全 文 ：园 艺 学 报 2006, 33 (1) : 179～181
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 03 - 03; 修回日期 : 2005 - 04 - 27
基金项目 : 教育部科学技术研究重点项目 (03098)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jianp ingluo@ sohu1com)
金属离子对霍山石斛类原球茎增殖及植株再生的影响
查学强 罗建平 3 石 玮 姜绍通
(合肥工业大学生物与食品工程学院 , 合肥 230009)
摘 要 : 采用单因素浓度试验和正交试验研究了 Mg2 + 、Ca2 + 、Fe2 + 、Mn2 +和 Zn2 +离子对液体培养霍
山石斛类原球茎增殖的影响。结果表明 , 5种金属离子对类原球茎增殖影响的主次顺序为 Fe2 + >Mn2 + >
Mg2 + > Ca2 + > Zn2 + , 促进类原球茎增殖的优化组合为 Mg2 + 115 mmol·L - 1、Ca2 + 415 mmol·L - 1、Fe2 + 011
mmol·L - 1、Mn2 + 015 mmol·L - 1、Zn2 + 0106 mmol·L - 1。经优化的液体培养基增殖的类原球茎能保持植株再
生能力 , 平均每克类原球茎增殖后可再生植株 1 98512株 , 是相同时间内对照类原球茎再生植株数的 412倍。
关键词 : 霍山石斛 ; 类原球茎 ; 金属离子 ; 液体培养 ; 植株再生
中图分类号 : S 68814 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0120179203
Effects of M eta l Ion s on Protocorm 2like Body Prolifera tion in L iqu id Culture
of D endrobium huoshanense and Plan tlet Regenera tion
Zha Xueqiang, Luo J ianp ing3 , ShiW ei, and J iang Shaotong
(D epartm ent of B iotechnology and Food Engineering, Hefei U niversity of Technology, Hefei 230009, China)
Abstract: This research is concerned with op tim ization ofMg2 + , Ca2 + , Fe2 + , Mn2 + and Zn2 + for p ro2
tocorm 2like body p roliferation in liquid culture of D endrobium huoshanense by one factor2at2a2time and orthogo2
nal matrix methods. Results showed that, excep t for Zn2 + , the effects of other metal ions on PLB p roliferation
were significant and the order was Fe2 + >Mn2 + >Mg2 + > Ca2 + > Zn2 + . The op timal concentration combina2
tion for PLB p roliferation was determ ined as 115 mmol·L - 1 Mg2 + , 415 mmol·L - 1 Ca2 + , 011 mmol·L - 1
Fe2 + , 015 mmol·L - 1 Mn2 + and 0106 mmol·L - 1 Zn2 + . Proliferated PLB s remained the potential of p lant re2
generation. The amount of regenerated p lantlets from per gram PLB s through p roliferation in op tim ized liquid
medium was 1 98512 and was about 412 times that from PLB s that p roliferated on original medium.
Key words: D endrobium huoshanense; Protocorm2like bodies ( PLB s) ; Metal ion; L iquid culture; Pla2
ntlet regeneration
1 目的、材料与方法
霍山石斛 (D endrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J Cheng) 是产于安徽霍山及邻近地区的兰
科石斛属植物 , 具有独特的药用价值和极高的观赏价值〔1〕。霍山石斛生境特殊 , 加上连续多年的乱
采滥挖 , 野生资源几乎绝灭〔2〕。从 20世纪 80年代开始 , 人们对其种子试管苗萌发和移栽做了不少工
作 , 但种子来源有限且繁殖系数低〔3〕。我们以种子试管苗茎段外植体为材料在诱导获得类原球茎
(p rotocorm2like bodies, PLB s) 和 PLB s增殖的基本培养基筛选的基础上〔4, 5〕, 拟通过大量液体培养的
PLB s再生植株规模化生产组培苗。本试验对液体培养中影响 PLB s增殖的 5种金属离子 ( Ca2 + 、
Mg2 + 、Fe2 + 、Mn2 +和 Zn2 + ) 浓度进行优化 , 并考察了优化培养基对 PLB s再生植株的影响。
以 MS为基本培养基 , 其中蔗糖 35 g·L - 1、硝酸钾 30 mmol·L - 1、维生素 B1 1 mg·L - 1 , 不含
园 艺 学 报 33卷
硝酸铵和植物生长调节剂 , 其它组分浓度为标准 MS的 50% , Mg2 + 、Ca2 + 、Fe2 + 、Mn2 +和 Zn2 +等 5
种金属离子分别用氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰和硫酸锌配置成不同浓度水平 (表 1) 做单因
素试验 , 确定有效浓度范围。5种金属离子浓度的组合优化按 L27 ( 313 ) 正交表设计试验。取 8 g
PLB s接种于盛 70 mL液体培养基的 250 mL三角瓶中 , 120 r·m in - 1的水平旋转摇床上培养 30 d, 收
获 PLB s。PLB s的植株再生设 4种不同方式 : 即经 MS固体培养基、MS液体培养基、优化的固体培养
基和优化的液体培养基增殖 30 d后转入 1 /2MS固体培养基光照下再生植株 , 其中苗分化 60 d, 根再
生 40 d, 生根培养基为固体 MS + 20%的香蕉提取液。培养温度均为 ( 25 ±2) ℃。每组至少 3次重
复。PLB s增殖以生长参数表示 , 生长参数 = (收获类原球茎质量 -接种量 ) /接种量 , 再生植株总数
=增殖 30 d的类原球茎量 ×每克类原球茎分化 60 d的长苗数 ×生根诱导 40 d的生根率。数据统计处
理用 SPSS 1210软件。
2 结果与分析
211 M g2 + 、Ca2 + 、Fe2 + 、M n2 +和 Zn2 +单因素对 PL Bs增殖的影响
如表 1所示 , 适合 PLB s生长增殖的培养基 Mg2 +浓度在 115～510 mmol·L - 1之间 , Ca2 +的适宜浓
度为 310～610 mmol·L - 1 , Fe2 + 、Mn2 +和 Zn2 +适宜的浓度分别为 013、015和 0103 mmol·L - 1 , 当浓
度过高时 , PLB s增殖缓慢甚至死亡。分析表明 5种金属离子在不同浓度下 PLB s增殖表现明显差异 ,
在适合浓度范围内可以使 PLB s增殖比标准 MS (含 Mg2 + 115 mmol·L - 1、Ca2 + 310 mmol·L - 1、Fe2 +
011 mmol·L - 1、Mn2 + 011 mmol·L - 1和 Zn2 + 0103 mmol·L - 1 , 生长参数为 218) 提高 3211% ～
4614%。
表 1 M g2 + 、Ca2 + 、Fe2 +、M n2 +和 Zn2 +对液体培养中霍山石斛 PL Bs增殖的影响
Table 1 Effects of M g2 + , Ca2 + , Fe2 + , M n2 + and Zn2 + on PL Bs prolifera tion in liqu id culture of D endrobium huoshanense
Mg2 +
(mmol·
L - 1 )
生长参数
Growth index
Ca2 +
(mmol·
L - 1 )
生长参数
Growth index
Fe2 +
(mmol·
L - 1 )
生长参数
Growth index
Mn2 +
(mmol·
L - 1 )
生长参数
Growth index
Zn2 +
(mmol·
L - 1 )
生长参数
Growth index
0 119 ±0116 a 0 211 ±0114 b 0 210 ±0115 b 0 215 ±0115 a 0 211 ±0114 a
0175 313 ±0114 c 0175 217 ±0115 c 01015 216 ±0110 c 01015 219 ±0108 b 01015 312 ±0115 bc
1150 319 ±0115 d 1150 313 ±0112 d 01030 218 ±0109 c 01030 310 ±0111 bc 01030 317 ±0115 d
3100 411 ±0113 d 3100 316 ±0122 de 01050 313 ±0115 d 01050 313 ±0115 cd 01050 316 ±0107 cd
4150 318 ±0122 d 4150 319 ±0115 e 01060 314 ±0113 d 01060 314 ±0109 cd 01060 316 ±0122 cd
5100 318 ±0113 d 5100 316 ±0118 de 01100 315 ±0114 d 01100 315 ±0118 cd 01100 313 ±0118 bc
6100 314 ±0118 c 6100 315 ±0112 d 01300 410 ±0122 e 01300 316 ±0113 de 01300 312 ±0111 b
10100 313 ±0128 c 10100 212 ±0124 b 01500 313 ±0118 d 01500 318 ±0106 e 01500 311 ±0107 b
20100 217 ±0119 b 20100 116 ±0123 a 11000 116 ±0107 a 11000 312 ±0114 bc 11000 212 ±0121 a
注 : 相同栏不同字母标记的数值在 P = 0105水平差异显著。
Note: The data with different letters in the same item indicate significant differences at P = 0105 level.
212 正交试验
在单因素试验确定的适合浓度范围内 , 运用正交试验优化最适 PLB s增殖的 5种金属元素组合 ,
表明 Mg2 + 115 mmol·L - 1、Ca2 + 415 mmol·L - 1、Fe2 + 011 mmol·L - 1、Mn2 + 015 mmol·L - 1和 Zn2 +
0106 mmol·L - 1的组合对 PLB增殖最好。方差分析表明除 Zn2 +外 , Mg2 + 、Ca2 + 、Fe2 +和 Mn2 +对原球
茎生长的影响均显著 , 5种离子对 PLB增殖数影响大小的主次顺序为 Fe2 + >Mn2 + >Mg2 + > Ca2 + >
Zn2 + 。理论计算的促进 PLB s生长的最优水平组合与试验得到的最优水平组合相符 , 经验证得到的
PLB s生长参数为 513, 比优化前提高 6818% , 比标准 MS培养基提高 8913%。
213 PL Bs植株再生
茎段外植体诱导的 PLB s分 4种方式增殖和诱导植株再生 (表 2)。PLB s在固体 MS培养基上培养
以分化为主 , PLB s增殖较少。当 PLB s在液体培养基中或固体培养基暗处培养时都能较快地增殖 , 与
固体培养相比 , 液体培养能更有效地促进 PLB s增殖。增殖的 PLB s转入 1 /2MS固体培养基光照培养
081
1期 查学强等 : 金属离子对霍山石斛类原球茎增殖及植株再生的影响
(16 h·d - 1 ) , 20 d后开始萌发长出不定芽 (图版 , 1)。继续培养 40 d长出健壮的再生苗 (图版 , 2
和 3)。再生苗转入生根培养基培养 20 d生根启动 , 继续培养 20 d形成根系较好的植株 (图版 , 4)。
4种培养方式对 PLB s的植株再生能力有显著影响 , 相同时间内从再生植株总数角度考虑 , 以 1 g
PLB s为起始材料 , 优化的液体培养基增殖后进行植株再生 , 平均再生植株总数可达到 1 98512株 , 分
别是其它 3种培养方式的 412倍、117倍和 215倍 , 大大提高了繁殖系数。
表 2 PL Bs不同培养方式植株再生的比较
Table 2 Com par ison am ong capab ility of PL Bs regenera ting plan ts in d ifferen t culture m ethod
繁殖方式
Propagation
method
起始 1 g PLB s增殖
30 d收获量
Harvest of the initial
PLB s(1 g) after
30 d of p roliferation
( g)
PLB s再生苗
Shoots regenerated from PLB s
苗再生率
Frequency
of shooting
( % )
1 g PLB s长
苗数 No. of
shoots per
gram PLB s
苗高
Shoot
height
( cm)
PLB s再生苗生根
Rooting of shoots from PLB s
生根率
Frequency
of rooting
( % )
1株苗生根
数 No. of
roots per
shoot
根长
Root
length
(mm)
起始 1 g PLB s再生
植株总数
Total number of
p lantlets from the
initial 1 g of PLB s
固体 MS Solid MS
215a
10010
20610a
411
9112
312
711
46917a
液体 MS L iquid MS
412b
10010
31511b
317
9013
219
618
1 19510c
优化的固体培养基
Op tim ized solid medium
218a
10010
32014b
315
8711
218
616
78114b
优化的液体培养基
Op tim ized liquid medium
613c
10010
35019b
319
8918
217
618
1 98512d
注 : 同列栏不同字母标记的数值在 P = 0105水平差异显著。
Note: The data with different letters in the same item indicate significant differences at P = 0105 level.
参考文献 :
1 包雪声 , 顺庆生 , 陈立钻. 中国药用石斛. 上海 : 复旦大学出版社 , 2001. 1～75
Bao X S, Shun Q S, Chen L Z. Medical D endrobii in China. Shanghai: Fudan University Press, 2001. 1～75 ( in Chinese)
2 刘守金 , 武祖发 , 梁益敏 , 刘业飞. 霍山石斛的资源及生物学特性. 中药材 , 2001, 24 (10) : 709～710
L iu S J, W u Z F, L iang YM, L iu Y F. Resource and biology character of D endrobium huoshenense. ChineseMedicinalMaterials, 2001, 24
(10) : 709～710 ( in Chinese)
3 罗建平 , 查学强. 药用石斛可持续开发途径探讨. 中草药 , 2003, 34 (增刊 ) : 280～282
Luo J P, Zha X Q. D iscussion of sustainable exp loitation on medicinal D endrobii. Chinese Traditional and Herbal D rugs, 2003, 34 ( Sup. ) :
280～282 ( in Chinese)
4 罗建平 , 查学强 , 姜绍通. 药用霍山石斛原球茎的液体悬浮培养. 中国中药杂志 , 2003, 28 (7) : 611～613
Luo J P, Zha X Q, J iang S T. Suspension culture of p rotocorm2like bodies from the endangered medicinal p lant D endrobium huoshanenese.
China Journal of Chinese Materia Medica, 2003, 28 (7) : 611～613 ( in Chinese)
5 查学强 , 罗建平. 霍山石斛原球茎液体培养的营养调节. 合肥工业大学学报 (自然科学版 ) , 2004, 27 (1) : 53～57
Zha X Q, Luo J P. Nutrient requirement for growth and polysaccharide accumulation in liquid cultures of p rotocorm2like bodies of D endrobium
huoshanense. Journal of Hefei University of Technology (Natural Science Edition) , 2004, 27 (1) : 53～57 ( in Chinese)
图版说明 : 1. 类原球茎芽的分化 ; 2, 3. 苗的发育和生长 (丛生苗 ) ; 4. 再生植株。
Explana tion of pla tes: 1. Adventitious shoots differentiated from PLBs; 2, 3. Growth of shoots (multip le shoots) ; 4. Complete regenerated p lantlets.
181