全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 891 - 894
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 01 - 02; 修回日期 : 2008 - 04 - 23
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30571309) ; 教育部新世纪优秀人才支持计划项目 (NCET20520138)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: dongleah@ yahoo1com1cn)
牡丹 ACC氧化酶基因 cDNA克隆及全序列分析
周　琳 , 董　丽 3
(北京林业大学园林学院 , 国家花卉工程技术研究中心 , 北京 100083)
摘 　要 : 以牡丹品种 ‘洛阳红 ’ ( Paeonia suffruticosa‘Luoyang Hong’) 花瓣为材料 , 用 CTAB法提取总
RNA, 根据已报道的 ACC氧化酶 (12am inocyclop ropane212carboxylic acid oxidase, ACO ) 保守氨基酸序列设
计简并引物 , 通过 RT2PCR扩增得到 1条 821 bp的牡丹 ACO基因同源片段。利用该已知中间序列 , 通过快
速扩增 cDNA末端技术 (Race) 及序列拼接 , 最终得到该基因 cDNA全长序列 , 命名为 Ps2ACO1, GenBank
登录号为 DQ337251。分析结果表明 , Ps2ACO1 cDNA全长 1 221 bp, 包含一个 939 bp的开放读码框 , 5′非
翻译区长 65 bp, 3′非翻译区长 217 bp, 编码产物为含有 312个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列与烟草、
苹果、桃等植物的 ACO同源性都达 80%以上。
关键词 : 牡丹 ; ACC氧化酶 ; RT2PCR; RACE; 序列分析
中图分类号 : S 685111　　文献标识号 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620891204
C lon ing and Sequence Ana lysis of 12Am inocyclopropane212Carboxylic Ac id
O x ida se Gene cD NA from Tree Peony
ZHOU L in and DONG L i3
(College of Landscape A rchitecture, B eijing Forestry U niversity, N ationa l F low er Engineering Technology Research Cen ter, B eijing
100083, Ch ina)
Abstract: Total RNA was extracted from petals of‘Luoyang Hong’tree peony ( Paeon ia suffru ticosa )
with CTAB method, and a pair of degenerated p rimer was designed based on the reported conserved am ino
acid sequence of 12am inocyclop ropane212carboxylic acid oxidase (ACO ). A cDNA fragment with 821 bp was
amp lified by RT2PCR, and then full length of it, named Ps2ACO1 ( GenBank No. DQ337251) , was obtained
by RACE and sequence sp liced. Sequence analysis indicated that Ps2ACO1 is 1 221 bp in full length and con2
tains a 939 bp open reading frame flanking by a 65 bp 5′2non2translation region and a 217 bp 3′2non2transla2
tion region, and encodes a 312 p redicated am ino acid residues which shared more than 80% homology with
ACO of tobacco, app le, peach and so on.
Key words: tree peony; ACC oxidase; RT2PCR; RACE; sequence analysis
牡丹 ( Paeon ia suffru ticosa) 自然花期集中、单朵花花期短、采后贮运保鲜技术不过关 , 致使其切
花产业化生产一直受到严重制约。目前已发现牡丹切花乙烯的大量产生是促使其衰老的重要生理原因
之一 (史国安 等 , 1997, 1999) , 而牡丹切花开花衰老与乙烯的关系却非常复杂 ( J ia et al. , 2006;
Zhou et al. , 2006)。自乙烯生物合成途径揭示以来 , 香石竹 ( Park et al. , 1992; van A ltvorst & Bovy,
1995)、月季 (W ang et al. , 2004)、兰花 (OpiNeil et al. , 1993) 等多种观赏植物的乙烯生物合成关
键基因 ACS和 ACO 相继被克隆。作者以类似乙烯跃变型品种 ‘洛阳红 ’为试材 , 利用 RT2PCR及
RACE技术首次成功克隆了牡丹 ACC氧化酶基因家族的一个成员 Ps2ACO1, 并对其进行序列分析 , 为
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全面了解乙烯与牡丹切花开花衰老的关系 , 揭示乙烯在其采后开花和衰老进程中的作用模式和调控机
制奠定基础。
1　材料与方法
‘洛阳红 ’牡丹切花取自洛阳国际牡丹园。取开花指数为 5级 (郭闻文 等 , 2004) 的切花花瓣 ,
锡箔纸包好后液氮速冻 , 置于 - 70 ℃冰箱备用。试验所用的大肠杆菌菌株为 E1coli DH5α (本实验室
保存 ) , 克隆载体为 pGEM 2T easy (购自北京天根生化科技有限公司 )。M 2MLV 反转录酶和 T4 DNA
连接酶分别购自 Promega和大连宝生物公司。引物合成及 DNA序列测定委托北京奥科生物公司完成。
花瓣总 RNA提取采用 CTAB法 (孟丽 等 , 2006)。根据已报道的 ACO保守氨基酸序列设计一对
简并引物 P1: C (CG) A (AG) AA ( TC) TGGGG ( TC) TT( GC) T(AT) ( TC) GAG, P2: TC (AG) AA ( TGC)
C ( TG) ( TC) GG( TC) TC ( TC) TTiG ( i: 次黄嘌呤 ) , 以 RNA反转录产物 cDNA第 1链为模板 , 95 ℃
预变性 4 m in, 然后 95 ℃变性 1 m in, 51 ℃退火 40 s, 72 ℃延伸 1 m in, 共 30个循环 , 最后 72 ℃延
伸 7 m in进行 PCR扩增。凝胶回收与预期片段大小一致的泳带 , 连接克隆载体并转化感受态细胞 , 通
过蓝白斑筛选及质粒酶切鉴定后 , 进行序列测定。根据所得的中间序列设计特异性引物 P3: AG2
CAGCTCCTCGGCCAGTGTCTCT, P4: GATGCACCGTGTGATCGCTCAAAC, 按照试剂盒 SMARTTM RACE
cDNA Amp lification Kit说明书进行 RACE扩增 , 退火温度为 59 ℃。产物克隆及测序如上所述。测序
结果在 GenBank中进行 B last分析。利用 DNAMAN软件进行多序列比对及同源性分析。
2　结果与分析
211　牡丹 ACO 基因同源片段的克隆
以盛开切花花瓣的 cDNA为模板 , 利用简并引物 P1和 P2进行 PCR扩增 , 得到 821 bp、编码 273
个氨基酸的预期片段 (图 1, A )。B last分析发现 , 该核苷酸序列与许多植物 ACO同源性都在 80%左
右 , 其中与苹果 ACO (AB086888) 同源性最高 , 达 86% , 初步推断为牡丹 ACO基因的同源片段。
212　牡丹 Ps2ACO 1基因 cD NA全长的获得及序列分析
凝胶电泳分析 RACE2PCR产物 (图 1, B) , 并对其测序的结果表明 , 3′端序列为 517 bp, 5′端为
487 bp, B last同源性检索后推断所得片段即为目的基因末端序列。
图 1　牡丹 ACO 基因 RT2PCR ( A) 及 RACE ( B) 扩增电泳图
F ig. 1　Agrose gel electrophoresis ana lysis of ACO gene cD NA fragm en ts
by RT2PCR ( A) and RACE ( B) in tree peony
将 RT2PCR及 RACE2PCR扩增片段拼接 , 最终获得长度为 1 221 bp的牡丹 ACO cDNA 全长序列
(图 2) , 命名为 Ps2ACO1, GenBank登录号为 DQ337251。利用 NCB I提供的 ORF Finder进行分析发
现 , 该 cDNA全长包含有一个 939 bp的开放读码框和一个 poly (A) 尾巴 , 5′非翻译区长 65 bp, 3′非
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　6期 周 　琳等 : 牡丹 ACC氧化酶基因 cDNA克隆及全序列分析 　
翻译区长 217 bp , 编码 312个氨基酸 , 与在其他植物中分离到的 ACO基因全长一般编码 306～326个
氨基酸的结果 ( Pogson et al. , 1995) 相一致。对其编码的氨基酸序列进行分析发现 , 该基因包含目
前已知的 ACO存在的所有保守区及保守的 9个氨基酸残基 (Lasserre et al. , 1996)。 ProtParam ( ht2
tp: / / au1expasy1org/ tools/p rotparam1htm l) 预测该蛋白的分子量是 35122 kD, 理论等电点为 5132。
图 2　Ps2ACO 1基因 cD NA全长推定的氨基酸序列
阴影区表示 ACO的保守区 , 方框区为在所有二价铁离子 /抗坏血酸依赖型双加氧酶家族成员中
保守存在的 9个氨基酸残基。3 表示终止子。
F ig. 2　D educed am ino ac id sequence of the cD NA full2length encod ing Ps2ACO 1 gene
Several conserved regions observed in all ACC oxidase are shaded, and the nine am ino acid residues
in the boxes are conserved in all members of the Fe2 + ascorbate fam ily of
dioxygenases. 3 denotes the term ination codon.
不同物种的 ACO在蛋白质水平上的同源性一般在 80%左右。对此序列进行 B lastp分析后 , 选取
与牡丹 ACO 相近的 8个物种的 ACO蛋白氨基酸序列进行同源性分析发现 , Ps2ACO1编码的氨基酸序
列与烟草、矮牵牛、山茶、柿子、苹果、桃、柑橘、番木瓜的 ACO同源性都在 80%以上 , 表明 ACO
氨基酸序列具有较强的保守性 , 同时也证明本试验所克隆的 cDNA序列即为牡丹 ACO 基因家族中的
一个成员。
氨基酸同源性分析见图 3。
为了探明牡丹切花开放衰老进程中 ACO 基因是否存在调控作用 , 为其采后保鲜技术的开发、乃
至转基因育种提供理论依据 , 本试验利用 RT2PCR及 RACE技术 , 从类似乙烯跃变型品种 ‘洛阳红 ’
盛开切花的花瓣中克隆了 1个牡丹 ACO基因 Ps2ACO1。核苷酸及其编码的氨基酸序列分析表明 , 该基
因属于牡丹 ACO多基因家族中的 1个成员。研究发现 , 不同家族成员参与调控不同因子 (包括发育
信号、植物激素和环境刺激等 ) 诱导的乙烯反应 ( Zarembinski & Theologis, 1997)。
因此 , 该研究结果为进一步研究牡丹 ACO 家族成员及各自在牡丹切花衰老过程中的调控机理奠
定了良好的基础。
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图 3　不同植物 ACO 基因氨基酸序列同源性分析
F ig. 3　Hom ology ana lysis of pred icted am ino ac id sequences of ACO genes from d ifferen t plan ts
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