全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (1) : 158～160
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 05 - 23; 修回日期 : 2005 - 09 - 12
基金项目 : 福建省科技厅重大项目 (2003N022)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: vegchenwenhui@1261com)
结球甘蓝游离小孢子培养及植株再生
方淑桂　陈文辉 3 　曾小玲　朱朝辉　廖晓珍　郑学立
(福州市蔬菜科学研究所 , 福州 350012)
摘 　要 : 以结球甘蓝的双交种和四交种为材料 , 研究了影响甘蓝游离小孢子培养的若干因素。结果表
明 : 基因型是影响小孢子胚状体产生的最关键因素之一 ; 用高出胚的材料与不易出胚的材料杂交后 , 能明
显提高不易出胚材料的出胚能力 ; 双交种比单交种容易培养出健壮的胚 , 成苗率也高 ; 高糖培养 4 d后添
加低糖培养液可显著提高胚产量。
关键词 : 结球甘蓝 ; 双交种 ; 游离小孢子培养
中图分类号 : S 63511　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120158203
Isola ted2m icrospore Culture and Plan tlet Regenera tion in Cabbage ( B rassica
o le racea L. var. capita ta L. )
Fang Shugui, Chen W enhui3 , Zeng Xiaoling, Zhu Chaohui, L iao Xiaozhen, and Zheng Xueli
( Fuzhou Institu te of V egetable Research, Fuzhou 350012, Ch ina)
Abstract: Some factors affecting isolated2m icrospore culture of cabbage (B rassica oleracea L. var. cap2
ita ta L. ) were studied using double2crossed and tetra2crossed hybrids as the donor p lants. Results showed that
the genotype was one of the most critical factors affecting embryogenesis in isolated m icrospore culture. The
embryogenesis capacity of the low responsive genotype could be significantly imp roved after crossed with the
genotype with high embryogenesis ability. The tetra2crossed hybrid could p roduce more vigorous embryos and
result higher seedling rate compared with the double2crossed hybrid. The yield of embryoid could be signifi2
cantly increased by adding new liquid medium with lower sucrose concentration into the original culture medi2
um with a higher sucrose concentration after 4 days of culture.
Key words: Cabbage; Tetra2crossed hybrid; Isolated2m icrospore culture
1　目的、材料与方法
结球甘蓝 (B rassica oleracea L. var. capita ta L. ) 游离小孢子培养在国内外已有报道 , 但效率较
低〔1, 2〕。本试验从 2003年开始对结球甘蓝游离小孢子培养技术进行了系统试验研究 , 已获得大量的再生
植株 , 初步建立了高效的游离小孢子培养技术体系 , 可快速育成结球甘蓝优良的纯系供配制一代杂种。
2003年和 2004年用国内外夏秋甘蓝品种 ( F1 ) 为试材 , 2004年春用高出胚的 ‘强夏 ’与低出
胚和无出胚的 20个材料杂交获正反交杂种 40份。2004年夏秋将其与相应的亲本共 61份在自然条件
下同期栽培 , 2005年 2月上旬至 4月上旬陆续开花时 , 取单核晚期至双核期的花蕾 , 以含蔗糖 130 g
·L - 1的 B5培养基洗涤 , 基本培养液是蔗糖 140 g·L - 1和大量元素减半的 NLN (下同 ) , 用常规方法
进行培养。以活性炭 (AC)、NAA、62BA、AgNO3、2042D等生长调节剂做不同组合和浓度的试验。
更新和添加培养液做 3个试验 : ( 1) 初始培养用含蔗糖 170 g·L - 1的培养液培养 4 d后重新离心
(800 r·m in - 1 ) , 更换含蔗糖 140 g·L - 1的培养液培养 ; ( 2) 初始培养每皿用 2 mL含蔗糖 170 g·
　1期 方淑桂等 : 结球甘蓝游离小孢子培养及植株再生 　
L - 1的培养液培养 4 d后每皿添加 1 mL含蔗糖 80 g·L - 1的培养液 ; (3) 初始培养用含蔗糖 140 g·
L - 1的培养液培养 4 d后更换同种培养液。培养过程中通过倒置显微镜观察游离小孢子的发育情况 ,
光照培养前统计出胚情况。
2　结果分析与讨论
211　结球甘蓝单交种和双交种游离小孢子胚状体的诱导
2003年供试的 60份材料 ( F1 单交种 ) 均未产生胚状体。2004年经技术改进 80份供试材料 ( F1
单交种 ) 有 7个产生胚状体 , 出胚率为 8175% , 其中以国内品种 ‘强夏 ’出胚能力最强 , 平均每蕾
产胚 22个 , 其它 6个材料胚产量极低。2005年春季供试的 61份材料中的 21份亲本 (单交种 ) 有 7
个产生胚状体 , 出胚率为 33133% , 这 7份多为 2004年出胚的材料 , ‘强夏 ’出胚能力仍最强 ; 40份
双交种有 16份产生胚状体 , 出胚率为 40%。试验得出结果说明 : (1) 用出胚能力强的作亲本与 6个
出胚能力弱的杂交 , 正反交杂种出胚能力都大幅度提高。出胚能力强的亲本与 14个不出胚的亲本杂
交 , 有两个亲本正反交杂种培养出胚状体。品种或材料之间胚胎发生能力差异显著是由基因所致 , 这
与前人研究相符。 (2) 双交种胚产量介于两亲本之间 , 明显高于低出胚的亲本 (提高 5倍以上 ) , 但
均不超过 ‘强夏 ’; 相同亲本的正反交杂种在出胚率和胚产量方面无明显差异 (表 1) , 说明结球甘
蓝游离小孢子的胚胎发生是由核基因控制的 , 这与 Cloutier等〔3〕研究结果相同。 (3) 在同等条件下双
交种材料小孢子胚状体发育早 , 生长快 , 3 d后就能看到第 1次分裂 , 13 d就可肉眼见到胚状体 , 比
单交种提早 5～10 d (图版 , A～E)。这可能是双交种比单交种的小孢子有更强的生活力。
表 1　不同杂种小孢子出胚率和再生植株
Table 1　The frequency of em bryogenesis and regenera tion plan tlet of hybr ids in cabbage
材料
Materials
每皿出胚数
No. of embryo per dish
每花蕾出胚数
No. of embryo per bud
每皿再生植株数 No. of
regeneration p lantlet per dish
单交种 强夏 Q iangxia 8810 2210 1715
The double2 夏宝 Xiabao 1610 410 310
crossed hybrids 珍宝 Zhenbao 410 110 013
丹麦王 Danmaiwang 410 110 012
怡夏 Yixia 210 015 0
四季丰 Sijifeng 110 012 0
味宾 W eibin 110 012 0
双交种 强夏 ×夏宝 Q iangxia ×Xiabao 8010 2010 1810
The tetra2 强夏 ×珍宝 Q iangxia ×Zhenbao 6610 1615 1510
crossed hybrids 强夏 ×丹麦王 Q iangxia ×Danmaiwang 6210 1515 1510
强夏 ×怡夏 Q iangxia ×Yixia 4810 1210 1210
强夏 ×四季丰 Q iangxia ×Sijifeng 4310 1018 1010
强夏 ×味宾 Q iangxia ×W eibin 2610 615 515
强夏 ×可口 Q iangxia ×Kekou 2510 613 515
强夏 ×尖头一番 Q iangxia ×J iantou Yifan 2210 515 510
夏宝 ×强夏 Xiabao ×Q iangxia 7810 1915 1710
珍宝 ×强夏 Zhenbao ×Q iangxia 7610 1910 1610
丹麦王 ×强夏 Danmaiwang ×Q iangxia 6310 1518 1210
怡夏 ×强夏 Yixia ×Q iangxia 4210 1015 910
四季丰 ×强夏 Sijifeng ×Q iangxia 3910 918 810
味宾 ×强夏 W eibin ×Q iangxia 2810 710 615
可口 ×强夏 Kekou ×Q iangxia 2210 516 415
尖头一番 ×强夏 J iantou Yifan ×Q iangxia 2010 215 215
　　注 : 每个材料取 20个花蕾 , 培养 5皿 , 重复 3次。
Note: The treatment with the each donor p lant selected 20 buds contained 3 rep licates, and 5 dishes.
212　添加和更换培养液对胚胎发生的影响
分离的小孢子均匀悬浮在含蔗糖 170 g·L - 1的 1 /2 NLN217培养液中 , 每皿 2 mL。培养 4 d后每
皿加入 1 mL含蔗糖 80 g·L - 1的 1 /2 NLN28培养液 , 使蔗糖浓度稀释到 140 g·L - 1。结果胚产量大幅
度提高 , 平均每蕾产胚 20个 , 比对照增长 222158%。初始用 1 /2 NLN217培养液 , 4 d后更换成 1 /2
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
NLN214培养液 , 胚产量也明显提高 , 比对照增长 69135% (表 1)。试验得出添加培养液和更换不同
培养液都能提高胚产量 , 但前者效果更显著 , 这可能是高浓度蔗糖的培养液提供了前期小孢子生理活
性理想的渗透压 , 维持小孢子的活力。用同种培养液更换培养 , 即从 1 /2 NLN214换至 1 /2 NLN214,
胚产量反而比对照明显下降为 - 19135% , 这可能是更换培养液需要重新离心 , 离心对膨大的小孢子
伤害较大所致。更换不同培养液能提高胚产量 , 在芸薹属其它蔬菜小孢子培养中已有报道 , 采用添加
低糖培养液的培养方法提高胚状体产量尚属首次报道。
213　添加生长调节剂和活性炭对胚胎发生的影响
添加物以 NAA 015 mg·L - 1 + 62BA 0105 mg·L - 1 +AgNO3 5 mg·L - 1 + 2042D 012 mg·L - 1 +AC 011
mg·L - 1的组合最好 , 每蕾平均产胚 20个 , 比不加任何生长调节剂的增加 1倍 , 并高于其它组合。
214　胚状体的发育与植株再生
子叶期胚移至光照培养 , 有利于胚状体成苗。将转绿后的胚状体转到含蔗糖 30 g·L - 1、琼脂 12
g·L - 1的 MS固体培养基上 , 在 (23 ±1) ℃、6 000 lx, 16 h·d - 1光照下培养 , 30 d左右大部分子叶
期胚可直接发育成胚芽 , 少部分形成愈伤组织再分化出不定芽 , 将胚芽和不定芽转至含蔗糖 20 g·
L - 1、 IBA 011 mg·L - 1和琼脂 8 g·L - 1的 1 /2 MS生根培养基上培养 , 形成小孢子再生植株 (图版 ,
F)。在同等试验条件下 , 双交种小孢子胚状体的再生苗率 (平均 2118% ) 高于单交种 (平均
1811% ) 2014% (表 1) , 采用双交种进行小孢子培养更易获得成功。
参考文献 :
1　Duijs J G , Voorrip s R E, V isser D L, Custers J B M. M icrospore culture is successful in most crop types of B rassica oleracea L. Euphytica,
1992, 60 (1) : 45～55
2　杨丽梅 , 方智远 , 刘玉梅 , 庄　木 , 张扬勇 , 孙培田. 利用小孢子培养选育甘蓝自交系. 中国蔬菜 , 2003 (6) : 31～32
Yang L M, Fang Z Y, L iu YM, ZhuangM, Zhang Y Y, Sun P T. App lications of m icrospore culture technology in inbred line of cabbage.
China Vegetables, 2003 (6) : 31～32 ( in Chinese)
3　Cloutier S, Cappadocia M, Landry B. Study of m icrospore culture responsiveness in oilseed rape (B. napus) by comparative RFLP mapp ing
of an F2 and two m icrospore derived populations. Theor. App l. Genet. , 1995, 91: 841～847
图版说明 : 结球甘蓝小孢子发育过程　A. 培养 3 d后第 1次分裂 ; B. 培养 15 d后形成球形胚 ; C. 培养 18 d后形成鱼雷期胚 ;
D. 培养 30 d后形成子叶胚 ; E. 发育正常的再生芽 ; F. 再生植株。
Explana tion of pla tes: D evelopm en t process of m icrospore in cabbage　A. The first cell division for 3 days; B. Globular embryo for
15 days; C. Torpedo2shaped embryo for 18 days; D. Cotyledon2shaped embryo for 30 days culture; E. Normal regenerated sp rout; F. Re2
generation p lantlet.
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