全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (2) : 195 - 200
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 06 - 07; 修回日期 : 2007 - 12 - 04
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671441, 30600416) ; 国家 ‘863’项目 (2006AA10Z1B6)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: rschan@ cau1edu1cn)
山葡萄性别相关 AFL P标记筛选及 SCAR标记转化
唐美玲 1, 2 , 孔　瑾 1 , 许雪峰 1 , 沈育杰 3 , 王　忆 1 , 李天忠 1 , 韩振海 13
(1 中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100094; 2 烟台市农业科学研究院果树研究所 , 山东烟台 265200; 3 中国农业
科学院特产研究所 , 吉林左家 132019)
摘 　要 : 通过 AFLP分子标记方法 , 应用 64对引物组合 EcoRⅠ2NNN /M seⅠ2NNN对山葡萄雌花、雄花
和两性花植株基因池进行筛选 , 引物 E2AGC /M 2CTG在雄花和两性花植株基因池 DNA中扩增出一条分子量
为 283 bp的特异性条带 ; 经组池个体和其它品系验证 , 该特异性条带能在雄株和完全植株中稳定出现。将
该特异性条带回收、克隆、测序 , 设计 SCAR标记引物 , 对已知性别的 85份山葡萄种质进行盲测 , 准确率
达到 9716% , 表明标记转化成功。由于该 SCAR标记在绝大多数山葡萄栽培品种和有育种价值的种质资源
中得到验证 , 可利用该 SCAR标记对山葡萄杂交后代在苗期进行性别鉴定 , 提高育种效率。
关键词 : 山葡萄 ; 性别 ; AFLP; SCAR; 分子标记
中图分类号 : S 66311　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0220195206
Screen ing of the AFL P M arkers A ssoc ia ted to the Sex L ocus of V itis am u ren2
sis Rupr. and Its Conversion to SCAR M arker
TANG Mei2ling1, 2 , KONG J in1 , XU Xue2feng1 , SHEN Yu2jie3 , WANG Yi1 , L I Tian2zhong1 , and HAN
Zhen2hai13
(1 Institu te of Horticultural P lants, Ch ina A gricu ltura l U niversity, B eijing 100094, China; 2 Fruit Institu te, Yan ta i A gricu ltura l
Science and Technology Institu te, Yantai, Shandong 265200, China; 3 The Institu te of Specia l Econom ic A nim al and Plan t Sci2
ences, Chinese A cadem y of A gricultural Sciences, Zuojia, J ilin 132019, Ch ina)
Abstract: Due to its resistant characters to cold, insect and disease, V itis am urensis Rup r. is one of the
most important germp lasm resource in grape breeding. It has male, female and hermaphrodite phenotype, but
only hermaphrodite is suitable for commercial p roduction. AFLP ( amp lifled fragment length polymorphism )
was app lied to identify markers associated with V itis am urensis Rup r. sex type. By app lication of 64 markers in
the screening, E2AGC /M 2CTG was found to amp lify a specific 283 bp fragment in male and hermaphrodite
pool. According to its sequencing result, SCAR ( sequence characterized amp lified region) p rimers were de2
signed, and the p rimers gave the expected band in 9716% of the tested 85 cultivars of V itis am u rensis Rup r.
It suggested that the SCAR marker will be useful in the seedling stage marker2assistant selection for breeding
with the resistant V itis am urensis Rup r.
Key words: V itis am u rensis Rup r. ; sex; AFLP; SCAR; molecular marker
性别相关的分子标记研究对育种和性别控制基因的克隆有重要意义。目前 , 在果树上已经利用分
子标记进行性别鉴定的有番木瓜 Caricpapaya L. (Deputy et al. , 2002; U rasaki et al. , 2002; 任朝兴
等 , 2007)、猕猴桃 A ctin id ia ch inensis (Harvey et al. , 1997) 和银杏 Ginkgo biloba (王晓梅 等 , 2001)
等。Dalbo等 (2000) 在构建葡萄连锁遗传图谱时筛选到两个与雄花相关的分子标记 ( GY104和
VVS3) , 但是连锁关系不紧密 , 没有确定与性别基因的遗传距离。R iaz等 ( 2006)、Lowe和 W alker
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
(2006) 利用 V itis rupestris ×V. a rizon ica杂交群体和葡萄砧木 Ram sey (V. cham pin ii) ×R iparia Gloire
(V. ripa ria) 杂交后代构建葡萄的连锁图谱 , 将控制葡萄性别的基因座定位于父本的第 2号连锁群
上 , 并且都筛选到两个与之连锁的 SSR分子标记 (VVMD34和 VV IB23)。Riaz等 (2006) 的研究结果
表明 VV IB23和 VMD34位于控制性别的基因座的两侧 , 遗传距离分别是 1159和 5195 cM。而 Lowe和
W alker (2006) 的结果则是 VV IB23和 VVMD34与性别控制基因座的遗传距离分别是 115和 712 cM。
山葡萄 (V. am urensis Rup r. ) 是葡萄属中最抗寒的一个种 , 而且对多种欧亚种群易感的病害有
较强的抵抗力 , 是目前国内外葡萄抗寒和抗病育种的主要种质资源。而野生山葡萄一般为雌雄异株 ,
两性花类型极为罕见。在杂交育种中多是利用山葡萄雌花作母本或雄花作父本与其他品种杂交 , 其杂
交后代会产生花型分离现象。山葡萄雄花植株除作为育种材料外在生产上没有应用价值 , 而栽培雌花
品种必须配置授粉树。目前常规育种中多采用形态观察来判别性别 , 费时费力且效率低。如果能够找
到与性别基因连锁的分子标记 , 既可以提早鉴定植株性别 , 保留有利用价值的品系 , 又能对杂交后代
进行分子标记辅助选择 , 缩短育种时间 , 提高育种效率。作者利用 AFLP分子标记技术 , 筛选与山葡
萄性别相关的分子标记 , 同时将其转化为简单实用的 SCAR标记 , 可加快葡萄育种进程。
1　材料与方法
111　材料
植物材料采自中国农业科学院特产研究所的山葡萄种质资源圃。取山葡萄幼嫩叶片 , 液氮速冻后
保存于 - 80 ℃冰箱中 , 用于筛选 AFLP分子标记的材料编号 1～15, 验证 AFLP标记的材料编号 66～
68、73～75、17～24, 而验证 SCAR标记的材料编号 1～85 (表 1)。
112　试验方法
11211　基因组 DNA的提取和基因池的构建 　利用 CTAB 法提取葡萄基因组 DNA。将每份种质的
DNA定量至 100 ng·μL - 1 , 分别取 5份雄花、5份雌花和 5份两性花植株等量 DNA组成雌花、雄花
和两性花 3个基因池 , 用于筛选具有多态性的引物。
11212　AFLP反应体系的建立和引物筛选 　AFLP反应体系参照 Vos等 (1995) 的方法。利用表 2中
的 8个 EcoRⅠ2NNN引物和 8个 M seⅠ2NNN引物任意组合成 64对引物 , 对雌花、雄花和两性花基因
池进行 AFLP分子标记筛选。
11213　特异带的回收、克隆及测序 　从聚丙烯酰胺凝胶上回收特异带至 015 mL离心管中 , 加 20μL
TE溶解过夜 , 沸水浴 15 m in, 12 000 r·m in - 1离心 10 m in。取 2μL上清液为模板 , E2AGC /M 2CTG为
引物进行 PCR再扩增 , 循环参数同 AFLP预扩增程序。PCR产物经 210%的琼脂糖凝胶电泳检测 , 将
扩增的片段与回收的特异带大小一致者 , 连接 pGEM 2T easy载体 , 挑取单菌落经 PCR鉴定后 , 由北
京百泰克公司进行测序。
11214　SCAR标记引物的设计及扩增 　根据 AFLP标记片段的序列 , 利用 Primer Prem ier 510软件在不
同区域设计 3对 SCAR引物。引物 1: 5′2TGG GTT TTC CCA AAG ATG TG23′, 5′2AAC GGA ATC TAC
CAG AAA TTG AC23′; 引物 2: 5′2GGG TTT TCC CAA AGA TGT23′, 5′2TTA ACT GTG CAG ACT ACT
GT23′; 引物 3: 5′2GAA TTC AGC ACA AGT TGT - 3′, 5′2GAA GAA ATA ACG GAA TCT AC23′。由上
海生工生物工程技术服务有限公司合成引物。
PCR扩增体系 25μL, 其中包含 10 ×Buffer 215μL, dNTP ( 10μmol·L - 1 ) 1μL , 引物 ( 10
μmol·L - 1 ) 1μL, 基因组 DNA 100 ng, Taq DNA聚合酶 1 U。扩增程序为 : 94 ℃预变性 3 m in; 94 ℃
30 s, 62 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 m in, 5个循环 ; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 m in, 5个循环 ; 94 ℃
30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 m in, 20个循环 ; 72 ℃ 10 m in。试验过程中设置了不同退火温度 52、54、
56、58、60和 62 ℃。
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　2期 唐美玲等 : 山葡萄性别相关 AFLP标记筛选及 SCAR标记转化 　
表 1　筛选与山葡萄性别相关的 AFL P标记和 SCAR标记的山葡萄种质
Table 1　Grape var ieties for AFL P marker screen ing and SCAR marker testing
编号
No.
品系
Variety
花型
Sex type
编号
No.
品系
Variety
花型
Sex type
编号
No.
品系
Variety
花型
Sex type
1 长白 9号 Changbai 9 雌花 Female 30 75021 雌花 Female 59 14 雌花 Female
2 85010 雌花 Female 31 75103 雌花 Female 60 75124 雌花 Female
3 左山一 Zuoshan Yi 雌花 Female 32 73069 雌花 Female 61 75041 雌花 Female
4 左山二 Zuoshan Er 雌花 Female 33 73062 雌花 Female 62 75059 雌花 Female
5 通化 10号 Tonghua 10 雌花 Female 343 75050 雌花 Female 63 73124 雌花 Female
6 123 雄花 Male 35 73063 雌花 Female 64 89006 雌花 Female
7 901 雄花 Male 36 73080 雌花 Female 65 76048 雌花 Female
8 73061 雄花 Male 37 75016 雌花 Female 66 122 雄花 Male
9 19 雄花 Male 38 7520 雌花 Female 67 75047 雄花 Male
10 85003 雄花 Male 39 75031 雌花 Female 68 75134 雄花 Male
11 8558810 两性花 Hermaphrodite 40 75095 雌花 Female 69 73077 雄花 Male
12 8558808 两性花 Hermaphrodite 41 75135 雌花 Female 70 41 雄花 Male
13 双丰 Shuangfeng 两性花 Hermaphrodite 42 75097 雌花 Female 71 42 雄花 Male
14 双优 Shuangyou 两性花 Hermaphrodite 43 73096 雌花 Female 72 43 雄花 Male
15 双红 Shuanghong 两性花 Hermaphrodite 44 85009 雌花 Female 73 8558816 两性花 Hermaphrodite
163 通化 1号 Tonghua 1 雌花 Female 45 75084 雌花 Female 74 8558825 两性花 Hermaphrodite
17 75121 雌花 Female 46 76045 雌花 Female 75 086707 两性花 Hermaphrodite
18 通化 2号 Tonghua 2 雌花 Female 47 7400327 雌花 Female 76 086708 两性花 Hermaphrodite
19 通化 12号 Tonghua 12 雌花 Female 48 73076 雌花 Female 77 086913 两性花 Hermaphrodite
20 73092 雌花 Female 49 75132 雌花 Female 78 8558804 两性花 Hermaphrodite
21 75121 雌花 Female 50 75115 雌花 Female 79 8558806 两性花 Hermaphrodite
22 75083 雌花 Female 51 85005 雌花 Female 80 4N1 两性花 Hermaphrodite
23 75049 雌花 Female 52 73200 雌花 Female 81 4N2 两性花 Hermaphrodite
24 75048 雌花 Female 53 75052 雌花 Female 82 4N3 两性花 Hermaphrodite
25 75074 雌花 Female 54 75023 雌花 Female 83 752200 两性花 Hermaphrodite
26 73033 雌花 Female 55 75006 雌花 Female 84 754137 两性花 Hermaphrodite
27 73093 雌花 Female 56 75122 雌花 Female 85 086706 两性花 Hermaphrodite
28 75069 雌花 Female 57 73065 雌花 Female
29 73130 雌花 Female 58 75100 雌花 Female
　　注 : 3 为 SCAR标记出现错误扩增的种质 (在该雌花品种中扩增出特异性条带 )。
Note: The SCAR p rimers give the unexpected band in female varieties labelled with 3 (No bands should appear in this female varieties, but
special band appeared in this variety) .
表 2　筛选 AFL P分子标记的引物序列
Table 2　The sequences of AFL P pr im ers screened
EcoRⅠ引物
EcoRⅠ p rimer
引物序列
Primer sequence
M seⅠ引物
M se Ⅰ p rimer
引物序列
Primer sequence
E1 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CAG C23′ M1 5′2GAT GAG TCC TGA GTA ACA A23′
E2 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CAG G23′ M2 5′2GAT GAG TCC TGA GTA ACA C23′
E3 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CAA G23′ M3 5′2GAT GAG TCC TGA GTA ACA G23′
E4 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CAC T23′ M4 5′2GAT GAG TCC TGA GTA ACA T23′
E5 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CAC A23′ M5 5′2GAT GAG TCC TGA GTA ACT G23′
E6 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CAC G23′ M6 5′2GAT GAG TCC TGA GTA ACT A23′
E7 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CAA C23′ M7 5′2GAT GAG TCC TGA GTA ACT C23′
E8 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CAC C23′ M8 5′2GAT GAG TCC TGA GTA ACT T23′
2　结果与分析
211　AFL P分子标记的筛选
将表 2中的 8个 EcoRⅠ2NNN和 8个 M seⅠ2NNN引物任意组成 64对引物 , 对山葡萄的雄花、雌
花和两性花 DNA池进行扩增 , 得到 5 120条带 , 平均每对引物扩增出 80条带。其中有 5对引物在 3
个基因池中表现出多态性 , 分别为 E2AGC /M 2CTG、E2AGG/M 2CAT、E2AGC /M 2CTT、E2AAG/M 2CTC
和 E2AGC /M 2CAT (图 1)。
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图 1　5对引物组合在雌花、雄花和两性花基因池中的扩增结果
F: 雌花 ; M: 雄花 ; H: 两性花。
F ig. 1　PAGE electrophoresis of 5 pa irs of AFL P markers products in fema le, ma le and hermaphrod ite D NA pools
F: Female; M: Male; H: Hermaphrodite.
利用这 5对引物对 15个个体进行 PCR扩增验证 , 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果发现只有引物组
合 E2AGC /M 2CTG与雄花和两性花表型相关 (图 2) , 初步认为该标记与山葡萄性别相关 , 定名为
AG1。
利用另外 14份已知性别的山葡萄种质资源来验证 AG1, 结果表明该标记的确只在雄花和两性花
植株中有特异性扩增产物 , 大小为 283 bp, 而在雌花中未见该特异性条带 (图 3)。
212　特异带的回收、克隆及测序
从聚丙烯酰胺凝胶中回收雄花和两性花植株中扩增的特异带 , 利用引物 E2AGC /M 2CTG进行二次
PCR扩增。对该片段回收、克隆和测序 , 序列如图 4所示 , 全长 283 bp。
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　2期 唐美玲等 : 山葡萄性别相关 AFLP标记筛选及 SCAR标记转化 　
图 4　E2AGC /M 2CTG的特异性扩增片段序列
黑体表示 AFLP引物 E2AGC /M2CTG序列 ; 下划线标记的为 SCAR特异引物序列。
F ig. 4　D NA sequence of spec if ic am plif ica tion product of the AFL P pr im ers of E2AGC /M 2CTG
The sequence in bold is the sequence of the E2AGC /M2CTG p rimers; The underlined is the sequence of SCAR p rimers.
213　SCAR引物的设计及 PCR扩增
根据 AFLP标记片段的全序列 , 利用 Primer Prem ier 510软件在不同的区域设计 3对 SCAR引物。
对表 1中的前 15份种质进行 SCAR标记的验证。引物 1: 不包含酶切位点。进行 PCR扩增时设置了
不同退火温度梯度 , 不论如何升高退火温度 , 引物 1在所供试的 15份种质中都能扩增出大小相同的
条带 , 没有多态性。引物 2: 反向引物包含 M seⅠ酶切位点 , 正向引物根据 Primer 510在序列内部进
行设计 , 退火温度 52 ℃时除了供试的雄花和两性花有特异性条带之外个别雌花品系也有扩增条带。
当退火温度为 56 ℃时雌花中没有扩增产物 , 但雄花和两性花中扩增产物弥散现象严重 , 采用降落
PCR, 提高 PCR反应的特异性。引物 3: 正向引物包含 EcoRⅠ酶切位点 , 反向引物根据 Primer 510进
行设计 , 结果发现 , 在供试的 15份种质中均能扩增出大小相同的条带。
214　SCAR标记的验证
利用特异性引物 2对另外已知性别的 70份种质进行盲测 , 2%琼脂糖电泳检测结果如图 5所示
(包括引物 2对表 1中前 15份种质的扩增结果 ) , 在 12份雄花和 18份两性花植株中扩增出长度为 220 bp
图 5　SCAR标记在 85份山葡萄种质中的扩增情况
CK: 阴性对照 ; F: 雌花 ; M: 雄花 ; H: 两性花 ; M: DL 2000 marker。
F ig. 5　The am plif ica tion of the 85 var ieties of V itis am u rensis Rupr. by the SCAR pr im ers
CK: Negative control; F: Female; M: Male; H: Hermaphrodite; M: DL 2000 marker.
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的特异性片段 , 供试的 55份雌花品种中 , 53份没有出现该特异性条带 , 准确率为 9716%。
3　讨论
虽然 AFLP标记具有多态性强、检测信息量大等优点 , 但也具有操作程序复杂、成本高等缺点。
因此 , 有必要将与山葡萄性别相关的 AFLP标记转化为简单实用的 SCAR标记。
AFLP特异性条带的产生 , 原因有 3个 : (1) 由于插入或缺失引起扩增片段长度的差异 ; (2) 由
于酶切位点内部的插入或缺失造成扩增片段有无的差异 ; (3) 由于酶切位点的点突变造成扩增片段
长短的差异。为了将 AFLP标记转化为 SCAR标记 , 设计了 3对引物 : 引物 1不包含酶切位点 , 扩增
结果没有多态性且片段大小相同 , 说明该 AFLP标记的产生不是由于酶切片段内发生缺失或插入造成
的扩增片段长度多态性 , 而有可能是酶切位点内发生碱基插入或点突变。引物 3包括 EcoRⅠ的酶切
位点 , 但扩增结果也没有多态性 , 产生的片段长度相同 , 所以排除了 EcoRⅠ酶切位点发生突变或插
入。引物 2包含 M seⅠ酶切位点 , 扩增结果除了雄花和两性花有特异性条带之外 , 有些雌花品种也能
扩增出该特异性条带 ; 将退火温度提高到 60 ℃后发现 , 引物 2只在雄花和两性花中有扩增产物 , 雌
花没有 , 但是扩增的主带弥散严重 , 于是采用降落 PCR将最高退火温度提高到 62 ℃, 扩增产物就是
单一特异性条带 , 由此推测该 AFLP标记的产生很可能是在 M seⅠ酶切位点发生点突变引起的。
研究通过限定不同区域设计引物和调整 PCR反应条件 , 将与山葡萄性别相关的 AFLP分子标记转
化为 SCAR标记 , 扩增得到的片段为 220 bp, 比原有 AFLP标记长度 283 bp要短 , 但经过测序比对与
AFLP标记片段序列一致 , 并且对已知性别的 85份山葡萄种质资源进行盲测 , 准确率达到 9716% ,
说明标记转化成功。本研究所筛选的 SCAR标记在山葡萄多数栽培品种和有育种价值的山葡萄种质资
源中得到了验证 , 证明其确实与山葡萄的雄花和两性花表型相关。利用已发表的与葡萄性别连锁的
SSR标记在山葡萄中进行验证 , 未发现多态性 , 同时该 SCAR标记在欧亚种葡萄中进行验证 , 准确率
也很低。因此该 SCAR标记可用于山葡萄分子标记辅助育种 , 对以山葡萄两性花与雌花杂交组合的后
代在苗期进行性别快速选择 , 区分雌花和两性花 , 能够节约大量的人力、物力和财力 , 提高育种效率。
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