全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(7)：1039—1046
Aeta Horticuhurae Siniea
创伤及高渗透压预处理对蝴蝶兰叶片诱导类原球茎
的影响
黄 磊 ，陈之林 ，吴坤林 ，曾宋君 ，段 俊h
( 中国科学院华南植物园，广州510650； 中国科学院研究生院，北京 100049)
摘 要：以蝴蝶兰试管播种苗的顶端第1叶和第2叶叶片为外植体，以1／2 MS+10％椰子乳 +NAA
0．1 mg·L +TDZ 1．0 mg·L +0．5％ 琼脂为诱导培养基 ，研究了创伤和高渗透压两类预处理对其诱导
类原球茎 (protocorm—like body，PLB)的影响。结果表明，两类预处理均对叶片诱导 PLB有显著促进作用。
在创伤预处理中，当外植体横切 2刀及用刀尖扎 15次后，外植体的 PLB诱导率分别达到66．1％和68．3％，
平均每外植体诱导出 13．1和 15．2个 PLB；在高渗透压预处理中，当用0．4 rnol·L 甘露醇溶液和 AAM培
养基分别浸泡2 h后，外植体的 PLB诱导率达到55．2％和51．3％，平均每个外植体诱导出 13．7和 12．9个
PLB，而对照的PLB诱导率只有 19．5％ ，平均每个外植体只诱导出3．1个 PLB。经上述两类预处理后外植
体的 PLB诱导率和平均 PLB个数均与对照达极显著差异水平，同时，外植体上诱导出PLB的时间分别比对
照提前了 10 d和5 d。但来源于第 1叶和第 2叶的外植体之间 PLB诱导结果均没有明显差异。经创伤和高
渗透压预处理后诱导出的 PLB均能正常分化成苗。
关键词：蝴蝶兰；叶片；预处理；PLB诱导
中图分类号：S 682．31 文献标识码 ：A 文章编号：0513—353X (2008)07—1039-08
Efects of W ound and High Osmotic Pressure Pretreatments on PLB
Induction from Leaf Explants in Phalaenopsis amabilis
HUANG Lei 一，CHEN Zhi．1in‘
，
WU Kun．1in‘
，
ZENG Song-jun‘，and DUAN Jun‘
(‘South China Botanical Garden，The Chinese Academy D厂Sciences，Guangzhou 510650，China； Graduate School，The
Chinese Academy D厂Sciences，Belting 100049，China)
Abstract：The first and second leaf from the top of Phalaenopsis amabilis seedlings were used respective-
ly as explants，and 1／2 MS medium including 10％ coconut milk(CM)，0．1 mg·L～仅．naphthyl acetic acid
(NAA)，1．0 mg·L thidiazuron(TDZ)and 0．5％
high osmotic pressure on PLB (protocorm-like body)
agar was used to induce PLB，the effects of wound and
induction were studied．The results revealed that these
two types of pretreatments could improve PLB induction remarkably．After the explants were cut transversely
twice or stabbed 15 times on diferent sites，their PLB induction rates went up t0 66．1％ and 68．3％ ，the
PLB number per explant went up to 13．1 and 15．2．Atier the explants were incubated in 0．4 mol·L～ man．
nitol solution or AAM medium for 2 hours as high osmotic pressure pretreatments．the PLB induction rates
went up t0 55．2％ and 51．3％ ，the PLB number per explant went up t0 13．7 and 12．9．While the PLB in．
duction rate of the control was 1 9．5％ and the PLB number per explant was 3．1．Compared with the contro1．
the PLB induction rate and PLB number per explant were both very signifcantly difference in all the pretreat．
ments．Moreover，after the explants were pretreated by wound or high osmotic pressure，the time of PLB for-
mation was 10 and 5 days shorter respectively than that of the contro1．However．there were not obvious differ．
收稿日期：2008—03—17；修回日期：2008—05—22
基金项目：国家自然科学基金委员会一广东省联合基金项 目 (u0731006)；中国科学院知识创新工程青年人才领域前沿项 目
(200739)
通讯作者 Author for corespondence(E-mail：duanj@scib．ac．cn)
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enees between the first and second leaf explants in PLB induction．PLB induced from the explants that had
been pretreated by wound or high osmotic pressure could develop into plantlet normaly．
Key words：Phalaenopsis；leaf；pretreatment；PLB inductmn
蝴蝶兰 (Phalaenopsis)的人工繁殖可以通过以下 3条途径进行：一是通过无菌播种得到原球茎，
再通过原球茎增殖分化得到幼苗；二是从离体器官诱导产生类原球茎 (protocorm—like body，PLB)，
再通过类原球茎增殖分化得到幼苗；三是通过花葶离体诱导丛生芽的方式繁殖。由于生产上利用的蝴
蝶兰均是一些杂交品种，因此，通过第 1种方式繁殖种苗，虽然简单快速，短期内能获得大量种苗，
但其后代性状分离严重，整齐度差；通过第 3种方式繁殖种苗，后代在各性状上整齐度高，但繁殖速
度慢；第 2种繁殖方式在种苗繁殖速度和后代整齐度上均介于上述二者之间 (秦凡和周吉源，
2003)。目前生产上由于对种苗整齐度要求较高而主要采取第 3条途径繁殖种苗，但此途径在转基因
育种中难以应用。在兰花转基因体系的建立中，原球茎和 PLB是较为常用的转化受体 (柴明良和金
斗焕，2004；陈之林 等，2007)。
作者以蝴蝶兰试管播种苗的叶片为外植体，研究了创伤和高渗透压预处理对 PLB诱导的影响，
试图探索出提高叶片PLB诱导效率的方法，旨在为蝴蝶兰种苗的规模化生产及以 PLB为受体的转基
因体系的建立提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
供试材料为本实验室保存的白花蝴蝶兰 (Phalaenopsis amabilis)试管播种苗。选取具4片叶幼苗
的顶端第 1片和第2片平展叶，经基部横切所得叶片用作外植体。
1．2 创伤预处理
在叶片上人为制造切口或伤口，具体分为两种处理：
(1)从叶片一侧平行横切2刀，使叶片产生2个横向的切口，切口不横穿叶片，只占3／4叶宽，
叶片仍在另一侧连接为整体；
(2)用刀尖垂直叶面在不同位置扎穿叶片 l5次，形成 l5个伤口，伤口方向与叶主脉垂直，长
约 2 mm。
以不进行任何预处理的叶片为对照。
1．3 高渗透压预处理
对外植体进行高渗透压预处理，即用高渗溶液浸泡外植体，具体分为以下 3种：
(1)叶片放人 AAM培养基 (Hiei et a1．，1994)中浸泡2 h。
(2)叶片放入0．4 mol·L 甘露醇溶液中浸泡2 h。
(3)叶片放入蒸馏水中浸泡2 h。
以不进行任何预处理的叶片为对照。
1．4 培养条件
所有的处理和对照均为30个外植体，接种于 1／2 MS(大量元素减半，下同)+l0％椰子乳 +
NAA 0．1 mg‘L +TDZ 1．0 mg·L +0．5％琼脂培养基上，叶正面朝上。培养温度25 cI=，光照强
度 1 600 lx，光照时间 12 h·d～，培养40 d。
培养期间记录 PLB出现的初始时间，每隔5 d统计一次 PLB个数，最后统计诱导出PLB的外植
体数，测量PLB的直径并计算PLB诱导率和外植体平均PLB个数。试验重复3次，取平均值，结果
采用 SPSS软件进行分析。
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PLB诱导率 (％) =诱导出PLB的外植体数／接种的外植体数 ×100，外植体平均 PLB数 =PLB
数／诱导出PLB的外植体数。
1．5 PLB的分化
40 d后 ，将从外植体诱导出的PLB接种于1／2 MS+10％香蕉 +NAA 0．5 mg·L +0．5％琼脂
培养基上，诱导其分化成苗。
2 结果与分析
2．1 创伤预处理对 PLB诱导的影响
外植体经创伤预处理后，PLB诱导效率大幅度提高 (图 1)。无论第 1叶还是第 2叶，经横切 2
刀和刀尖扎 l5次两种预处理后，外植体的PLB诱导率均超过 60％，是其对照的3～4倍。第 1叶和
第 2 nfgt,植体的PLB诱导率在对照和相同创伤预处理中均无显著差异。
对照 横切2刀 刀尖扎1 5次
Control Cut transversely Stabbed 1 5 times
Wvice with blade
图 1 创伤预处理对 PLB诱导率的影响
不同小写字母表示差异显著 (P<0．05)；不同大写字母表示差异极显著 (P<0．叭)。下同。
Fig．1 Efects of wound pretreatments on PLB induction rate
Diferent small letters indicate significant diference at 0．05 level；Diferent capital
letters indicate significant difference at 0．01 leve1．
The same below．
从表 1和图2可知，两种创伤预处理的外植体均比对照提前 10 d诱导出肉眼可见的PLB；在第 1
个 PLB出现后的15 d内，PLB数量均迅速增加，35 d后数量趋于稳定且有部分PLB开始分化出幼叶。
整个培养过程中，PLB数量增加近似呈s形曲线，但在对照中PLB数量增加速度远比创伤预处理的
低。
经过40 d培养后，横切 2刀和用刀尖扎 15次预处理的外植体平均PLB数分别约为对照的4倍或
5倍，差异极显著。表明创伤预处理可以大量增加 PLB的诱导数量，缩短 PLB诱导时间。
表1 创伤预处理对PLB诱导的影响
Table 1 Efects ofwound pretreatments on PLB induction
一
一
甜 一
叶 Ⅻ l ；兰 L
鲫 ∞ 如 ∞ 如 如 0
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‘第1叶对照
×第2叶对照 T T
Control of the 2nd leaf T ／ r——_．
◆第1叶横切2刀 l ， J- ：
·器Cut r ans versely twi
⋯
ce ofthe
：
1 stle af ； _第2叶横切2刀 一_ ／一 ———rallsvefse1vtwicc ofthe 2nd1eaf 上 上
口第l叶刀尖扎15次
， ． ，
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，
．
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叶
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五
·第 次 南 ，
Stabbed 1 5 times ofthe 2nd leaf ，ll
／
／ 盒
I
r／
，
，
同
／
。
一 ：| 一 基 —
O 5 10 15 2O 25 3O 35 4O
接种后天数一d
Days after inoculation
图2 创伤预处理对叶片外植体平均PLB数的影响
Fig．2 Efects of wound pretreatments on average PLB number per leaf explant
对照和创伤预处理的外植体上诱导的 PLB在出现位置上有差别，在大小和形态方面则没有明显
不同。对照的 PLB大部分出现在切口两端，而创伤预处理后的PLB产生在伤口边缘处，沿整个伤口
面分布，两者的 PLB均体积较大，排列较疏松，清晰可辨 (图版，1—4)。
试验中，横切 2刀预处理后外植体上的伤口长度约是对照的4倍，该预处理后外植体上诱导出的
平均 PLB数和单外植体最大 PLB数也约为对照4倍，表明外植体上伤口的长度与 PLB数量呈正相关
关系。
2．2 高渗透压预处理对PLB诱导的影响
外植体经过蒸馏水浸泡2 h后，其 PLB诱导率与不进行任何处理的对照相比没有显著变化，但是
经过 AAM浸泡2 h或0．4 tool·L 甘露醇溶液浸泡2 h后，PLB诱导率大幅度提高。两种高渗溶液预
处理后外植体的 PLB诱导率均超过50％，约为对照的3倍，差异达到极显著水平，但第 1叶和第 2
叶之间的PLB诱导率无明显差异 (图3)。
毒
蓥墨
苎
对照Control }{2O AAM 0．4 mol·L 甘露醇
0．4 mo1·L mannito1
图3 高渗透压预处理2 h对 PLB诱导率的影响
Fig．3 Efects of high osmotic pressure pretreatments for 2 h on PLB induction rate
H 8 6 4
芑母一dx0 矗 鲁jc∞ 0 BJ0爱
豢∞ 霜 彘
∞ ；乏 ∞ 如 ∞ 如 娜 0
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7期 黄 磊等：创伤及高渗透压预处理对蝴蝶兰叶片诱导类原球茎的影响 1043
经两种高渗透压预处理后的外植体诱导出 PLB的时间比对照提前了5 d(表2)。
表2 高渗透压预处理2 h对 PLB诱导的影响
Table 2 Efects of high osmotic pressure pretreatments for 2 h on PLB induction
对照和经高渗透压预处理后的外植体的PLB数量均随着培养时间的延长呈现 S形曲线增加，但
高渗透压预处理后的PLB增加速度远高于对照；0．4 tool·L 甘露醇和 AAM溶液浸泡 2 h预处理的
外植体平均 PLB数均约为对照的4～5倍，两者差异很小；在同一处理或对照中，第 1叶和第 2叶的
平均 PLB数均无显著差异 (图4)。
上述结果说明高渗透压预处理可以大量增加外植体诱导的PLB数量，缩短PLB诱导时间。
蓄蓦
霹 g
羹量
▲第1叶对照
Control ofthe lst leaf
0 5 l0 1 5 2O 25 3O 35 40
接种后天数／d
Days after inoculation
图4 高渗透压预处理2 h对外植体平均PLB数的影响
Fig．4 Efects of hilgh osmotic pressure pretreatments for 2 h on PLB numbers per explant
高渗透压预处理后外植体诱导的PLB与对照诱导的PLB在发生位置、大小和形态方面差别较大。
对照 1和对照2的PLB均出现在切口两端，体积较大，排列较疏松，清晰可辨，而高渗透压预处理
后，PLB不仅出现在切口处呈宽带状簇生，还出现在叶尖、叶缘和叶片中部等其他部位。少部分外植
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体诱导 出的 P L B 形 态大小 和对照相似 ， 大部分外植体诱导 的 P L B 在切 口 处 密集分布 ， 体积较小 ， 不
易区分 (图版 ， 5 ～ 8)。
3
图版说 明 ： 1 ． 对照 ；2 ． 蒸馏 水浸泡 2 h； 3 ． 横切 2 刀 ； 4 ． 刀 尖扎 15 次 ； 5 ． A A M 浸 泡 2 h (切 口 和 叶尖 出现 P L B s)； 6 ． 0． 4 m 0 1 ．
L “ 甘露 醇浸泡 2 h (P L B s 宽带状 隆起 ， 排 列 密集 ， 体积 较小 )；7 ． 0． 4 m ol? L 1 1 甘露醇浸泡 2 h (P L B s 形态 、 大小与对 照 相 似 )： 8．
0． 4 m ol。 L “ 甘露醇浸泡 2 h (P L B s 出现 在 叶 片各部位 )； 9 ． 对 照 和各种预处 理 诱导 的 P L B s 分化成苗 (a ： 对 照 ； b： 横切 2 刀 ： c ：
刀 尖扎 15 次 ； d： A A M 浸泡 2 h； e ： 0． 4 to ol? L “ 甘露 醇 浸泡 2 h)。
E xplanation ofplates ： 1 ． C on trol； 2． Incubated in w ater for 2 h；3 ． C uttran sversely tw ice ；4 ． S tab bed15 tim es ；5 ． Incubatedin A A M for 2 h
(P L B s appear on cutand leaftip)；6 ． Incubated in 0． 4 m ol? L
一 ’
m an nitolfor 2 h (P L B s sw elling like broad belt， sm allin 8ize andassem bling
densely)； 7 ． Incubated in 0． 4 m ol? L
一 ‘
m annitolfor 2 h (the shape and size ofP L B s sim ilar t0 the contr0 1)： 8． Incubated in 0． 4 m 0 1 ． L 一 ’
m an nitolfor 2 h (P L B s appearing everyw here on the leafexplant)； 9 ． D iferen tiation ofP L B s induced from the controland allkinds 0 fD retreat．
m ent (a ： C ontrol； b： C uttransversely tw ice ； C ： S tabbed 15 tim es ； d： Incubated in A A M for 2 h： e ： Incubated in 0． 4 m 0 1 ． L 一 ’ m annitol
f_nr2 h、．
V
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3 讨论
在蝴蝶兰组培中，以叶片为外植体诱导 PLB，再诱导 PLB分化成植株是一条重要的繁殖途径
(Myint et a1．，2006)。前人已对影响蝴蝶兰叶片诱导 PLB的因素进行了一些研究，但主要集中于激
素和有机添加物等培养基成分及其组合对 PLB诱导的影响方面 (杨美纯和周歧伟，2000；陈勇 等，
2004；李成慧 等，2004)，目前尚未见对叶片外植体进行预处理来提高 PLB诱导率的报道。本研究
发现，创伤预处理后，PLB主要出现在伤口边缘的叶表面，并伴随有少量愈伤组织出现，这与前人研
究结果相似 (崔广荣 等，2007)。经横切2刀预处理后，外植体上伤口的长度与 PLB出现的数量呈
正相关关系，这与前人对洋桔梗叶片诱导不定芽的研究结果相似 (杨燕燕 等，2007)。用刀尖扎和
用刀片横切对外植体的影响本质上是相同的，都是增加了单位面积外植体上伤口的长度，表明在叶片
离体培养中，适当增加创伤程度可以提高叶片外植体的脱分化水平。
前人在对水稻和多年生黑麦草的研究中发现，轻度的渗透压处理可以提高愈伤组织的诱导和再生
能力 (高振宇和黄大年，1999；蔡能 等，2007)。本研究也发现，蝴蝶兰叶片外植体经高渗溶液处
理后，其 PLB诱导效率得到了很大提高，并且 PLB出现的时间比对照提早5 d，说明适当的渗透压处
理可以提高植物组织脱分化的敏感性。本研究所使用的两种高渗溶液中，AAM含有丰富的蔗糖和葡
萄糖，总糖浓度为0．4 mol·L (Hiei et a1．，1994)。糖既可以作为碳源被植物组织利用，又可以作
为渗透压调节剂对外植体产生渗透压胁迫；而甘露醇是生理惰性物质，不能被植物组织吸收利用，只
能作为渗透压调节剂起作用 (刘月学和林顺权，2002)，理论上，0．4 mol·L 的甘露醇溶液与AAM
所产生的渗透压是相同的。本研究结果表明，0．4 mol·L 的甘露醇溶液和 AAM预处理对外植体诱
导 PLB的影响是一致的，说明浸泡后影响外植体 PLB诱导率的关键因素是渗透压。
经创伤和高渗透压两类预处理后，外植体上诱导出的 PLB在发生位置 、形态和体积等方面有所
不同。创伤预处理后诱导出的 PLB只沿外植体伤口边缘呈宽带状分布，单个 PLB较大，清晰可辨；
高渗透压预处理后外植体诱导出的PLB不仅出现在切口处，还有一些出现在叶尖、叶缘和叶片中部
等其他部位，有的呈宽带状隆起，排列密集，单个 PLB体积较小，不易区分。造成其位置差异的原
因可能如下，利用锋利的刀片进行创伤预处理后，外植体上受到创伤刺激影响的细胞可能主要集中在
切口表面，远离切口处的叶肉细胞受到的影响较小，而只有受到较大刺激影响的细胞才会发生某些生
理变化，最后脱分化产生 PLB，因而所产生的 PLB主要集中出现在伤口边缘；高渗透压预处理时是
将全部外植体浸泡在高渗溶液中，外植体在高渗溶液中会发生脱水作用，而整个外植体中的水分会从
水势高的细胞向水势低的细胞流动，因而受到脱水影响的细胞除了切口表面的细胞外，远离切口处的
细胞也会受到较大的影响，而因脱水作用可能会使细胞的生理状态发生改变，从而刺激产生 PLB，所
以经高渗透压溶液处理后的外植上的多个部位会诱导出PLB，但由于切口附近的细胞受到脱水作用的
影响最大，因而PLB还是主要集中于切口处。至于创伤和高渗透压溶液处理是如何具体影响 PLB发
生、形态、体积差异的原因还需要进一步研究。
外植体经创伤和高渗透压两类预处理诱导出的 PLB在转移到分化培养基以后，均能够正常分化，
且幼苗形态和对照没有差别 (图版，9)。但在开花性状或品质上是否会有差别还需进一步栽培观察，
并根据最后的观察结果才能确定该方法在蝴蝶兰种苗繁殖上的可行性。
本研究表明，创伤和高渗透压预处理可以显著提高外植体的PLB诱导效率，特别是创伤预处理，
操作简单，效果较好。这两类预处理，在蝴蝶兰叶片诱导 PLB的研究中尚属首次报道，研究结果对
提高蝴蝶兰离体器官 PLB诱导效率有重要的指导意义。
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