全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (5) : 701 - 706
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 12 - 20; 修回日期 : 2008 - 04 - 30
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671319) ; 中荷园艺作物基因组分析联合实验室运行项目 (1251601001) ; 国家重点基础研
究发展计划项目 (2006cb101907 ) ; 中荷战略联盟项目 (2004CB720405)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: dyqu@mail1caas1net1cn; huangsanwen@caas1net1cn)
无选择标记的植物表达载体的构建
辛翠花 1, 2 , 刘庆昌 1 , 屈冬玉 1, 23 , 黄三文 23
(1 中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京 100094; 2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 以双元载体 pB INPLUS为基础 , 在 T2DNA侧翼区通过 2次特异 PCR、酶切和连接相结合的方
法 , 构建了 1个无标记载体 pB INMF (marker2free vector)。通过酶切后测序分析 , 这个无标记载体在 T2DNA
左、右边界之间只有 1个多克隆位点 (multip le cloned sites, MCS)。为了验证该载体的遗传稳定性 , 将 gus
基因克隆到该载体上并通过农杆菌介导的方法转化番茄栽培品种 ‘Moneymaker’, 特异 PCR扩增目的基因
和 GUS组织染色结果表明 , gus基因已经整合进入番茄基因组并得以表达。该载体为今后直接获得无标记
基因、生物安全的转化体 , 尤其可为马铃薯、木薯等无性繁殖材料的无标记基因转化提供可靠、有效的工
具。
关键词 : 无标记转化 ; 载体构建 ; 转基因 ; 番茄
中图分类号 : S 64111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520701206
The Con struction of a B inary Vector for M arker2free Tran sforma tion in
Plan ts
X IN Cui2hua1, 2 , L IU Q ing2chang1 , QU Dong2yu1, 23 , and HUANG San2wen23
(1 College of A gronom y and B iotechnology, China A gricultural U niversity, B eijing 100094, China; 2 Institu te of V egetables and
Flow ers, Ch inese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, Ch ina)
Abstract: A marker2free vector ( pB INMF) derived from the binary vector pB INPLUS was generated,
which only contained a multip le cloned site between left and right borders as validated by restriction analysis
and sequencing. In order to identify the efficiency of pB INMF for transformation, the gus gene was cloned into
the vector and was introduced into the tomato cultivar Moneymaker via Ag robacterium tum efaciens2mediated
transformation. Gene2specific PCR and GUS stain assay showed that gus gene was integrated into the tomato
genome and was exp ressed. This vector could become a reliable and efficient tool for direct generating marker2
free transformants in p lants, particularly useful for vegetatively p ropagated crop s like potato and cassava.
Key words: marker2free transformation; vector construction; transgene; tomato
众所周知 , 利用农杆菌介导的转基因频率很低 , 因此在转化过程中往往利用标记基因辅助选择来
筛选为数很少的阳性转化体。但是由于这些筛选标记基因多数为一些编码抗生素抗性 (Bevan et al. ,
1983) 和除草剂抗性 ( Shah et al. , 1986) 的基因 , 它们对生态环境和食物安全性的影响引起了消费
者和环境学家的普遍关注和担忧。因此有研究者在转化时使用标记基因 , 而在得到阳性转化体后通过
各种手段将筛选标记基因去除 ( Komari et al. , 1996; Gleave et al. , 1999; Zubko et al. , 2000; Ow,
2001; Lutz et al. , 2006; Kittiwongwattana et al. , 2007) , 另外一些研究者则利用无选择标记基因的转化
系统 , 转化时不使用筛选标记基因 ( de Vetten et al. , 2003; J ia et al. , 2007)。
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本研究基于无标记转化系统的理论基础构建了一个在 T2DNA左、右边界之间只有 1个多克隆位
点的无标记转化载体 , 一步到位即可获得只导入目的基因的阳性转化体。
1　材料与方法
111　材料
番茄栽培品种 ‘Moneymaker’种子、农杆菌菌株 Agl20、表达载体 pB I121和基础载体 pB INPLUS
都来自本实验室 ; 大肠杆菌感受态 DH5α购自 Tiangene公司 ; 限制性内切酶购自 NEB公司 ; Pfu2U l2
traTM高保真 DNA聚合酶购自 STRATAGENE公司 ; 胶回收试剂盒购自 Q iagene公司。
112　无标记载体的构建
以双元表达载体 pB INPLUS (图 1) 为基础 , 在 T2DNA左边界侧翼序列设计引物 P1和 P2并 PCR
扩增出约 218 kb大小的产物 , 然后用 AscⅠ /N deⅠ双酶切扩增产物和 pB INPLUS质粒 , 并分别回收酶
切产物的大片段 , 连接、转化和筛选阳性克隆 , 即构建好左边界只有多克隆位点的表达载体 pB INLD
(图 1 )。 P1: 5′2ACCAGGCGGGTCAAATCAGG23′, P2: 5′2TTGGCGCGCCAAATTAAAAACGTCCG2
CAATGTGTATTAAG23′, P2引物在其 5′端增加了 AscⅠ酶切位点 GGCGCGCC。以 pB INLD为基础载体 ,
在 T2DNA右边界侧翼序列设计引物 P3和 P4并 PCR扩增出约 1 kb大小的产物 , 然后用 PacⅠ / EcoN
Ⅰ双酶切扩增产物和 pB INLD质粒 , 并分别回收酶切产物的大片段 , 连接、转化和筛选阳性克隆 , 即
构建完毕左、右边界之间只有 1个多克隆位点的无标记载体 pB INMF (图 1)。P3: 5′2CCTTAATTAAG2
GAAACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGC23′, P4: 5′2CGACAATCCCGCGAGTCCC23′, P3引物在其
5′端增加了 PacⅠ的酶切位点 TTAATTAA。引物由上海生工生物公司合成。
图 1　无标记载体 pB INM F构建流程图
F ig. 1　Schema tic flow of marker2free vector ( pB INM F) con struction
113　gus基因克隆到无标记载体 pB INM F
用 EcoRⅠ /H indⅢ双酶切载体 pB I121, 回收约 3 kb的小片段 (包括 35S启动子、 nos终止子和
gus基因 )。同样用 EcoRⅠ /H indⅢ双酶切无标记载体 pB INMF后回收约 913 kb的大片段并用 T4 DNA
连接酶与回收的 3 kb片段连接、转化 , 然后通过单菌落 PCR、质粒酶切鉴定获得重组体 pB INMF2gus
阳性克隆。
114　农杆菌介导的遗传转化
将重组载体 pB INMF2gus通过三亲融合的方法转化毒力强的农杆菌 Agl20 (Lazo et al. , 1991) , 并
通过单菌落 PCR结合质粒酶切的方法获得阳性克隆。将含有重组载体的农杆菌 Agl20接种于附加 50
mg·L - 1 Km (卡那霉素 ) 和 50 mg·L - 1 R if (利福平 ) 的 LB培养基中 , 28 ℃ 240 r·m in - 1摇床上培养
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　5期 辛翠花等 : 无选择标记的植物表达载体的构建 　
到 OD600 = 016～017。然后 6 000 r·m in - 1离心 10 m in, 用 MS液体培养基重悬菌体并稀释到 OD600 =
013～014, 加入终浓度为 375μmol·L - 1 AS (乙酰丁香酮 ) 用于侵染。番茄栽培品种‘Moneymaker’种
子播于 MS培养基 , 7～10 d后待子叶刚伸展即用于转基因 , 方法参照 Sun等 (2006) 略有改动。待
生根培养基上得到的小苗长出 5～6片叶时移入温室用于后期 PCR阳性鉴定和 GUS组织染色鉴定。
115　PCR鉴定
取温室生长 10～15 d的转化体和对照叶片 100～300 mg, 提取基因组 DNA, 以此为模板。以 gus
基因序列设计引物 , GUS1: 5′2TCCTGTAGAAACCCCAACCCG23′和 GUS2: 5′2CCATC2AGCACGT2
TATCGAATCC23′, 并用这对引物进行 PCR扩增。反应程序为 : 94 ℃预变性 4 m in; 94 ℃变性 1 m in,
60 ℃退火 1 m in, 72 ℃延伸 1 m in, 30个循环 ; 最后 72 ℃延伸 10 m in。取 10μL PCR反应液在 1%琼
脂糖凝胶上电泳检测。
116　GUS组织染色鉴定
GUS组织染色参照 Jefferson (1987) 方法略有改动。取温室生长 10～15 d的番茄叶片放于 GUS
染液中 [ 100 mmol·L - 1 Na3 PO4 (pH 710) , 011% Triton X2100, 10 mmol·L - 1 EDTA , 015 mmol·L - 1
K3 Fe ( CN ) 6 , 015 mmol·L - 1 K4 Fe ( CN ) 6 , 1 mg·L - 1 52bromo242chloro232indolyl2β2D2GlcUA ( X2
Gluc) ] , 37 ℃10 h后将染色的叶片转入 75%的酒精中脱色以去掉叶绿素。以野生番茄叶片为对照。
2　结果与分析
211　无标记载体的构建
通过两次特异的 PCR扩增、酶切和连接 , 成功构建了在 T2DNA左、右边界之间只有 1个多克隆
位点的无标记载体 pB INMF。对左边界改造后 , 切去了包括 N ptⅡ基因在内的大约 219 kb的序列。用
AscⅠ / N deⅠ双酶切载体 pB INLD (图 2, A) , 切出的两条带分别与载体 pB INPLUS酶切所回收的 718
kb大片段和 PCR产物酶切所回收的 119 kb大片段大小保持一致 , 初步说明对左边界的改造成功。对
右边界改造后 , 切去了约 300 bp多余的序列。用 EcoNⅠ / PacⅠ双酶切载体 pB INMF (图 2, B ) , 切
出的两条带分别与载体 pB INLD酶切所回收的 815 kb大片段和 PCR产物酶切所回收的 864 bp大片段
大小保持一致 , 初步说明右边界改造也可能成功。
图 2　pB INM F左 ( A)、右 ( B) 边界改造后酶切鉴定结果
A: 1、2、3分别为 PCR产物、质粒酶切回收的大片段和载体 pB INLD双酶切 (A scⅠ /N deⅠ) 结果 ;
B: 1、2、3分别为载体 pB INMF双酶切 ( PacⅠ /EcoNⅠ)、质粒和 PCR产物酶切回收大片段 ;
M2. MarkerⅡ; M15. DNA marker DL 15000。
F ig. 2　Enzym e d igestion ana lysis after the recon struction to left ( A) and r ight ( B) border of the vector pB INM F
A: 1, 2. The large recovery of PCR p roducts and the vector pB INPLUS; 3. The enzyme digestion of the
vector pB INLD with A scⅠ /N deⅠ; B: 1. The enzyme digestion of the vector pB INMF
with PacⅠ /EcoNⅠ; 2, 3. The large recovery of the vector pB INLD and PCR p roducts;
M2. MarkerⅡ; M15. DNA marker DL 15000.
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通过测序分析 (图 3) 进一步证明了这个 T2DNA左、右边界之间只有 1个多克隆位点的无标记
载体已经成功构建。从测序结果来看 , 在 T2DNA左、右边界确实仅有 1个多克隆位点 , 没有任何多
余序列。但在多克隆位点与两边界之间分别多了 TT和 GG两个碱基 , 这是我们在设计引物时加入的
保护碱基。另外在右边界发现有一个碱基突变 , 由 A变为 G, 左边界没有碱基的突变。
图 3　无标记载体 ( pB INM F) T2D NA部分测序序列
左边界 (LB)、多克隆位点 (MCS) 和右边界 (RB) 分别以粉色、红色和棕色表示。
F ig. 3　The partia l sequenced sequence of T2D NA of the vector pB INM F
The sequence of left border (LB) , multip le cloned sites (MCS) and right border (RB) are
highlighted in p ink, red and brown respectively.
212　gus基因克隆到无标记载体 pB INM F
将卡那抗性平板上的阳性克隆经过单菌落 PCR鉴定后 , 将 PCR鉴定的阳性克隆摇菌提取质粒 ,
并用 EcoRⅠ /H indⅢ和 SacⅠ /X baⅠ分别双酶切 , 结果如图 4。EcoRⅠ /H indⅢ双酶切后 , 切出两条
带。预期应该切下包括启动子、终止子和 gus基因共约 3 kb大小的条带和约 913 kb大小的 pB INMF
空载体 ; SacⅠ /X baⅠ双酶切后 , 切出两条带。预期应该切下只包括 gus基因在内的约 2 kb大小的条
带和包括空载体 pB INMF、35S启动子和 nos终止子共约 1013 kb大小的条带。从图 4可见 , 所切条带
与理论预期酶切结果完全一致 , 说明 gus基因已经克隆到无标记载体 pB INMF上 , 成功构建了重组载
体 pB INMF2gus。
图 4　重组载体 pB INM F2gus酶切鉴定结果
1. 重组载体 EcoRⅠ /H ind Ⅲ双酶切 ; 2. 重组载体 SacⅠ /X baⅠ双酶切 ; M3. Marker Ⅲ; M15. DNA marker DL 15000。
F ig. 4　Enzym e d igestion ana lysis of the recom b inan t vector pB INM F2gus
1, 2. The enzyme digestion of pB INMF2gus with EcoRⅠ /H indⅢ and
SacⅠ / X baⅠrespectively; M3. Marker Ⅲ; M15. DNA marker DL 15000.
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213　转 gus基因番茄的 PCR鉴定
PCR扩增产物经 1%琼脂糖电泳检测证明 , gus基因已经成功地通过该无标记转化载体整合到番
茄基因组中 , 结果如图 5。转化株系和阳性质粒对照都扩增出了理论上为 928 bp大小的条带 , 而阴性
未转基因对照和其它假阳性转化体都没有扩增出此条带。
图 5　部分转 gus基因番茄 PCR检测
1. 携带 gus基因的质粒 pB I121阳性对照 ; 2, 3. 阴性对照和假阳性转化体 ;
4～6. 成功的阳性转化体 , 扩增出了大约 928 bp大小的条带 ; M. Marker Ⅲ。
F ig. 5　The spec if ic PCR of gus gene for partia l tran sgen ic toma toes
1. pB I121 carrying the gus gene; 2, 3. The wild tomatoes and p seudo2positive transformant;
4 - 6. Positive transgenic tomatoes; M. Marker Ⅲ.
214　GUS组织染色鉴定
GUS叶片染色结果证明 , gus基因已经成功整合进入番茄基因组中并在转录水平上得以表达 , 结
果见图 6。
图 6　无标记转基因番茄与对照未转基因番茄叶片 GUS染色
MG. 转 gus基因番茄叶片 ; CK. 未转基因番茄叶片。
F ig. 6　GUS sta in of leaves for tran sgen ic and non2tran sgen ic toma toes by marker2free tran sforma tion
MG. gus2transgenic leaf; CK. Non2transgenic leaf.
3　讨论
在过去几年里 , 消费者和环境学家从生态安全和食物安全的角度出发 , 讨论了抗生素和除草剂抗
性基因在遗传转化中的安全性问题。这些问题主要集中在 : (1) 带有抗生素或除草剂抗性标记基因的
转基因植物可能会变成有害的杂草 ; (2) 选择标记基因传播到野生亲缘种中 , 可能会使杂草获得这些
基因而使现有的除草剂无法将杂草杀掉 ; (3) 选择标记基因传播到其它生物体中 , 可能会破坏生态系
统的平衡。利用更安全的无标记转化 (marker2free transformation) 可能会给转基因生物 ( genetically
modified organism, GMO ) 带来一个全新的概念 , 提高人们对转基因产品的接受程度。
本研究通过酶切结合测序结果证明无标记载体 pB INMF构建成功。该载体大小为 91347 kb, 比基
础载体 pB INPLUS约小 3 kb。与以往获得无标记转化体 ( Komari et al. , 1996; J ia et al. , 2006; Lutz et
al. , 2006; Ballester et al. , 2007) 不同 , 利用该载体可以一步到位直接获得无标记基因的转化体 , 不
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需要得到转基因株系后再通过各种手段将筛选标记基因去除 , 省时、省力。尤其是为一些无性繁殖材
料无标记基因的转化提供了可靠的技术平台。该无标记转化系统也不同于以往的无标记转化系统
( de Vetten et al. , 2003; J ia et al. , 2007) , 以往无标记转化系统都只是将编码抗生素抗性的基因失活 ,
在 T2DNA左、右边界之间仍有很多细菌的骨架序列没有被切除 , 这些序列会随同外源目的基因一起被
转入受体植物中 , 可能会导致一些负面影响。本研究中的无标记转化系统导入植物的只有外源目的基
因 , 不含任何多余序列 , 从生物安全和食品安全的角度考虑更容易被接受 , 也更有应用前景。
本研究在构建无标记载体时部分序列为 PCR引入 , 有 3处发生了碱基突变 , 其中一处突变位于
pB INMF载体 T2DNA右边界区域 , 右边界在遗传转化中比左边界更重要 (Hepburn &W hite, 1985; Jen
& Chilton, 1986) ; 所构建的载体切除了 T2DNA左、右边界之间所有多余细菌序列 , 只保留 1个多克
隆位点。为了证明这些突变碱基和切去的细菌多余序列不会影响遗传转化 , 本研究将小而易于操作的
gus基因利用该载体介导转入番茄栽培品种 ‘Moneymaker’, 随后的 PCR检测和 GUS染色证明 , 碱基
突变和多余序列切除不影响载体 pB INMF的遗传转化效果。
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