全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(7)：1047—1052
Aeta Honieulturae Sinica
杜仲四倍体的诱导与鉴定
张海凤 ，郭宝林 ，张成合 ，杨俊霞 ，郭 婧。，陈新华
( 河北农业大学林学院，河北保定 071001；：河北农业大学园艺学院，河北保定 071001； 河北农业大学农学院，河
北保定 071001)
摘 要：以杜仲籽苗为材料，采用秋水仙素溶液处理生长点的诱变方法和茎尖细胞染色体数检测及
DNA相对含量测定的倍性鉴定方法，研究了秋水仙素浓度和处理时间的诱变效果。结果表明，除0．05％秋
水仙素处理48 h外，其它浓度 (0．1％，0．2％，0．4％)均以处理 12 h效果最好，变异株率在 43．3％ ～
63．3％，最佳处理组合为0．1％秋水仙素处理生长点 12 h，变异株率和四倍体株率分别为 63．3％和36．7％。
在获得的 148个变异株中，染色体计数表明47株为四倍体 (2n=4x=68)，占31．76％；染色体计数结果进
一 步被流式细胞仪分析验证。四倍体植株表现出多倍体特征，叶片变厚，叶面积增大，叶形指数减小 ，保
卫细胞增大，单位面积气孑L数减少，叶绿体数明显增多。
关键词：杜仲；四倍体诱导；倍性鉴定；秋水仙素
中图分类号：S 567．1 9 文献标识码：A 文章编号：0513．353X (2008)07．1047-06
Induction and Identification of Tetraploids in Eucommia ulmoides Oliv．
ZHANG Hai—feng’
，
GUO Bao—lin’
， ZHANG Cheng—he ，YANG Jun—xia’，GUO Jing ，and CHEN Xin．hua
( College ofForestry，Agricultural University ofHebei，Baoding，Hebei 071001，China； Colege ofHorticulture，Agricultural U-
niversity of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China； College of Agronomy，Agricultural E，n ￡y of Hebei，Baoding，Hebei
071001，China)
Abstract：Stem primodia of Eucommia ulmoides 0liv．seedlings were treated with different eoneentra．
tions of colchicine solution at diferent stages in order to figure out the best inducing method and obtain tetra—
ploids．The results showed that．apart from 0．05％ colchicine solution for 48 h。the treatments(0．1％ 。
0．2％ or 0．4％ )were all suitable for l2 h．in which the rates of mutants with morphological characteristics
varied from 43．3％ to 63．3％ ．the optimum treatment combination was 0．1％ colchicine solution for 12 h．
and the rates of vatiant plants and tetraploid plants were 63．3％ and 36．7％ ．respectively．Th e results of
chromosome counts indicated that 47 plants were tetraploid plants(2n=4x=68)，taking up about 3 1．76％ a-
mong the 148 variant plants．This result was consistent with that analyzed with the‘Flow Cytometr,~’method．
rhe plants showed the general characteristics of tetraploids，such as thicker leaf，smaller leaf index，larger
guard cels．1ess stomata per unit area and more chloroplasts in guard cells．
Key words：Eucommia ulmoides Oliv．；tetraploid induction：chromosome identifcation；colchicine
杜仲 (Eucommia ulmoides Oliv．)属杜仲科杜仲属，为我国特有的药用经济林树种。杜仲皮、叶、
果除药用外，均含有杜仲胶，既是贵重的中药材，又是我国重要的橡胶资源。杜仲采用多倍体育种，
染色体加倍，使形态和生理方面发生很大变化，这可能是较大幅度地提高杜仲皮、叶含胶量和药用成
分含量以及植株产叶量最具希望的途径之一。关于杜仲多倍体诱导的研究国外尚未见报道。国内，毕
春侠等 (1996)利用秋水仙素诱变处理过幼苗生长点；王跃华 (2006)用秋水仙素浸泡过杜仲种子；
收稿日期：2008—02一Ol；修回日期：2008—05—22
基金项目：河北省林业科学基金资助项 目 (0518286)
通讯作者 Author for corespondence(E-mail：guobaolinl012@163．corn)
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园 艺 学 报 35卷
高鹏等 (2004)用秋水仙素处理过杜仲花粉。但上述研究中均未见对诱变植株的细胞学、DNA含量
及形态特征的系统鉴定。
本研究以杜仲籽苗为材料、以秋水仙素为诱变剂，研究杜仲籽苗染色体加倍的有效处理时期、处
理浓度和处理时间的组合，旨在获得杜仲多倍体植株，为开展杜仲多倍体育种奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
材料为河北农业大学标本园栽植的杜仲植株，编号为95一l。于2006年 l1月采集当年的成熟种
子，沙藏50 d后播种于日光温室，出苗后通过间苗保留生长一致的幼苗，处理前按常规管理。
1．2 方法
1．2．1 诱变处理 当幼苗生长至子叶展平时，先去掉生长点边缘的小真叶，然后将蘸有秋水仙素溶
液的脱脂棉小球放在生长点上，每天早 8：00和晚6：00各滴秋水仙素溶液 1次，滴后盖上塑料薄膜
和遮阳网，保湿和防止强光灼烧幼苗。秋水仙素处理浓度分别为0．05％、0．1％、0．2％和0．4％ (秋
水仙素用冷水配置)，处理时间分别为l2、24和48 h(从第 1次滴液处理开始计算处理时间，到预定
时间后，去除脱脂棉小球，并用清水冲洗，以解除药液作用)，共 l2个处理组合，每处理组合 30株
幼苗，以清水处理的幼苗作对照。
1．2．2 形态学观察 以正常二倍体植株为对照，主要观测变异株的株高、茎粗、节间距、叶型、叶
色、叶边缘锯齿的多少和深浅、叶片的大小等。
1．2．3 叶面积、叶片厚度、保卫细胞大小、气孔密度、叶绿体数的鉴定 采用 LI-3000A便携式叶面
积分析仪测定植株中部成熟叶片的叶面积；叶片厚度采用石蜡切片法，显微镜下用显微测微尺测定；
撕取叶片下表皮，置载玻片上，l％I．KI染色3 min，在40倍显微镜下用直线显微测微尺测量保卫细
胞的大小，网格显微测微尺测量单位面积的气孔密度 (张秀芳 等，2002)；计数 l0个保卫细胞的叶
绿体数，求其平均数。
1．2．4 倍性鉴定 (1)染色体数鉴定：上午 8：30左右，取 3～5 mm的茎尖，置2．0 mmol·L 的
8一羟基喹啉液中，在20 c下预处理2 h，然后用卡诺固定液 (95％乙醇：冰醋酸 =3：1)固定 24 h，
转入70％乙醇保存。常规压片法制片 (张蜀宁 等，2007)，PI HCH染色液 (丙酸一铁一水合三氯乙
醛一苏木精)染色，Olympus BH-2光学显微镜观察并照相。(2)叶片细胞 DNA相对含量测定：采用
张俊娥等 (2003)的方法，用PA流式细胞仪测定变异植株和正常二倍体植株细胞 DNA的相对含量
(用 PartecDPAC软件分析)。
1．2．5 统计分析 数据的统计分析采用 SAS软件处理。
2 结果与分析
2．1 诱变效果
杜仲籽苗经诱变处理后，生长受到抑制，子叶肥大、浓绿，茎尖生长点迟迟不能露头。约经过
3～4周后有些幼苗最终能长出新芽和真叶，有些幼苗则干化死亡。对存活的植株率及存活植株的性状
表现进行调查统计。将真叶叶片明显变圆、变厚、变绿、变皱，同时叶片下表皮保卫细胞变大、单位
面积气孔数减少、保卫细胞叶绿体数增多的植株记为变异株。
从表 l中可以看出，随着秋水仙素浓度升高和处理时间延长，植株死亡率呈上升趋势；从诱变效
果看，0．05％ ～0．4％的秋水仙素对杜仲幼苗生长点的诱导均有效，低浓度 (0．05％)随着处理时间
的延长诱变率提高，高浓度 (0．1％，0．2％，0．4％)则相反，在 l2个处理组合中，尤以0．1％处理
12 h的变异株率和四倍体株率最高，分别为63．3％和36．7％，为最佳处理组合。
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注：同一浓度内不同处理时间差异显著性检验采用新复极差法。小写字母表示0．05水平．相同字母表示差异不显著。
Note：The data of the sanle treatment concentration difference treatment time were tested with Duncan’S method．The small letter indicates
0．05 leve1．the same letters indicate nO significant diference．
2．2 倍性鉴定
2．2．1 染色体数鉴定 采用茎尖压片法，对选出的 148个变异株及其二倍体对照株分别进行了染色
体数鉴定。结果表明，二倍体植株 (对照)的染色体数为34条 (图版，a)。在 148个变异株中 (表
2)，有47株染色体数为68条，为四倍体 (图版，b)，其中每个处理组合的四倍体株数见表 1；有9l
株为混倍体，其茎尖细胞的染色体数不等，既有 68条的又有34条的，两者的比例不定；另外 l0株
染色体数为34条，为二倍体 (表 2)。
表2 变异株茎尖细胞的染色体数
Table 2 Chromosome numbers in shoot tip cells of Eucommia ulmoides vaHan~
2．2．2 DNA含量分析 为进一步确定加倍植株的倍性纯合性，采用流式细胞仪和 PartecDPAC软件
对二倍体和部分经染色体数鉴定2n=68的植株进行了细胞 DNA含量测定和分析。结果表明，二倍体
植株仅在相对荧光强度值为50的位置上出现 1个单峰 (图 1，a)，而测定的3个染色体数为 2n=68
的变异植株均在约 100的位置上出现 1个单峰 (图1，b、C、d)，后者约为前者的2倍，这表明染色
体加倍的植株其细胞中的 DNA含量也相应增加了一倍。由图 1，b、C、d还可以看到，3个染色体数
为2n=68的变异植株除 100的位置上的主峰外，其他位置上未见有明显的单峰，这表明在检测的
100多个茎尖细胞中几乎每个细胞的基因组都进行了加倍，即由2C变成了4C。这与上面染色体数的
鉴定结果是一致的。
2．2．3 二倍体、四倍体植株的形态特征比较 由图版 C～f和表 3可见，四倍体植株生长健壮，叶片
宽度、厚度和叶面积均大于二倍体，叶片长度和叶形指数则比二倍体小；四倍体叶片宽度、叶片厚度
和叶形指数与二倍体间差异均达极显著水平。此外，还观察到四倍体植株的叶片锯齿明显，裂刻比二
倍体深，且锯齿数量多于二倍体；四倍体叶片表面蜡质层厚，亮度强于二倍体叶片。
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o 100 200 0 100 200 0 100
2n = 2x= 34
相对荧 光强 度 R elativ e fluorcsccncc
图 1 二 倍体 和 四倍体杜仲植 株 D N A 含量 分 布 图
a ． 二 倍体植株 ； b、 C 、 d． 四倍体植株 。
F ig． 1 T he D N A distribution ofdiploid and tetraploid plants
a ． D iploid plant； b， C and d． T etraploid plan ts ．
a
，
C
田
100
80
60
4 0
20
O
O 100 200
图版说 明 ： a ． 二 倍体细胞 ； b． 四倍体细胞 ； C ． 二 倍体叶片 ； d． 四倍体叶片 ； e ． 二 倍体植株 ； f． 四倍体植株 。
E xplanation ofplates： a ． D iploid cell： b． T etraploid cell； c ． D iploid leaf； d． T etraploid leaf； e ． D iploidplant； f． T etraploid plan
表 3 二 倍体和 四 倍体 杜仲 叶片形 状 比较
T able 3 C om pariso ns ofleafcharacters betw een diploid and tetraploid plants
注 ： 方差分析采用邓肯氏新复极差检测法 。 大写字母表示 0． 01 水平 ， 小写 字母 表示 0． 05 水平 ， 相同字母表示差异不显 著 。
Note ： T he data w ere tested w ith D uncan ’S m ethod． T he capitalnu m bers indicate 0． 0l level． the sm al letters indicate 0． 05 level．
1etters indicate no sign ifican tdiference ． T he sam e below ．
下表 同。
the sam e
∞ ∞ ∞ ∞ 加 O
∞ ∞ ∞ ∞ 加 O
∞j0 —0j= _0 _—_摹0 一
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2．2．4 二倍体、四倍体植株的保卫细胞大小、密度及叶绿体数的比较 由表4可见，四倍体植株叶
片的保卫细胞长和宽都明显大于二倍体，气孑L密度明显小于二倍体，保卫细胞内叶绿体数明显增多，
约为二倍体植株的2倍。
表4 二倍体和四倍体气孔保卫细胞及叶绿体比较
Table 4 Comparisons of stomata guard cells and chloroplasts between diploid and tetroploid plants
3 讨论
人工诱导多倍体是获得植物新类型或新种质的重要途径之一。迄今，人工诱导多倍体的最有效药
剂是秋水仙素，诱导方法主要有浸种法、滴生长点法、组织培养等多种方法。本研究采用的方法是将
通过休眠的杜仲种子播在日光温室中，当籽苗的子叶展平时，先去掉生长点边缘的小真叶，然后将蘸
有秋水仙素溶液的脱脂棉小球放在生长点上进行保湿处理。试验表明，这种处理方法适于杜仲的多倍
体诱导，较浸种处理后在 MS培养基上培养的方法 (王跃华，2006)操作简便，且诱变效果好。
经秋水仙素溶液处理的籽苗一般表现生长缓慢、叶片肥大、真叶皱缩等特征，这主要是秋水仙素
溶液的毒害作用。本研究中得出秋水仙素处理杜仲籽苗生长点的最佳处理组合，变异株的频率因处理
的浓度和持续时间而异，低浓度下随着处理时间的延长诱变率提高，高浓度下随着处理时间的延长诱
变率降低。除0．05％秋水仙素处理48 h外，其他 (0．1％，0．2％，0．4％)均是处理 12 h效果最好，
变异株频率为43．3％ ～63．3％。
变异株是指籽苗经诱变处理后，其叶形、叶色、叶厚及叶片下表皮的保卫细胞大小、密度和保卫
细胞内的叶绿体数都明显与二倍体不同的植株。但这些变异株不一定都能生长发育成为四倍体植株，
而多数为混倍体，这是由于在诱变过程中，如果只有生长点分生组织的某一层细胞发生了加倍，就会
形成 ‘2—2—4’、‘4—2—2’、‘2—4—2’等倍性嵌合体，第 1种情况只是中柱等组织将可能成为多
倍体，第2种情况只是表皮层等组织将可能成为多倍体，第3种情况主要涉及生殖器官，可形成多倍
体的孢母细胞。因此诱变的当代植株实际上绝大多数都应为混倍体，本研究中混倍体植株率约占
61．49％。在变异株中，除混倍体和四倍体外，有些还可能恢复为二倍体，如本研究中二倍体株率约
占6．76％，这是由于发生加倍的细胞较少，在生长分裂过程中竞争不过正常的二倍体细胞，最终多
倍体细胞消失所致。
鉴定变异株是否发生了倍性变异，较可靠的鉴定方法，一是观察花粉粒的大小和形态，四倍体植
株的花粉 (2n)较二倍体植株花粉 (n)大，萌发孑L往往增多，如苹果 n花粉的萌发孑L为 3个，2n
花粉的萌发孑L多为4个 (石荫坪和束怀瑞，1998)；二是鉴定茎尖细胞的染色体数，这是最为可靠的
方法，对木本植物尤为适合；三是利用流式细胞仪检测细胞的DNA含量，它不仅可准确地测定细胞
是否进行了染色体加倍，而且还可测定染色体加倍和未加倍的细胞数，从而确定是否为倍性嵌合体，
因此近年来越来越多地被采用 (Costich，1993；Zhang et a1．，1994；马爱红 等，2005；杨晓伶 等，
2006；范国强 等，2007；张振超 等，2007)。本研究在茎尖染色体数鉴定的基础上，采用 PA流式
细胞仪和PartecDPAC软件分析杜仲叶片细胞的DNA相对含量，结果表明，在测定的几株茎尖细胞染
色体2n=4x：68的变异株中，细胞 DNA的相对含量均为二倍体植株的2倍，而且在检测的细胞中
4C细胞率几乎为 100％，这表明经秋水仙素溶液处理籽苗生长点形成的植株 (枝条)，其细胞的倍性
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基本一致，同时也进一步说明秋水仙素溶液处理籽苗生长点的方法非常适宜杜仲多倍体的诱导。本试
验对诱变植株的细胞学、DNA含量及形态特征进行系统鉴定，获得了杜仲四倍体植株，在以往研究
中均未见报道。
植物由二倍体诱变为四倍体后，一般表现为生长势和抗逆性增强、营养体和花果等器官变大，同
时由于基因剂量的增加，某些营养成分或次生代谢产物含量也明显增多。虽然诱变获得的四倍体杜仲
植株生长势强，叶面积较二倍体有所增加，但因植株幼小尚不能测定其皮、叶、果的杜仲胶和药用成
分的含量，本研究预计四倍体将会提高杜仲胶及药用成分的含量。
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