮指数
Exuviation index
毒力
Toxicity
幼虫开始体重
O riginal mass(mg)
5 d后成活幼虫平均体重
Average mass of survivals after 5 d (mg)
2 8318 ±216 b 113 ±011 b 717 215 717
3 9110 ±310 a 116 ±013 a 815 215 010
4 9215 ±115 a 117 ±013 a 813 215 010
5 6019 ±217 c 017 ±013 c 414 215 2513
6 4417 ±115 c 015 ±013 c 214 215 3110
7 5517 ±415 c 016 ±012 c 019 215 2813
1 (对照 Control) 0 310 010 215 4314
3　讨论
野生型 (W T) B t含有较多 AT碱基和 ATTTA 重复序列 , 造成基因在高等植物中表达含量低
下〔13〕。因此 , 本试验用经过人工改造后合成的 C ry1A c基因 , 改变了野生 C ry1A c基因内富含 AT的结
构 , 并修改了许多隐含终止子。通过本试验 , 成功获得了抗虫转基因菊花植株 , 其对棉铃虫的校正死
亡率为 4417% ～9215% , 这与转 C ry1A c基因获得的烟草〔12〕、棉花〔14〕等抗虫转基因植株对棉铃虫的
杀虫效果一致。
在外植体的共培养过程中涉及到的因素很多 , 如培养基的盐浓度、pH值、温度、暗培养的时间
等。在共培养中降低盐含量 (1 /2MS, 即大量元素减半 ) 有利于提高抗性芽的数量 ; 不使用细胞分裂
素 (如 BA、TDZ等 ) 和较低的 pH值有利于 T2DNA的转移〔15〕。采用 2～3 d的暗培养 , 防止头孢霉
素分解 , 使之能在最先的选择阶段抑制农杆菌 ; 前期用较高浓度的抗生素 , 可抑制农杆菌和加强筛
选 ; 后期用较低浓度的抗生素 , 则能减轻其对芽形成的抑制作用。同时 23℃优于 19℃, 验证了 “农
杆菌具最强侵染力的生长温度并不是其最适生长温度 ”的观点〔4, 15〕。在低温时使农杆菌的生长速度减
慢 , 有效地降低农杆菌的群体数量。
在 126株抗卡那霉素植株中 , 仅有 15株扩增出特异的 PCR谱带 , 其中仅 6株在斑点杂交和
Southern杂交中呈阳性反应 , 转化效率只有 418% , 可能是在转化过程中出现了大量假转化体。另外 ,
T2DNA进入细胞后并没有整合到受体基因组中 , 而是以游离状态存在 , 导致 PCR的结果呈阳性反
应〔15〕。
此次利用根癌农杆菌介导法获得了转 C ry1Ac基因的菊花抗虫转基因植株 , 但转化效率较低 , 还
需进行大量转化以期获得更多的菊花抗虫转基因植株。对于转基因菊花植株中外源基因的表达、遗传
稳定性、遗传效应等还要作进一步的研究。
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图版说明 : A. 菊花转 B t的 Cry1A c基因再生抗性芽的产生 ; B. 转基因菊花植株对棉铃虫的抗性盆栽试验 (B21. 对照 ; B22. 转基因
植株 ) ; C. 转基因菊花植株对棉铃虫的抗性平皿试验 (C21. 对照 ; C22和 C24. 不同转基因植株 )。
Explana tion of pla tes: A. Regeneration of Kanr chrysanthemum shoots transformed with B t (B acillus thuringensis) C ry1A c gene; B. B ioassay
of transgenic chrysanthemum p lants to cotton bollworm at 5 d in pot culture (B21. Un2transformed p lant as negative control; B22. Transgenic
p lants) ; C. B ioassay of transgenic chrysanthemum p lants to cotton bollworm at 5 d (C21. Un2transformed p lant as negative control; C22 and C2
4. Transgenic leaves) .
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