全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (4) : 869～872
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 01 - 26; 修回日期 : 2006 - 06 - 20
基金项目 : 贵州省 ‘十一五’蔬菜攻关项目 (黔科合 NY字 2006 - 3001)3 通讯作者 Author for correspondence
茄子青枯病抗性基因的遗传分析及其 AFL P标记
李　猛 1 　王永清 2 　田时炳 2 　罗章勇 2 　王小佳 13
(1 西南大学园艺园林学院 , 重庆 400716; 2 重庆市农业科学研究所 , 重庆 400055)
摘 　要 : 以茄子高感青枯病品种 ‘三月茄 ’与高抗品种 ‘S69’的 F1、F2为材料 , 对青枯病抗性遗传
进行了分析 , 同时开展了与抗性基因连锁的 AFLP标记鉴定。结果表明 : ‘S69’对青枯病的抗病性属于不
完全隐性遗传 , 感病性属于不完全显性 ; 抗性由 1～2对基因控制。对 86个 F2单株 AFLP分析 , 鉴定出 1
个与 ‘S69’抗性基因连锁的 AFLP标记 39A980 (该引物组合为 E2ACC /M 2CTG) , 该标记与抗性基因间的交
换值为 4165% , 遗传距离为 419 cM。
关键词 : 茄子 ; 青枯病 ; 抗性遗传 ; AFLP标记
中图分类号 : S 64115　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0420869204
Genetic Ana lysis of Resistance to Bacter ia l W ilt and Iden tif ica tion of an
A ssoc ia ted AFL P M arker in Eggplan t ( Solanum m elongena )
L iMeng1 , W ang Yongqing2 , Tian Shibing2 , Luo Zhangyong2 , and W ang Xiaojia13
(1 College of Horticulture and Landscape, Southw est U niversity, Chongqing 400716, Ch ina; 2 Chongqing Institu te of A gricultural
Sciences, Chongqing 400055, Ch ina)
Abstract: F1 and F2 populations, derived from the cross between bacterialwilt highly suscep tible cultivar
‘Sanyueqie’and highly resistant Indonesian cultivar‘S69’, were used for investigation of the inheritance of
resistance to bacteria wilt and for identification of associated AFLP markers in eggp lant. The results showed
that the resistance to bacterial wilt was incomp letely recessive, otherwise suscep tibility was incomp letely dom i2
nant, which was controlled by 1 - 2 genes. By using a combination of the amp lified fragment length polymor2
phism (AFLP) technique and bulked segregant analysis (BSA ) , an AFLP marker, named 39A980 was identi2
fied with the p rimer combination E2ACC /M 2CTG to be linked to the major resistant gene. The crossing2over
value and the genetic distance between the resistant gene and‘39A980 ’were estimated as 4165% and 419 cM
respectively by analyzing a set of 86 F2 p lants.
Key words: Solanum m elongena; Bacterial wilt; Inheritance of resistance; AFLP markers
1　目的、材料与方法
青枯病是由青枯病菌 (R alston ia solanacearum ) 引起的细菌性土传病害 , 是茄果类蔬菜的主要病
害之一 , 在南方高热高湿地区发病率极高。近年来 , 国内外对茄子抗青枯病研究越来越多 , 有关茄子
青枯病抗性的遗传理论说法不一 , 各研究者应用不同抗性材料得出不同、甚至相反的结果。本研究利
用 ‘S69’为抗源 , 开展了茄子青枯病抗性遗传分析 , 并鉴定与抗性基因连锁的 AFLP标记 , 为茄子
抗青枯病和标记辅助选择育种奠定基础。
111　试验材料
抗性亲本为来自印度尼西亚的茄子品种 ‘S69’, 感病亲本为重庆地方品种 ‘三月茄 ’。试验以双
亲及 F1和 F2为材料。病原菌由重庆市农业科学研究所从青枯病病圃中茄子重病株上分离而来。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
112　抗性鉴定方法
幼苗 5片真叶时采用伤根浸根法接种 , 菌液接种浓度为 3 ×108 cfu /mL。双亲和 F1各接种 120株 ,
F2接种 396株。然后定植在营养钵中并置于玻璃温室内培养鉴定 , 温度控制在 25℃左右 , 空气湿度
90%。定植后分别于 7、14、21、28 d调查各世代青枯病发病情况。病情分级和抗性划分按文献 〔1、
2〕提供的标准执行 , 分级标准为 0级 : 不发病 ; 1级 : 1片叶感病 ; 2级 : 2～3片叶感病 ; 3级 : 除
顶端 2～3片叶外 , 其余叶片均感病 ; 4级 : 所有叶片都感病 ; 5级 : 植株死亡。抗性划分标准为抗病
(R) : D I < 10; 中抗 : (MR) D I 10～20; 中感 (MS) : D I 21～40; 感病 ( S) : D I > 40。
113　D NA提取及抗、感病 D NA池的构建
在抗性接种鉴定前采集各幼苗嫩叶提取总 DNA, 采用略做修改的 CTAB微量制备法〔3〕。结合抗
性鉴定结果 , 在 F2群体中分别选取 8个最早枯萎死亡和未感病的单株的 DNA等量混和 , 构建感病和
抗病 DNA池。同时 , 双亲 DNA池也由随机选择的 8个单株 DNA混和而成。
114　AFL P分析
AFLP试剂盒购自北京鼎国生物工程有限公司。两种酶为 M seⅠ和 EcoRⅠ, 64个选择性引物组合
由 M 2CAA, 2CAC, 2CAG, 2CAT, 2CTA , 2CTC, 2CTG, 2CTT和 E2AAC , 2AAG, 2ACA, 2ACT, 2ACC,2ACG, 2AGC, 2AGG组合而成。酶切、接头连接、预扩增和选择性扩增均按照试剂盒附带方法进行。
扩增反应在 PE700型 PCR仪上进行。60 W恒定功率条件下 , 415%聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 银染显带。
115　连锁分析
在 F2分离群体中 , 选择 48个高感单株和 38个高抗单株 , 用鉴定出的多态性引物组合 ( E2ACC /
M 2CTG) 检测 86个单株的特征带的有无。将 F2群体植株抗性鉴定结果与相应的 AFLP标记编码 (高
抗和有该特征带编码为 A, 高感和无该特征带编码为 B ) 之后 , 应用 Mapmaker 310软件计算连锁距
离 , 临界 LOD值为 310, 用 Kosambi函数将重组率转换成图距单位厘摩 ( cM )。
2　结果分析与讨论
211　青枯病抗性的遗传
接种后 7 d, 各世代都陆续发病 , 8～21 d发病进入高峰期 , 28 d后 , 发病趋于稳定。因此 , 本
研究都以接种后 28 d的调查数据为基础 (表 1)。
表 1　各世代在接种后 28 d青枯病发病情况
Table 1　Bacter ia l w ilt resistance eva lua tion a t 28 days after inocula tion
材料
Material
0级
Scale 0
1级
Scale 1
2级
Scale 2
3级
Scale 3
4级
Scale 4
5级
Scale 5
病情指数
D isease index
抗性评价
Results of evaluation
S69 111 1 0 3 0 　5 　518 抗病 Resistibility
三月茄 Sanyueqie (142) 　0 0 0 0 0 120 10010 感病 Suscep tibility
S69 ×142 20 7 8 16 13 56 6712 感病 Suscep tibility
142 ×S69 14 8 9 12 19 58 7113 感病 Suscep tibility
F2 ( S69 ×142) 63 12 9 33 44 235 7417 感病 Suscep tibility
在接种 28 d后 , 抗性亲本 ‘S69’病情指数为 518, 达到高抗水平 ; 感病亲本 ‘三月茄’全部枯死 ,
病情指数高达 100。正交和反交的 F1在不同病级都有分布 , 但感病株的数量明显高于未感病株的数量
(图 1) , 病情指数分别为 6712和 7113。按照抗性划分标准 , F1属于感病类型 (D I≥40)。试验表明 , 在
抗性材料 ‘S69’与感病材料 ‘三月茄’中 , 感病性为不完全显性 , 而抗病性为不完全隐性。
在 F2分离世代 396个单株中 , 各病级株数分布具有连续性 (图 2)。为便于分析控制抗性基因数
量 , 将 F2群体划分为感病群 (1～5级株数总和 ) 和未感病群 (0级株数 )。感病群与未感病群株数之
比 513∶1, 通过 X2分析 , 不符合由 1对基因控制的 3∶1, 也不符合由两对基因控制的 15∶1。如果将图
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　4期 李 　猛等 : 茄子青枯病抗性基因的遗传分析及其 AFLP标记 　
2中 0～2级划分为抗病群 , 将 3～5级划分为感病群 , 那么感病群与抗病群株数之比为 317∶1, X2分
析表明这符合由 1对基因控制的 3∶1的比例。综合分析表明 , ‘S69’对青枯病的抗性遗传是由 1～2
对基因控制的。
图 1　F1 各病级株数分布
F ig. 1　D istr ibution of No. of F1 plan ts in d ifferen t sca les
图 2　F2 各病级株数分布
F ig. 2　D istr ibution of No. of F2 plan ts in d ifferen t sca les
　　李海涛等〔4〕报道抗病材料 WCGR11228对青枯病的抗性由 1～2对基因控制 , 其中 1对基因起主导
作用 , 具有不完全的显性遗传 ; LS1934也属于不完全显性 , 但由 2个或 2个以上基因起主导作用 ,
并且抗病基因间具有累加效应〔5〕。朱华武等〔6〕报道抗性材料 S3的抗性受 1对显性基因控制。封林林
等〔7〕报道茄子青枯病抗性表现为隐性 , 感病性为部分显性 , 由多个微效基因和较少的主效基因和细
胞质基因共同控制。本研究表明 , ‘S69’对青枯病抗性属于部分隐性遗传 , 感病性属于部分显性遗
传。控制青枯病抗性基因对数为 1～2对 , 在抗性转育研究中 , 各世代都选择高抗的单株 , 但其后代
始终分离出少数的感病株 , 这也表明还存在微效抗性基因 , 不同材料间的抗性基因是否为等位基因 ,
这还需要做进一步研究。
212　AFL P多态性引物组合的筛选和标记分析
64个引物组合中 , 有 33个引物组合在双亲间检测到多态性 , 占总数的 5116% , 这个比例明显高
于 RAPD随机引物 (1516% )〔8〕。每个引物组合检出多态性带的数量在 1～4条 , 共检出 50条多态性
带。利用 33个引物组合再对父本、母本、抗病池和感病池进行检测 , 39号引物组合 ( E2ACC /M 2
CTG) 扩增的 1条多态性带出现在抗病亲本 ‘S69’和抗病 DNA池中 , 在感病亲本 ‘三月茄 ’和感
病 DNA池中没有出现 (图 3)。该多态性特征带大小约为 980 bp, 暂命名为 39A980。
图 3　茄子抗青枯病基因 AFL P标记
引物组合 ( E2ACC /M2CTG) 在父母本、F2 抗感池中检测到多态性特征带 (39A980 )。S: 感病亲本 ; R: 抗病亲本 ; SP: F2 感病
DNA池 ; RP: F2 抗病 DNA池 ; 1～8: 感病池的感病单株 ; 9～16: 抗病池的抗病单株 ; M: 分子量标记 SD006。
F ig. 3　 Iden tif ica tion of an AFL P marker linked to bacter ia l w ilt resistance gene
An AFLP fragment, named‘39A980 ’, revealed by p rimer combination E2ACC /M2CTG, was identified to be polymorphic between
S2pool and R2pool; S: Suscep tible parent; R: Resistant parent; SP: S2pool; RP: R2pool; 1 - 8: S2p lants from S2pool;
9 - 16: R2p lants from R2pool; M: DNA ladder SD006.
213　AFL P特征带与茄子抗青枯病基因连锁关系
为确定特征片断与抗病基因之间的遗传距离 , 用 39号引物组合对 F2 代分离群体中选择高抗和高
感的 86个单株 DNA进行检测 , 分析特征带 39A980在部分群体中的分布。结果 (图 4) 发现 , 在 38个
高抗单株中 , 有 37株 DNA具有该特征带 , 1株不具有该特征带 ; 在 48个高感单株中 , 45株没有该
特征带 , 3株却有该特征带。在选择的群体中 , 重组值 (重组型个体占群体的比例 ) 为 4165%。经
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Mapmaker 310软件分析 , 鉴定出的 AFLP标记 39A980与 ‘S69’抗病亲本的抗性基因之间的遗传距离
为 419 cM。
图 4　AFL P引物组合 ( E2ACC /M 2CTG) 在 F2 部分群体扩增结果
M: 分子量标记 SD006。1～4、7、11、13、17～19、21、22、27、30、32～35为 F2 抗病单株 ;
5、6、8～10、12、14～16、20、23～26、28、29、31为 F2 感病单株。
F ig. 4　AFL P ana lysis using pr im er com b ina tion E2ACC /M 2CTG on a few F2 plan ts
M: DNA ladder SD006. 1 - 4, 7, 11, 13, 17 - 19, 21, 22, 27, 30, 32 - 35 were BW resistant individuals;
5, 6, 8 - 10, 12, 14 - 16, 20, 23 - 26, 28, 29, 31 were suscep tible individuals.
徐矿红等〔9〕报道 RAPD标记 OPL12 /400很可能是与抗性材料 WCGR11228的抗性基因连锁的标
记 , 朱华武等〔8〕鉴定出了材料 S3抗性基因的 RAPD标记 S264780 , 与抗性基因间的遗传距离为 4133
cM。在本试验中 , 抗性材料 ‘S69’抗性由 1～2对基因控制 , 在标记辅助选择育种中 , 更加受到关
注的是主效基因。为了鉴定出与主效基因连锁的 AFLP标记 , 在 F2群体中选择了最早枯死的感病株和
完全未感病的高抗株。标记 39A980与抗性基因间的交换率为 4165% , 由于人为的选择和群体不太大 ,
该标记与抗病基因间的遗传距离也许存在一定的误差 , 但可以用于茄子抗青枯病品系标记辅助选择育
种。由于采用 AFLP试剂盒的鉴定成本较高 , 因此也需要将该标记转化为 SCAR标记。另外 , 在不同
材料间抗性基因是否存在等位关系 , 能否用该标记鉴定其他的抗性材料 , 这需要做进一步的鉴定。
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