全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 443 - 448
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 07 - 10; 修回日期 : 2007 - 03 - 14
基金项目 : 国家社会公益研究项目 ( 2005D IB022 ) ; 国家科技支撑项目 ( 2006BAD01A18 ) ; 北京市花卉重点项目 ( YL2
HH2006001, YLHH2006002)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: m ingjunmail@yahoo1com1cn)
百合三种病毒的多重 RT - PCR检测
徐榕雪 1, 2 , 明　军 13 , 穆　鼎 1 , 刘　春 1 , 汤庚国 2 , 王晓武 1
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 南京林业大学森林资源与环境学院 , 南京 210037)
摘 　要 : 根据基因库中黄瓜花叶病毒 (Cucum ber m osaic virus, CMV)、百合斑驳病毒 (L ily m ottle virus,
LMoV)、百合无症病毒 (L ily sym ptom less virus, LSV) 的外壳蛋白基因序列 , 设计了 3对特异引物 , 通过对
扩增条件进行优化 , 建立了同时检测 CMV、LMoV和 LSV的多重 RT - PCR检测方法。该方法可以从带有
CMV、LMoV和 LSV的样品中同时扩增出 3条大小与试验设计相符的 657 bp (CMV)、428 bp (LMoV)、171
bp (LSV) 的特异性多重 RT - PCR扩增带。扩增产物测序表明 , CMV、LMoV和 LSV 三种病毒与 GenBank
中登录的亚洲和荷兰多数分离物核苷酸同源性在 90%以上 , 地域差异不明显 , 外壳蛋白序列高度保守。
关键词 : 百合 ; 多重 RT - PCR; 病毒检测 ; 黄瓜花叶病毒 ; 百合斑驳病毒 ; 百合无症病毒
中图分类号 : S 68212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220443206
D etection of Three L ily V iruses by M ultiplex RT - PCR
XU Rong2xue1, 2 , M ING Jun13 , MU D ing1 , L IU Chun1 , TANG Geng2guo2 , and WANG Xiao2wu1
(1 Institu te of V egetables and F low ers, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, China; 2N anjing A gricultural
U niversity, College of Forest Resources and Environm ent, N anjing 210037, Ch ina)
Abstract: A multip lex RT - PCR method was developed to simultaneously detect three viruses of L ily by
using 3 sets of specific p rimers designed according to CMV (Cucum ber m osa ic virus) , LMoV (L ily m ottle vi2
rus) and LSV (L ily sym ptom less virus). A ll samp les infected by CMV , LMoV and LSV could be amp lified by
multip lex PCR, and yielding three special bands of CMV (657 bp) , LMoV (428 bp ) and LSV (171 bp ).
Sequence identities of the three amp lified virus fragments correlated well with other isolates from A sia and the
Netherlands registered in the GenBank. Remarkably high homology in the coat p rotein sequences of the three
viruses has been observed respectively desp ite their different origins.
Key words: L ily; Multip lex RT - PCR; V irus detection; Cucum ber m osa ic virus; L ily m ottle virus; L ily
sym ptom less virus
我国栽培百合普遍受到病毒侵染 , 病原和田间症状均相当复杂。其中 , 黄瓜花叶病毒 (Cucum ber
m osa ic virus, CMV)、百合斑驳病毒 (L ily m ottle virus, LMoV ) 和百合无症病毒 (L ily sym ptom less vi2
rus, LSV) 是目前严重危害百合的三种主要病毒 (A sjes, 2000; 刘文洪 等 , 2004)。CMV和 LMoV
单独侵染时分别表现为花叶、花瓣斑驳 , LSV一般无症状。但是 , 它们常复合侵染后表现为幼叶向下
反卷扭曲、系统花叶、坏死斑、花扭曲或畸形呈舌状、花瓣斑驳、花期缩短、植株矮化呈丛簇状 , 甚
至无花、植株无主秆等症状 , 造成百合切花与鳞茎品质和产量的严重下降 ( Chang & Chen, 1998;
Bellardi et al. , 2002)。
感病植株终生带毒 , 可通过蚜虫或汁液传播给下一代籽球或其他百合种群。由于百合种球生产主
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
要靠扦插和分球等无性繁殖方式 , 一旦染毒 , 在开放环境中病毒便会在体内积累并扩散 , 最终造成危
害。
目前 , 常用的百合病毒检测方法有生物学方法、电子显微镜法、血清学方法、分子杂交、反转录
聚合酶链式反应 (Reverse transcrip tion polymerase chain reaction, RT - PCR) 以及基因芯片等。其中 ,
RT - PCR方法已被证实是目前特异性最强、灵敏度最高的病原检测方法 , 现已广泛应用于病毒诊断
和检测 (N ie et al. , 2001)。在此基础上开发的多重 RT - PCR (Multip lex RT2PCR ) 可以一次检测出
多达 6种植物病毒 (Bertolini et al. , 2001) , 在复合侵染诊断中 , 不仅可以大大提高检测效率 , 又可
以显著降低试验成本 , 因此具有很高的实际应用价值。目前 , 未见国内外有应用多重 RT - PCR同时
检测 CMV、LMoV和 LSV三种百合主要病毒的报道。
本研究利用多重 RT - PCR的方法 , 建立了稳定的同时鉴别 CMV、LMoV和 LSV三种病毒的检测
体系 , 并应用该体系检测了部分百合脱毒试管苗。
1　材料与方法
111　材料
CMV、LMoV、LSV 三种病毒复合侵染病毒症状的样品 L ily long if lorum‘Snow Queen’由中国农业
科学院蔬菜花卉研究所收集和保存。
采集感病植株不同部位 ———花被片、上部嫩叶、下部老叶、内侧鳞茎、外侧鳞茎并分别提取总
RNA , 进行多重 RT - PCR体系的建立和优化。应用多重 RT - PCR检测的经不同脱毒处理的百合组培
苗材料为中国农业科学院蔬菜花卉研究所收集、鉴定和保存的东方百合杂种系 ‘索蚌 ’ (O riental hy2
brids‘Sorbonne’) 品种。
112　方法
11211　总 RNA的提取 　采用北京百泰克公司 TR IPURERNA提取试剂盒提取总 RNA。取 011 g植物
组织在液氮中研磨 , 将匀浆液转入盛有 1 mL Tripure提取液的离心管中 (样品体积不超过 Tripure体
积的 10% ) , 振荡混匀 , 室温静置 5 m in, 加入 200μL氯仿 , 12 000 r/m in离心 15 m in, 取上层水相
015 mL移至 115 mL离心管中 , 加入 500μL异丙醇 , 混匀 , 静置 10 m in, 而后 12 000 r/ m in离心 10
m in。沉淀用 75%乙醇 1 mL洗涤 , 7 500 r/m in离心 10 m in, 弃上清使 RNA沉淀恰好干燥。加入 20
μL无菌水溶解 RNA, - 70℃保存或进行 RT2PCR扩增。
11212　引物设计与合成 　根据 NCB I GenBank ( The National Center for B iotechnology Information, 美
国 ) 收录的 CMV、LMoV、LSV CP基因序列应用 Primer Prim ier 510设计软件分别设计这三种病毒的
特异引物 CMV l /CMV2、LMoV1 /LMoV2、LSV1 /LSV2 , 序列见表 1。
表 1　L SV、CM V和 LM oV引物序列
Table 1　Pr im er sequences, size and RT - PCR product size
病毒
V iruses
上游引物
Up stream p rimer(5′- 3′)
下游引物
Downstream p rimer(5′- 3′)
产物大小
Product size ( bp)
CMV ATGGACAAATCTGAATCAACCAG TCAGACTGGGAGCACTCCAG 657
LMoV CACCTCACCAAATGTAAATGG TAGAAATTCCAAGTAAGGAGTGC 428
LSV GAAGAAGCACGCTGGACTG CGCCTGATGATCCCCTC 171
11213　RT - PCR体系建立与优化 　对多重 PCR的各引物浓度、 dNTPs及 PCR反应的变性、退火至
延伸条件以及循环次数等进行优化 , 确定最佳的反应模式为 : 反转录 42℃ 2 h, 90℃ 5 m in。PCR反
应体系为 20μL, 包括 : Taq PCR buffer (百泰克 , 内含 115 mmol/L MgCl2 ) , 200μmol/L dNTPs M ix2
444
　2期 徐榕雪等 : 百合三种病毒的多重 RT - PCR检测 　
tures, CMV、LMoV和 LSV 上下游引物各 5 pmol, 5μL cDNA , 1 U Taq酶。经优化的 PCR 程序 :
95℃预变性 4 m in, 进入 94℃变性 20 s, 52℃退火 30 s, 72℃延伸 1 m in, 30个循环 , 再 72℃延伸 5
m in, 最后于 4℃结束反应。
在 MJ2200 PCR扩增仪上进行扩增 , 进行琼脂糖 (110% ) 凝胶电泳 , 利用 Gel Doc1000凝胶分析
仪 (B io2Rad) 观测电泳结果 , 并照相记录。
11214　PCR产物的回收、验证和测序 　RT2PCR扩增产物经回收纯化后 , 用 pDM182T vector载体连
接转化大肠杆菌 DH 5α感受态细胞 , LB培养基上 37℃培养 16 h挑取白色菌落 , 碱裂解法提取质粒
DNA , 利用 PCR技术进行筛选阳性克隆。
DNA测序由中国农业科学院重大工程实验室完成。采用 DNA Star的 Megalign程序和聚类法
(Clustal method ) 将三种病毒扩增片段测序结果与 GenBank数据库中已登录的其它分离物的核苷酸序
列进行同源性比较。
11215　应用多重 RT2PCR检测百合脱毒苗 　应用本体系方法抽样检测 5株经不同脱毒处理的东方百
合杂种系 ‘索蚌 ’品种 (O riental hybrids‘Sorbonne’) 的脱毒苗 , 并用单重 RT2PCR验证。
2　结果与分析
211　多重 PCR的特异性
单重、二重和三重 PCR分别从带有 CMV、LMoV和 LSV病毒的百合叶片组织中扩增出单一、两
条或三条特异的目标谱带 , 大小分别约为 657 bp、430 bp、171 bp; 健康叶片则无扩增谱带 , 均未出
现非特异扩增产物 (图 1)。结果显示 : 多重 PCR具有较高的特异性 , 可以同时、准确检测到百合叶
片中复合感染的 CMV、LSV、LMoV。且各片段长度具有明显的差异 , 容易区分。
图 1　多重 RT - PCR特异性试验
F ig. 1　Spec if ic ity of m utiplex RT - PCR
M: DNA marker; 1: CMV; 2: LMoV; 3: LSV; 4: CMV +LSV;
5: LMoV +LSV; 6: CMV +LMoV +LSV; 7: Healthy leaf.
212　多重 RT - PCR体系对不同取样部位的病
毒检测
用同一感病植株的花、叶、鳞片提取浓度相
同 RNA进行反转录 (图 2) , 分别进行多重 RT -
PCR, 结果均得到了清晰的扩增谱带 (图 3)。结
果表明 : 三种病毒在百合花、叶、鳞片上均有分
布 , 且 LSV、LMoV 的不同取样部位的特异扩增
条带的强度比较一致 , 而 CMV在上部叶片中扩增
较强 , 在内侧鳞茎最弱 , 得到单重 RT - PCR验证
(图 4)。
图 2　不同部位 RNA提取结果
1: 外鳞茎 ; 2: 内鳞茎 ; 3: 花 ; 4: 上部叶 ; 5: 下部叶。
F ig. 2　RNA extracted from d ifferen t parts of the plan t
1: Outside bulb; 2: Inside bulb; 3: Flower;
4: Up side leaf; 5: Underside leaf.
544
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
213　多重 RT - PCR产物克隆测序结果
回收纯化的 CMV、LMoV和 LSV扩增片段所测得的序列全长分别为 657 bp、428 bp、171 bp与单
重 PCR扩增得到的比对序列一致。本试验所得到的 CMV扩增序列与亚洲地区日本、韩国、印度的分
离物同源性均在 99%以上 , 与荷兰分离物同源性高达 9917% (图 5)。
LMoV扩增序列与其它分离物同源性也很高 , 与日本分离物同源性达 9818% , 与中国浙江和云南
两省分离物同源性都在 92%以上 (图 6) ; LSV扩增片段序列同源性分析表明 : 该扩增片段与中国分
离物同源性较高 , 与韩国和印度分离物同源性也在 96%以上 (图 7)。证明该 3种病毒的外壳蛋白是
高度保守的 , 根据其 CP序列设计的引物也具有广泛的适用性。
图 5　CM V扩增片段与其它分离物核苷酸序列的系统进化树
F ig. 5　Phylogenetic dendrogram of the CM V nucleotide sequences
图 6　LM oV扩增片段与其它分离物核苷酸序列的系统进化树
F ig. 6　Phylogenetic dendrogram of LM oV spec if ic am plif ied on the nucleotide sequences by m ultiplex RT - PCR w ith others
644
　2期 徐榕雪等 : 百合三种病毒的多重 RT - PCR检测 　
图 7　L SV扩增片段与其它分离物核苷酸序列的系统进化树
F ig. 7　Phylogenetic dendrogram of L SV spec if ic am plif ied on the nucleotide sequences
by m ultiplex RT - PCR w ith other isola tes
214　多重 PCR检测组培苗
应用该方法随机抽样检测经不同脱毒处理的
东方百合 ‘索蚌 ’品种组培苗 5株 , 结果检测出
分别含有未脱除的 CMV和 LMoV的两株 (图 8中
1, 3)。利用单重 RT - PCR验证 , 结果相符。证
明该方法具有较高的灵敏度和准确性 , 可以用于
大量脱毒苗的检测。
图 8　东方百合系 ‘索蚌’组培苗检测
F ig. 8　D etection of 3 v iruses in vitro plan ts of
O r ien ta l hybr ids Sobonne
3　讨论
目前已报道的百合的病毒有 19种 (Lee et al. , 1992; 明军 等 , 2006) , 其中 CMV、LMoV 和
LSV 三种病毒危害较为普遍和严重。
王继华等 (2005) 应用二重 RT - PCR的方法检测了 LSV和 LMoV , 可从稀释 104 (相当于 200
ng) 的粗提液中得到扩增产物。但由于实际生产中 , 百合多表现三种病毒的复合侵染 , 二重 PCR不
能满足需要。
王进忠等 (2005) 对百合病毒核酸进行不对称 RT - PCR扩增 , 通过荧光标记制作的基因芯片可
以检测到 CMV、LSV和 LMoV。与之相比 , 多重 RT - PCR明显简便、快捷。另外本试验所设计的引
物 Tm值接近 , 从而实现了同一退火温度的扩增 , 不需要带有 Touchdown程序的 PCR仪 , 具有更高的
实用性和可靠性。
病毒在感病植株体内各组织器官具有不均匀分布特性 (W hite, 1934)。因此 , 检测的部位差异可
能造成检测结论的偏差。本试验分别从百合的不同部位 ———花、叶片和鳞茎中检测到了三种病毒 , 这
也是由鳞茎提取 RNA运用 RT - PCR方法进行病毒检测的首次报道 , 对于以种球作为主要流通方式的
百合具有重要意义。另外 , 在所提取的植物 RNA含量基本相同的条件下 , 可以明显地观察到扩增谱
带亮度的差别 , 通过单重 PCR验证结果一致 , 可能预示 CMV的表达与植株的代谢强度有关。
通过三种病毒的测序结果与其它分离物序列的比对可知 : 三种病毒与其它大部分分离物的同源性
744
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
均在 90%以上 , 这可能与目前百合种球在世界流通广 , 各地栽培的百合球茎来源复杂 , 地域分布特
点不明显有关 (Chen et al. , 2001)。同时也证明了外壳蛋白 (CP) 在病毒的传播和保护病毒 RNA方
面起重要作用且相对保守 (李燕 等 , 2005) , 根据外壳蛋白序列所设计的三对引物建立的多重 RT -
PCR体系能够检测侵染百合的不同来源的 CMV、LMoV和 LSV。同时也为今后利用该方法检测更多种
病毒提供了依据。
References
A sjes C J. 2000. Control of aphid2borne lily symp tom less virus and lily mottle virus in L ilium in the Netherlands. V irus Res. , 71 (122) : 23 -
32.
Bellardi M G, Nanni G, Bertaccini A. 2002. O ld and new viruses of lily in Italy. Acta Horiticulturae, 568: 215 - 220.
Bertolini E, O lmos A, MartinezM C, GorrisM T, Cambra M. 2001. Single2step multip lex RT2PCR for simultaneous and colourimetric detection
of six RNA viruses in olive trees. V irol. Methods, 96 (1) : 33 - 41.
Chang C, Chen C. 1998. Current status of lily virus research and the development of its detection techniques in Taiwan. Taiwan: Special Publica2
tion Taichung D istrict Agricultural Imp rovement Station.
Chen Y K, Derks A F, Langeveld S. 2001. H igh sequence conservation among cucumber mosaic virus isolates from lily. A rch. V irol. , 146:
1631 - 1636.
Lee K H. 1992. D isease incidence, symp tomatoloy and identification of two new isometric viruses from imported lilies〔M. S. thesis〕, Chunnam
University.
L i Yan, L i Fa2hui, Chen Yu2quan. 2005. The exp ression of lily symp tom less carlavirus CP gene in Escherich ia coli. Acta Agriculturae Boreali2ac2
cidentalis Sinica, 14 (4) : 171 - 173. ( in Chinese)
李　燕 , 李发慧 , 陈毓荃. 2005. 百合无症病毒 CP基因在大肠杆菌中的表达. 西北农业学报 , 14 (4) : 171 - 173.
L iu W en2hong, Hong J ian, Chen J i2shuang, Ye Mei2qin. 2004. Detection and diagnosis of viruses infecting lily. Journal of Chinese Electron, 23
(3) : 225 - 228. ( in Chinese)
刘文洪 , 洪　健 , 陈集双 , 叶美琴. 2004. 百合病毒病原的检测进展. 电子显微学报 , 23 (3) : 225 - 228.
M ing Jun, Xu Rong2xue, Mu D ing, L iu Chun. 2006. Developments in technique for lilies virus elim ination. In: Zhang Q i2xiang ed. Advances in
ornamental horticulture of China. Beijing: China Forestry Publishing House: 504 - 511. ( in Chinese)
明　军 , 徐榕雪 , 穆　鼎 , 刘　春. 2006. 百合病毒及其脱除研究进展. 见 : 张启翔编. 中国观赏园艺研究进展. 北京 : 中国林
业出版社 : 504 - 511.
N ie X, Singh R P. 2001. A novel usage of random p rimers formultip lex RT2PCR detection of virus and viroid in aphids, leaves, and tubers. Jour2
nal of V irologicalMethods, 91: 37 - 49.
W ang J i2hua, W ang L i2hua, D ing Yuan2m ing, Qu Su2p ing, Xiong L i, Tang Kai2xue. 2005. Detection of L ily sym ptom less virus and L ily m ottle vi2
rus by multip lex RT2PCR. Acta Horiculturae Sinica, (2) : 100 - 103. ( in Chinese)
王继华 , 王丽花 , 丁元明 , 瞿素萍 , 熊　丽 , 唐开学. 2005. 应用多重 RT2PCR检测百合无症病毒和百合斑驳病毒. 园艺学报 ,
(2) : 100 - 103.
W ang J in2zhong, J ia Hui, W en Si2yuan, W ang Sheng2qi. 2005. Detection for CMV, LSV, LMoV infected lily with DNA m icroarry techniques.
V irologica Sinica, (20) : 429 - 433. ( in Chinese)
王进忠 , 贾　慧 , 文思远 , 王升启. 2005. 百合病毒的 DNA芯片检测技术研究. 中国病毒学 , 20: 429 - 433.
W hite P. 1934. Multip lication of virus of toy2bacco and aucuba mosaic on growing exisied tomato roots. Phytopathology, 24: 1003 - 1011.
844