全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 805 - 810
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 03 - 07; 修回日期 : 2008 - 05 - 13
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30360066 ) ; 国家 科 技 攻 关 计 划 引 导 项 目 ( 2003BA546C ) ; 兵 团 科 委 项 目
(NKB02SDXNK01SW )3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: njx105@1631com)
新疆杏树苹果锈果类病毒的检测与全序列分析
赵 英 , 牛建新 3
(石河子大学农学院园艺系 , 新疆石河子 832003)
摘 　要 : 在以往研究苹果锈果类病毒 (ASSVd) 的基础上 , 以斑点杂交检测 ASSVd呈阳性的杏树为试
验材料 , 利用 RT2PCR技术扩增出苹果锈果类病毒全长特异片段 , 通过回收克隆测序 , 发现杏树苹果锈果
类病毒基因组长为 330 nt, 将克隆测序结果在 GenBank中登录 , 获得 10条序列 , 登录号为 EU031487～
EU031496。在此基础上 , 利用原位 RT2PCR检测技术 , 进一步证明杏树叶片中有苹果锈果类病毒存在 , 主
要分布在细胞核中。本研究证实苹果锈果类病毒也能侵染杏树。
关键词 : 杏树 ; 病毒 ; 苹果锈果类病毒 ; 斑点杂交 ; RT2PCR; 原位 RT2PCR; 全序列分析
中图分类号 : S 66212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620805206
D etection and Sequenc ing of A pple sca r skin viro id from Apr icot in X in jiang
ZHAO Ying and N IU J ian2xin3
(D epartm ent of Horticu lture, A gricu ltura l College of Sh ihezi U niversity, Sh ihezi, X in jiang 832003, Ch ina)
Abstract: Present study was conducted based on the p revious research of Apple sca r sk in viroid (ASSVd)
for app le and pear, used material of ap ricot was those that showed positive signal of blot hybridization detec2
tion. Full2length special fragment of ASSVd for ap ricot was amp licated using RT2PCR p rotocol, then was recy2
cled, cloned and sequenced. It was demonstrated that the full2length genome of ASSVd of ap ricot is 330 nt
long ( GenBank numbered with EU031487 to EU031496). The exist of ASSVd in ap ricots was reconfirmed by
the results of in situ RT2PCR, and ASSVd mainly located in nucleolus of mesophyll cell. The fact of infecting
capability of ap ricot enlarged the host ranges of ASSVd.
Key words: ap ricot; virus; A pple sca r sk in viroid; blot hybridization; RT2PCR; in situ RT2PCR; full
length analysis
类病毒是迄今为止发现的最小病原物 , 是一类单链共价闭合环状的裸露 RNA分子 , 由 246～574
个核苷酸组成 , 根据序列和结构的同源性、复制特性分为两个科 , 分别为马铃薯纺锤块茎类病毒科
( Posp ivioidae) 和鳄梨日斑类病毒科 (Avsunviroidae)。
苹果锈果类病毒 (A pple scar sk in viroid, ASSVd) 属于 Posp ivioidae科 , 通常含 330个左右核苷酸 ,
存在细胞核内 , 有中央保守序列且不具有核酶活性 , 非对称滚式复制。日本学者 Hashimoto和 Kogan2
ezawa (1987) 首次报道了 ASSVd全序列 , 确认其为类病毒。据报道 (Hadidi et al. , 1991; Yang et
al. , 1992) ASSVd可侵染苹果和梨树 , 国内学者 (郭瑞 等 , 2005; 赵英和牛建新 , 2006) 分别克隆
分析了苹果锈果类病毒的序列。但关于 ASSVd侵染杏树尚未见报道。
本研究利用 RT2PCR、斑点杂交和原位 RT2PCR技术 , 首次发现并证实新疆杏树上有 ASSVd存
在 , 克隆其全长 , 并在 GenBank中登录。
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
1　材料与方法
111　材料
采集新疆焉耆地区多种果树 (苹果、梨、桃、杏 ) 混生的老果园中的杏树幼嫩叶片和枝条 , 提
取总 RNA。其中编号为 AP1～AP10的样品通过斑点杂交检测带有 ASSVd。
112　引物
根据 NCB I网站中发表的 NC_001340序列设计 ASSVd引物。ASSVd1 : 5′2CAGCACCACAGGAAC2
CTCACGG23′(互补引物 22 bp)、ASSVd2 : 5′2CTCGTCGTCGACGAAGG23′(同源引物 17 bp)。由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成。
113　方法
11311　总 RNA提取 　
参考赵英和牛建新 (2006) 的方法进行。
11312　RT2PCR　
反转录体系 : 25μL体系中总 RNA 10μL、DEPC水 5μL、互补引物 ASSVd1 1μL ( 20μmol·
L - 1 )。100 ℃变性 5 m in, 冰浴 5 m in, 加入 5 ×Buffer (Mg2 + 40 mmol·L - 1 ) 5μL、 dNTPs 210μL、
RNasin 015μL, 42 ℃预热 5 m in, 加 M 2MLV 1μL。反应程序 : 42 ℃温育 1 h, 100 ℃灭活 4 m in, 立
即置于冰上 , - 20 ℃保存待用。
PCR体系 : 10 ×Buffer 210μL、dNTPs ( each 10 mmol·L - 1 ) 015μL、Mg2 + 116μL (25 mmol·
L - 1 )、引物 ASSVd1和 ASSVd2各 1μL (20μmol·L - 1 )、cDNA 3μL、TaqE 015μL (5 U·μL - 1 ) , 总
体积 20μL。反应程序 : 95 ℃预变性 3 m in, 32个循环 : 95 ℃ 30 s, 62 ℃ 45 s, 72 ℃ 60 s, 最后 72
℃延伸 7 m in。取出 , 95 ℃以上灭活 4 m in。
2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 , 电泳缓冲液用 1 ×TBE, 电压 120 V, 电泳 40 m in, 北京市六
一仪器厂生产的 Gold V iew荧光染料显色 , 以华美产 PCR Marker为核酸长度对照。
11313　克隆及测序 　
用 2%琼脂糖凝胶回收 , 1 ×TAE缓冲体系进行电泳分离 , 染色后 , 长波紫外灯下切取目的片段 ,
用 UN IQ210 Gel Extraction Kit ( Sangon产品 ) 回收 DNA片段。操作均按照产品的使用说明进行。
克隆载体采用上海生工生物工程技术服务有限公司的 pUCm 2T Vector System, 长 2 773 bp, 具有
Amp的抗性 , 可用于蓝白斑筛选。参照 pUCm 2T载体克隆试剂盒操作说明 , 用上述纯化后的目的片段
和 pUCM 2T克隆载体连接 , 然后转化大肠杆菌感受态细胞。经蓝白斑筛选 , 挑取白色菌落培养 , 提取
质粒 , 通过酶切和 PCR鉴定阳性克隆。
测序工作委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行 , 序列结果采用 www1ncbi1nlh1gov网站
中 BLAST和 DNAMAN软件进行序列分析。
11314　cDNA探针检测 　
探针合成和检测参考赵英和牛建新 (2007) 的方法。
11315　石蜡切片制作与原位 RT2PCR检测预处理 　
参见牛建新等 (2007) 的方法。
11316　cDNA的合成 　
在 012 mL Eppendorf管中加入 SuperScrip tⅡ RT预混液 [DEPC H2 O 9μL、5 ×Frist2Strand Buffer
(MgCl2 15 mmol·L - 1 ) 4μL、dNTPs ( each 10 mmol·L - 1 ) 2μL、RNasin (40 U·μL - 1 ) 1μL、An2
tisense Primer (20μmol·L - 1 ) 1μL、DDT (011 mol·L - 1 ) 2μL、SuperScrip t Ⅱ RT (200 U·μL - 1 )
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　6期 赵 英等 : 新疆杏树苹果锈果类病毒的检测与全序列分析 　
1μL ] 20μL。将该混合液加于切片上 , 切片放于湿盒 , 密封 42 ℃温育 1 h。95 ℃灭活 2 m in; 用双
蒸水冲洗切片 10 m in, 室温干燥。
11317　原位 PCR扩增 　
在 012 mL Eppendorf管中按顺序加入以下试剂 : ddH2 O 12μL、10 ×LA PCR Buffer (Mg2 + free)
215μL、dNTP (10 mmol·μL - 1 ) 015μL、引物 P1 ( 20 pmol·μL - 1 ) 1μL、引物 P2 ( 20 pmol·
μL - 1 ) 1μL、D ig2112dUTP (1 nmol·μL - 1 ) 215μL、LA Taq DNA多聚酶 (5 U·μL - 1 ) 015μL, 总
体积 20μL。混匀 , 加到贴有基因框的切片上 , 用配套盖膜封好 , 放入 PCR仪扩增。ASSVd扩增程
序 : 95 ℃预变性 3 m in, 32个循环 : 95 ℃ 1 m in, 62 ℃ 1 m in, 72 ℃ 2 m in, 最后 1个循环延伸 10
m in。变性 5 m in。
去掉基因框用洗液 2 ×SSC洗载玻片两次 , 各 20 m in。
11318　原位 PCR产物的免疫检测 　
切片加 100μL封闭液 (100 mmol·L - 1 Tris2HCl, pH 715; 150 mmol·L - 1 NaCl; 3%BSA ) , 放于
湿盒 37 ℃ 30 m in, 用吸水纸放在载玻片的边缘 , 吸去玻片上的封闭液。切片加 100μL碱性磷酸酶标
记抗地高辛抗体 (在新鲜封闭液中以 1∶100稀释 ) , 湿盒室温下放置 30 m in。将玻片浸泡于清洗液中
(100 mmol·L - 1 Tris2HCl, pH 715; 150 mmol·L - 1NaCl) , 室温洗 2次 , 每次 15 m in。将玻片浸泡于
清洗液中 ( 100 mmol·L - 1 Tris2HCl, pH 715; 150 mmol·L - 1 NaCl, 50 mmol·L - 1 MgCl2 ) , 室温洗
5 m in。
加 100μL NBT/BC IP液 , 静置 60 m in显色。组织形成不溶性蓝黑色的地方就是扩增的位置。用
TE清洗切片 10 m in终止显色。用常规技术脱水并用中性树胶封片。
显微镜下观察并照相。阳性信号为蓝黑色。
试验中除了无类病毒苗 (通过 RT2PCR和探针杂交检测不带苹果锈果类病毒 ) 作为阴性对照外 ,
还以 PCR中省去引物、省去 DNA聚合 Taq酶、省略 RT步骤及省去 Mg2 +作为阴性对照。
2　结果与分析
211　总 RNA检测与 RT2PCR扩增结果
结果表明 , 本试验所提取的总 RNA完整性较好 (图 1) , 可用于 RT2PCR扩增。
图 1　杏组织总 RNA
1: 韧皮部 RNA; 2: 叶片 RNA。
F ig. 1　Tota l RNA of apr icot
1: The total RNA isolated from phloem of ap ricot;
2: The total RNA isolated from leaf of ap ricot.
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利用 ASSVd类病毒引物进行 RT2PCR扩增 , 获得了 330 bp左右大小的预期目的片段 (图 2)。
图 2　杏 ASSVd RT2PCR检测结果
1: 阴性对照 ; 2: 单引物对照 ; 3～12: 杏样品 AP1～AP10; 13: Marker。
F ig. 2　The RT2PCR products of ASSVd in tota l RNA of apr icot
1: The negative control; 2: Control of a single p rimer;
3 - 12: Ap ricot samp le AP1 - AP10; 13: Marker.
212　杏树苹果锈果类病毒 RT2PCR产物克隆和序列分析
克隆测序结果表明 , 杏树苹果锈果类病毒全长为 330 nt。
通过 BLAST对比分析发现 , 该杏树苹果锈果类病毒与苹果锈果类病毒同源性很高 , 与 GenBank
中登录的序列 AJ783357、Y00435、AF421195、X17696、DQ362907、AY972082、DQ362906的同源性
也均在 93%以上。将获得的 10条全长序列在 GenBank上登录 , 登录号为 : EU031487～EU031496,
这 10条序列相互之间的同源性均在 98%以上 , 因此可以确认 , 通过 RT2PCR扩增出的特异片段为苹
果锈果类病毒序列。
这在国内外尚属首次发现 , 证实了苹果锈果类病毒也能侵染杏树。
213　斑点杂交检测结果
将 RNA样品经过变性处理后 , 用稀释液 (DEPC处理水 ∶20 ×SSC∶甲醛 = 5∶3∶2) 依次进行 10 - 1
和 10 - 2稀释后 , 分别取 1μL, 点样在硝酸纤维素膜上 , 用标记探针与之进行杂交。结果 (图 3) 表
明 , 杏树组织总 RNA稀释 10 - 2后仍能清楚地检测到苹果锈果类病毒的存在。
图 3　杏树 ASSVd斑点杂交检测
1. 对照 (无锈果类病毒的核酸 ) ; 2. 未稀释 ; 3. 稀释 10 - 1 ; 4. 稀释 10 - 2。
F ig. 3　D etection of ASSVd by dot blot hybr id iza tion
1. Negative control; 2. Undiluted; 3. D ilution at 10 - 1 ; 4. D ilution at 10 - 2.
214　苹果锈果类病毒在杏树叶片组织中的分布
设置 5种对照 , 在经充分洗涤后对照切片均未出现蓝黑色 , 而阳性材料在栅栏组织中的一些细胞
核中出现了蓝黑色。这表明 , 苹果锈果类病毒主要位于叶肉细胞核中 (图 4)。
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　6期 赵 英等 : 新疆杏树苹果锈果类病毒的检测与全序列分析 　
图 4　苹果锈果类病毒在叶片组织中的分布
A: 阳性材料 ; B～F: 对照 (B: PCR中省去 Taq酶 ; C: PCR中省去逆转录步骤 ;
D: PCR中省去引物 ; E: 健康杏材料 ; F: PCR中省去 Mg2 + )。
F ig. 4　L oca tion of ASSVd in leaf tissues paraff in slice detected by in situ RT2PCR
A: D isp lay distinct staining; B - F: Control (B: Negative control with Taq DNA polymerase om itted;
C: Negative control with reverse transcrip tion step om itted; D: Negative control with p rimers om itted;
E: Known negative samp le; F: Negative control with Mg2 + om itted) .
3　讨论
Koganezawa (1983) 首次报道在苹果锈果病果中检出类病毒 RNA , 随后我国学者陈炜等 (1986)
也从苹果锈果病树枝条上检出类病毒 , 确定了核糖核酸的碱基序列 , 并证明了这种类病毒的致病性 ,
至此才确认了苹果锈果病是由一种类病毒引起的病害。日本学者 Hashimoto和 Koganezawa (1987) 首
次报道了 ASSVd全序列 , 确认其为类病毒。后来发现 , 苹果锈果类病毒也可以侵染梨树 ( Puchta et
al. , 1990; Zhu et al. , 1995; 郭瑞 等 , 2005; 赵英和牛建新 , 2006, 2007) , 但尚未见侵染核果类
的报道。
本试验利用 RT2PCR技术从混植 (苹果、梨、桃、杏 ) 果园的杏树上扩增出了 ASSVd特异片段 ,
并克隆了它的全长序列 , 其序列已在 GenBank上登录 ( EU031487～EU031496)。另外 , 利用合成的
苹果锈果类病毒的 cDNA探针 , 通过斑点杂交检测 , 也证明杏树上有苹果锈果类病毒。在此基础上我
们还利用原位 RT2PCR检测技术 , 证实杏树叶片的石蜡切片组织中有苹果锈果类病毒 , 并且主要分布
在细胞核中。这些进一步证明 , 苹果锈果类病毒也可侵染杏树。此外 , 混植果园中杏树周围的苹果、
梨也均检测了苹果锈果类病毒。至于是通过什么途径侵染到杏树中的 , 尚需进一步研究。
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References
ChenW ei, Tian Bo, J in L i2p ing, W ang Guo2p ing, L iu Fu2chang. 1986. Study of viroid RNA isolated from app le scar skin disease tissues.
Chinese Journal of V irology, 2 (4) : 79 - 84. ( in Chinese)
陈　炜 , 田　波 , 金立平 , 王国平 , 刘福昌. 1986. 从苹果锈果病组织中分离到类病毒 RNA分子的研究. 病毒学报 , 2 ( 4) :
79 - 84.
Guo Rui, L i Shi2fang, Dong Ya2feng, Cheng Zhuo2m in. 2005. Occurrence of app le scar skin disease and sequence analysis of Apple scar skin
viroid in L iaoning. Acta Phytopathologica Sinica, 35 (5) : 472 - 474. ( in Chinese)
郭　瑞 , 李世访 , 董雅凤 , 成卓敏. 2005. 苹果锈果类病毒辽宁分离物的克隆与序列分析. 植物病理学报 , 35 (5) : 472 - 474.
Hashimoto J, Koganezawa H. 1987. Nucleotide sequence and secondary structure of app le scar skin viroid. Nucleic Acids Research, 15 (17) :
7045 - 7052.
Hadidi A , Hansen A J, Parish C J, Yang X. 1991. Scar skin and dapp le app le viroids are seed2borne and persistent in infected app le trees.
Research in V irology, 142 : 289 - 296.
Koganezawa H, Yanase H, Sakuma T. 1983. V iroid2like RNA associated with app le scar skin (or dapp le app le) disease. Acta Horticulturae,
130: 193 - 197.
N iu J ian2xin, Zhou M in2sheng, Ma B ing2gang, Zhao Ying, L iu Hong. 2007. Detection of Apple chlorotic leaf spot virus in pear by in situ RT2
PCR. Acta Horticulturae Sinica, 34 (1) : 53 - 58. ( in Chinese)
牛建新 , 周民生 , 马兵钢 , 赵 英 , 刘 宏. 2007. 梨组织中苹果褪绿叶斑病毒的原位 RT2PCR检测. 园艺学报 , 34 ( 1) : 53 -
58.
Puchta H, Luckinger R, Yang X C, Hadidi A, S¾enger H L. 1990. Nucleotide sequence and secondary structure of app le scar skin viroid
(ASSVd) from China. PlantMolecular B iology, 14 (6) : 1065 - 1067.
Yang X, Hadidi A, Hammond R W. 1992. Nucleotide sequence of Apple scar skin viroid reverse transcribed in host extracts and amp lified by the
polymerase chain reaction. Acta Horticulturae, 309 : 305 - 309.
Zhao Ying, N iu J ian2xin. 2006. Cloning and sequencing of Sinkiang isolate of Apple scar skin viroid (ASSVd). Journal of Fruit Science, 23
(6) : 896 - 898. ( in Chinese)
赵 英 , 牛建新. 2006. 苹果锈果类病毒新疆分离物的克隆和序列分析. 果树学报 , 23 (6) : 896 - 898.
Zhao Ying, N iu J ian2xin. 2007. Detection of Apple scar skid viroid in pear cultivars by RT2PCR and spot hybridization in Xinjiang area. Journal
of Fruit Science, 24 (6) : 761 - 764. ( in Chinese)
赵 英 , 牛建新. 2007. 应用 RT2PCR和斑点杂交法检测新疆梨树上的苹果锈果类病毒. 果树学报 , 24 (6) : 761 - 764.
Zhu S F, Hadidi A, Hammond R W. 1995. Nucleotide sequence and secondary structure of pome fruit viroids from app le disease app les, pear
rusty skin diseased pears and app le scar skin symp tom less pear. Acta Horticulturae, 386: 554 - 559.
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