全 文 ：园 艺 学 报 2006, 33 (1) : 134～136
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 01 - 25; 修回日期 : 2005 - 07 - 22
基金项目 : 广东省教育厅自然科学基金项目 (0153)
‘石硖 ’龙眼芽变系双引物 RAPD鉴定的研究
王心燕 1 肖 璇 2 乔爱民 1 孙 敏 3
(1 仲恺农业技术学院园艺系 , 广州 510225; 2 江西赣南师范学院化学与生命科学系 , 赣州 341000; 3 西南师范大学生
命科学学院 , 重庆 400715)
摘 要 : 以 ‘石硖 ’龙眼芽变系及其普通系 (对照 ) 为材料 , 从 80对双引物中筛选出 4对双引物在
二者之间扩增出稳定清晰的多态性片段。4对双引物共扩增出 35条带 , 其中多态性带 5条 , 表明通过双引
物扩增可成功地将 ‘芽变 ’与母株 (对照 ) 区分开来。在此基础上对双引物产生多态性扩增的原理进行了
分析。
关键词 : 龙眼 ; 芽变 ; RAPD; 双引物
中图分类号 : S 66712 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0120134203
RAPD Stud ies on Sport L ine of‘Sh ix ia’L ongan w ith D ouble Pr im ers
W ang Xinyan1 , Xiao Xuan2 , Q iao A im in1 , and Sun M in3
(1D epartm ent of Horticu lture, Zhongkai U niversity of A gricu lture and Technology, Guangzhou 510225, Ch ina; 2D epartm ent of
Chem istry and L ife Science, Gannan N orm al U niversity, Ganzhou 341000, Ch ina; 3 College of L ife Science, Southw est China
N orm al U niversity, Chongqing 400715, Ch ina)
Abstract: A single 10 bp random oligonucleotide was often used as the p rimer in the standard RAPD2
PCR analysis. To identify the possibility of RAPD2PCR reaction with double 10 bp p rimers, 80 double 10 bp
oligonucleotides were app lied to the RAPD2PCR analysis between the‘Shixia’ longan (D im ocarpus longan
var. sh ix ia Lour. ) sport line and itpis normal line ( control). Four double p rimers which could p roduce clear
and stability polymorphic DNA fragments were screened. Five RAPD makers have been obtained which were
linked to the mutation gene of the sport line. Furthermore, the reason why the new RAPD fragments could be
p roduced by double p rimers was also discussed.
Key words: Longan; Sport; RAPD; Double p rimers
1 目的、材料与方法
仲恺农业技术学院龙眼选种课题组在广东省台山市红岭种子园发现一株 ‘石硖 ’龙眼 (D im o2
carpus longan var. sh ix ia Lour. ) , 结果树一条主枝上的果实明显比其它枝条上的大 , 且具有桂花香味。
嫁接繁殖后代多年 , 观察发现其变异性状十分稳定 , 初步认为是芽变优系。为探讨由表现为单态性的
随机单引物随机两两组合而成的双引物 , 对所研究材料的基因组 DNA进行扩增的可行性 , 作者以该
‘石硖 ’龙眼芽变系及其普通系 (对照 ) 为材料 , 利用双引物进行 RAPD扩增鉴定 , 并对双引物产生
新的扩增条带的原因做进一步的分析。
试材为广东台山红岭种子园中芽变母树上的芽变枝条及普通枝条 (对照 ) 上的幼叶。Taq酶、引
物、dNTP、MgCl2、buffer缓冲液等购自上海生工生物工程有限公司 ; 琼脂糖、电泳点样缓冲液等购
自广东宝泰克生物公司 ; PCR仪为美国 PE公司生产的 PE2400型。DNA的提取参见张虎平等〔1〕的方
法。RAPD反应条件为 25μL的反应体积中含 20 ng模板 , 110 U Taq DNA聚合酶 , MgCl2 210 mmol/
1期 王心燕等 : ‘石硖 ’龙眼芽变系双引物 RAPD鉴定的研究
L, dNTP 0120 mmol/L, 双引物 0120μmol/L , 其余用蒸馏水补足 , 另加 25μL的石蜡油。反应程序
为 : 94℃预变性 5 m in; 94℃变性 30 s, 38℃复性 1 m in, 72℃延伸 115 m in, 40个循环 ; 72℃保温 10
m in。双引物由两个单引物等量混合而成。
扩增产物在 114%的琼脂糖凝胶 , 015倍 TBE电泳缓冲液中 , 4～5 V /cm的稳压条件下电泳。电
泳结束后 EB染色 , 紫外反射透射仪下观察、照相。具多态性的引物重复 2～3次。
2 结果分析与讨论
211 扩增结果
扩增结果表明 , 80对双引物中 , 绝大部分在
芽变系和对照间的扩增表现为单态性 , 经反复试
验 , 最终获得 4对双引物能扩增出稳定清晰的多
态性片段 (表 1)。
4对多态性双引物总共扩增出 35条带 , 大小
在 400～1 800 bp之间 , 平均每个双引物扩增出
8175条带。在扩增出的 35条带中有 5条表现为
多态性 , 其中存在于普通系中的有 Z592700 和
Z6021470, 存在于芽变系中的有 Z72700、 Z592
1000和 Z702800 (图 1)。可见双引物能成功地将
芽变系与其普通系鉴别开来 , 也说明了本芽变株
确实发生了 DNA水平的变异。
RAPD扩增通常使用的随机引物为 10 bp的寡
聚核甘酸片段 , 当 RAPD技术应用于 “芽变 ”材
料的检测时 , 由于芽变所发生的遗传物质的变异
极其微小 , 许多研究者认为 RAPD标记鉴别果树
芽变品种与原品种差异的几率相当低 , 需要对大
量的引物进行筛选才有可能获得表现为多态性的
引物〔2～4〕。利用表现为单态性的单引物重新两两
组合成双引物能增加引物检测范围 , 从而获得更
多与目标性状相关的分子标记 ; 同时 , n个单引
物可以组合成 n ( n - 1) /2个双引物 , 大大降低
了试验成本。
212 双引物与单引物扩增比较
双引物能扩增出不同于两个组配单引物分别
表 1 产生多态性的双引物序列及扩增结果
Table 1 The sequence of the polym orph ic double pr im ers
and the ir am plif ica tion results
引物
Primer
碱基序列
Ncleotide
sequence
扩增片段总数
Total fragments
amp lified
多态性片数
Polymorphic
fragments
Z7
CCTGATCACC /
CCATTCCCCA
9
1
Z59
GAGACGCACA /
AGCGTCACTC
8
2
Z60
AGCGTCACTC /
CCCCGGTAAC
11
1
Z70
CCAGTCCCAA /
TCGCTGCGTT
7
1
图 1 4对多态性双引物扩增的 RAPD指纹图谱
P: 普通系 (对照 ) ; Y: 芽变系 ; M: λDNA /EcoRⅠ + H indⅢ。
F ig. 1 The RAPD prof ile am plif ied by the four polym orph ic
double pr im ers
P: Control; Y: Sport line; M: λDNA /EcoRⅠ + H indⅢ.
扩增时的新条带 (图 2、图 3)。从图 2可以看出 , Z60双引物的两个组配单引物 S433及 S465分别扩
增时表现为单态性 , 而双引物 Z60却在普通系中扩增出 1条约 1 470 bp的多态性片段 ; 图 3也表明双
引物 Z70在芽变系中能检测到 1条 800 bp的多态性片段。从图 2还可以看出 , 组配双引物能扩增出
比两个单引物更大分子量的条带 ; 而在图 3中 , 单引物 S1315扩增时的大分子量条带在双引物 Z70中
却得不到扩增。
由于双引物是由两种单引物组合而成 , 不仅可以扩增出原来单引物结合的位点 , 还能扩增出由双
引物形成的新位点 , 所以双引物扩增出的条带通常要比单引物多。但从本试验的扩增结果可以看出 ,
双引物的扩增结果并不是由两个单引物分别扩增带的叠加 , 单引物单独扩增出的条带在双引物中有可
能得不到扩增 , 而一些新的条带却在双引物扩增中出现 , 这表明在双引物扩增中存在单引物和双引物
531
园 艺 学 报 33卷
扩增互作的情况。双引物扩增出的新的片段显然是由两种引物共同引导的 , 与单引物扩增的片段间不
存在同源性 , 但当双引物扩增出的片段与单引物扩增出的某个片段在电泳图上位于同一水平时 , 二者
之间是否存在同源性还需进一步利用分子杂交试验加以确定。
参考文献 :
1 张虎平 , 牛建新 , 王国安 , 虎海防 , 马兵钢. 适于核桃基因标记的 DNA提取方法. 生物技术 , 2003, 13 (5) : 18～19
Zhang H P, N iu J X, W ang G A, Hu H F, Ma B G. Op timal DNA extraction method for gene mark in walnuts. B iotechnology, 2003, 13
(5) : 18～19 ( in Chinese)
2 Nybom H. DNA fingerp rints in sports of‘Red Delicious’app les. HortScience, 1990, 25: 1641～1642
3 Hong Yuyang, Hnna Schm idt. Selection of a mutant from adventitious shoot formed in X2ray treated cherry leaves and differentiation of standard
and mutant with RAPD s. Euphytica, 1994, 77: 89 ～92
4 Ye G N, Soylemezoglu G, W eeden N F. Analysis of the relationship between grapevine cultivars, sports and clones via DNA fingerp rint. B io.
Techniques, 1996, 20: 368～370
新书推荐 《中国果树志 ·草莓卷 》
《中国果树志 ·草莓卷 》由沈阳农业大学邓明琴、雷家军主编 , 历经 20余年。《草莓卷 》是对草莓属资源进行调
查研究的一份阶段性总结 , 也是一部我国首次全面系统反映我国草莓事业发展的科学论著。
《草莓卷 》共分 8章 , 总论 7章 , 即 : 第一章 绪论 , 第二章 草莓起源与进化 , 第三章 草莓属植物分类和种的描
述 , 第四章 中国草莓栽培历史与现状 , 第五章 草莓形态特征与生物学特性 , 第六章 草莓栽培与贮藏加工 , 第七章 中
国野生草莓资源。各论 1章 , 即 : 第八章 草莓品种。《草莓卷 》重点介绍了草莓属植物的种类和特征、中国原产和引
入的野生草莓种类和特征以及草莓品种资源等内容。草莓属植物种类记载 20个 , 中国原产野生草莓种类记载 9个共
34份资源 , 中国引入野生草莓种类记载 10个共 27份资源。草莓品种资源共记载 246份资源 , 其中中国选育的品种 33
份、中国的地方品种 40份、中国引入的品种 173份。此外 , 《草莓卷 》对草莓的起源与进化、生物学特性、栽培技术
及我国草莓的栽培的历史与现状也进行了论述和总结。定价 : 77元 (含邮费 )
购书者请通过邮局汇款至北京中关村南大街 12号中国农科院蔬菜花卉所 《园艺学报 》编辑部 , 邮编 100081。
631