全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (2) : 157 - 162
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 07 - 17; 修回日期 : 2007 - 11 - 26
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30571285; 30671452)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: labft@ sdau1edu1cn)
一氧化氮在吲哚丁酸诱导平邑甜茶幼苗侧根形成中
的作用
高华君 1, 2 , 杨洪强 13 , 张　伟 1
(1 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 作物生物学国家重点实验室 , 山东泰安 271018; 2 山东省果树研究所 , 山东
泰安 271000)
摘 　要 : 以平邑甜茶 (M alus hupenhensis Rehd. ) 实生苗为材料 , 研究一氧化氮 (NO ) 对侧根的诱导
效果 , 吲哚丁酸 ( IBA) 对根系内源 NO含量的影响以及 NO在 IBA诱导侧根形成中的作用。结果表明 , 外
源 NO能够促进平邑甜茶侧根的形成与生长 , 并有明显的剂量效应 , 其中 10μmol·L - 1 NO供体硝普钠
( SNP) 处理后新根最长 , 50μmol·L - 1 SNP处理后新根数量最多。100μmol·L - 1 IBA处理后 15～30 m in
和 48～96 h, 幼苗根系 NO生成量出现两次高峰 , 而 IBA处理 96 h后侧根原基数量大量增加。此外 , 蛋白
激酶抑制剂 quercetin明显抑制 IBA对 NO的诱导。
关键词 : 平邑甜茶 ; 侧根 ; 一氧化氮 ; 吲哚丁酸
中图分类号 : S 661　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0220157206
Effects of N itr ic O x ide on La tera l Root Forma tion Induced by IBA in M a lus
hupehensis Rehd. Seedlings
GAO Hua2jun1, 2 , YANG Hong2qiang13 , and ZHANG W ei1
(1 College of Horticu lture Science and Engineering, Shandong A gricu ltura l U niversity, S ta te Key L aboratory of C rop B iology,
Taipian, Shandong 271018, China; 2 Shandong Institu te of Pom ology, Ta ipian, Shandong 271000, Ch ina)
Abstract: N itric oxide (NO) is an important signaling molecule in p lants and auxin is the main hormone
regulating root development. Effects of exogenous NO on lateral root (LR) formation as well as indole butyric
acid ( IBA ) on root endogenous NO p roduction in M alus hupehensis Rehd. seedlings were studied. The results
showed that app lication of the NO donor sodium nitrop russide ( SNP) induced LR development in a dose2
dependent manner. SNP concentrations of 10μmol·L - 1 and 50μmol·L - 1 were the most effective in p romo2
ting LR elongation and emergence, respectively. Two peaks of endogenous NO p roduction in roots were ob2
served from 15 to 30 m in and from 48 to 96 h after 100μmol·L - 1 IBA treatment. Coinciding with endoge2
nous NO p roduction, lateral root p rimordium (LRP) also increased greatly at 96 h after IBA app lication. Ad2
ditionally, quercetin ( a p rotein kinase inhibitor) inhibited IBA2induced NO p roduction in roots greatly. The
roles of NO in IBA2induced LR p roduction were discussed.
Key words: M alus hupehensis Rehd. ; lateral root; nitric oxide; IBA
一氧化氮 (NO) 是一种信使分子 , 对植物生长发育和抗逆反应有广泛的调节作用 , 也与植物根
系的生长发育有关 (Beligni & Lamattina, 1999)。在一年生植物上 , Gouvêa等 (1997) 曾观察到外源
NO促进玉米根延长 , Lamattina等 (2001) 报道外源 NO可诱导作物外植体不定根的分化 , Pagnussat
等 (2002) 发现外源 NO能促进黄瓜下胚轴插条不定根形成 , 而且在 IAA诱导黄瓜下胚轴不定根形
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成过程中有 NO生成 ; 此外 , Correa2A ragunde等 ( 2004) 报道 NO是番茄侧根发生所必需的信使分
子。这些说明 NO在诱导植物不定根和侧根形成中具有重要作用。
新根的形成是植物生长发育中的重要事件 , 不论侧根还是不定根的形成均受到生长素的调节。吲
哚丁酸 ( indole butyric acid, IBA ) 是吲哚乙酸以外的另一种植物生长素类物质 , 能够增加苹果幼苗
新根数量以及根系多胺的含量 ; 而 NO和多胺的生物合成均以精氨酸为前体 , 它们都是含氮的信使分
子 , 其中已经明确多胺能够促进苹果根系的生长发育 (杨洪强 等 , 1995) , 但关于 NO在果树根系生
长发育中的作用尚未见报道。
平邑甜茶是原产山东平邑的优良苹果砧木资源 , 具有高度无融合生殖能力 , 其实生苗个体的一致
性非常好 , 易于反映处理间的差异 (杨洪强和接玉玲 , 1997)。本试验以平邑甜茶为试材 , 检测外源
NO处理后苹果砧木新根的变化以及 IBA对内源 NO含量和幼苗发根的影响 , 探讨 NO在苹果砧木侧
根生长发育中的作用。
1　材料与方法
111　试材与处理
试材为具有 3片真叶、长势相近的平邑甜茶 (M alus hupenhensis Rehd. ) 水培实生苗 , 培养液为
Hoagland完全液 , 自然光照 , 培养温度 20～25 ℃。通过向培养液中添加不同浓度的 IBA和 NO供体
硝普钠 ( SNP) 进行处理 , 3次重复。各试验处理如下 :
① IBA诱导生根试验 : 100μmol·L - 1 IBA处理 6 h和 96 h时取样统计侧根原基数 , 以不添加 IBA
为对照。每 5株为 1个小区。
② IBA诱导 NO试验 : 设不添加 IBA和 quercetin (对照 )、添加 100μmol·L - 1 IBA、100μmol·
L - 1 IBA + 100μmol·L - 1 quercetin 3个处理 , 每个处理 55株。处理后 0125、015、1、115、2、3、5、
8、24、48和 96 h取样 , 检测根系 NO生成情况。
③NO诱导生根试验 : 以硝普钠 ( SNP) 为 NO 供体 , SNP浓度分别为 0、10、50、100和 500
μmol·L - 1 , 5株为 1个小区 , 处理 14 d时调查各处理单株平均新根数量和平均单根长度。
112　测定方法
NO测定 : 采用鲁米诺 —H2 O2化学发光法 ( Kikuchi et al. , 1993; Radi et al. , 1993; 周宜开 等 ,
1999)。取鲜样 , 按 1∶5 (质量 /体积 ) 的比例加入无氧水在冰浴中研磨 , 4 ℃ 12 000 ×g离心 20 m in。
取上清液 (NO提取液 ) 40μL, 快速注入含有 160μL发光液 (50 mmol·L - 1碳酸盐缓冲液 , 含 10
μmol·L - 1鲁米诺、20 mmol·L - 1 H2 O2、2 mmol·L - 1 EDTA, pH 9172) 的测量杯中 , 立即用 BPCL
超微弱发光仪 (中国科学院生物物理研究所研制 ) 记录波长 635 nm时 6 s的累计发光值 (测量参数 :
调节高压为 800 V, 标准光源发光强度 7 000 counts·s- 1 , 本底强度 5 counts·s- 1 , 采样间隔时间 1 s,
测定温度 30 ℃)。以每克鲜样质量产生的化学发光量表示 NO相对含量 (1 ×106 counts·g- 1 FM )。
侧根原基 ( lateral root p rimordium, LRP) 的测定 : 将主根剪下后用卡诺氏固定液固定 , 固定的主
根按 Feulgen法 (何钟佩 , 1993) 进行整体染色透明处理 , 然后在光学显微镜 ( 50倍 ) 下观察并统
计侧根原基数量。
2　结果与分析
211　 IBA对平邑甜茶幼苗侧根发生的影响
IBA促进侧根的发生和发育与其对侧根原基的快速诱导有关。图 1显示 , 100μmol·L - 1 IBA处
理平邑甜茶幼苗根系 8 h时 , 侧根原基数量与对照相比无明显差异 , 但至 96 h时 IBA对侧根原基形成
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　2期 高华君等 : 一氧化氮在吲哚丁酸诱导平邑甜茶幼苗侧根形成中的作用 　
的诱导作用已开始显现出来 , 侧根原基数量较对
照提高了 136114% , 这说明尽管 8 h时没有观察
到侧根原基 , 但是 IBA作为一个外源信号已经触
发或启动了与侧根原基形成有关的代谢过程 , 这
个过程的结果便是 96 h时新的侧根原基的出现。
212　 IBA对平邑甜茶幼苗根系内源 NO含量的影
响
21211　 IBA处理后 NO含量的瞬时变化 　
图 2显示 , IBA单独处理时根系内源 NO的
产生具有一个瞬时增加的过程 , 即处理 15 m in
时 , 其含量显著高于对照 , 处理 30 m in时到达最
高值 , 处理 60 m in时恢复到甚至低于对照的水
平 , 这样的低水平一直持续到处理后的 180 m in。
考虑到 NO的信使分子功能 (Beligni & Lamattina,
1999) , 联系图 1中 IBA对侧根原基的诱导作用
可知 , IBA处理后根系内源 NO浓度的瞬时增加
应当与 IBA对根原基的触发或启动有关。
图 1　 IBA对平邑甜茶幼苗侧根原基形成的影响
不同字母表示差异显著 , 邓肯氏新复极差检验 ( P < 0105)。
F ig. 1　Effect of IBA on forma tion of L RP
in M a lus hupehensis Rehd. seedlings
D ifferent letters indicate significance,
Duncanpis new multip le test ( P < 0105) .
　　图 2还显示 , IBA与蛋白激酶抑制剂槲皮素 ( quercetin) 混合处理时 , 根系内源 NO水平始终低
于对照 , 没有 15～30 m in时 NO水平的升高现象。
图 2　 IBA处理后平邑甜茶幼苗根系内源 NO含量的瞬时变化
F ig. 2　 IBA induces a tran sien t increa se in endogenous NO in roots of M a lus hupehensis Rehd. seedlings
21212　 IBA处理后 NO含量的长期变化 　
图 3显示 , IBA单独处理根系 5～24 h时根系内源 NO含量与对照在同一水平 , 但处理 48 h时显
著高于对照 , 其含量为对照的 1141倍 , 至 96 h时仍持续升高 , 其含量升高为对照的 2115倍。而图 1
显示 , IBA处理 96 h时正是侧根原基大量出现的时期 , 因此 , 这次根系内源 NO含量的升高很可能与
根原基的生长有关。
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　　图 3还显示 , IBA与蛋白激酶抑制剂 quercetin混合处理第 48小时和第 96小时 , 根系内源 NO含
量与对照差异不大 , 处理 48 h以后 , 蛋白激酶抑制剂明显抑制了 IBA引起的 NO含量的升高。
图 3　 IBA处理后平邑甜茶幼苗根系内源 NO含量的长期变化
F ig. 3　A burst of NO can be detected in roots of M a lus hupehensis Rehd. seedlings after IBA applica tion
213　外源 NO对平邑甜茶幼苗根系发生的影响
21311　外源 NO对平邑甜茶幼苗新根数量的影响 　
图 4显示 , 4种浓度的硝普钠 ( SNP, NO供体 ) 均显著增加单株发根数量 , 呈现出明显的浓度
剂量效应 , 其中以 50μmol·L - 1效果最好 , 发根量为对照的 2135倍 , 10 、100和 500μmol·L - 1的处
理依次下降 , 但仍高于对照。
21312　外源 NO对平邑甜茶幼苗新根长度的影响 　
10μmol·L - 1 SNP明显促进了新根生长 , 平均单根长度为对照的 1165倍 , 其余 3个浓度明显抑
制了新根伸长生长 , 并随 SNP浓度的升高 , 新根长度逐渐下降 (图 5)。
图 4　外源 NO对平邑甜茶幼苗新根数量的影响
不同字母表示差异显著 , 邓肯氏新复极差检验 ( P < 0105)。
F ig. 4　Effects of exogenous NO on root num ber
in seedlings of M a lus hupehensis Rehd.
D ifferent letters indicate statistical significance,
Duncanpis new multip le test ( P < 0105) . 图 5　外源 NO对平邑甜茶幼苗新根长度的影响不同字母表示差异显著 , 邓肯氏新复极差检验 ( P < 0105)。F ig. 5　Effects of exogenous NO on root length in seedlingsof M a lus hupehensis Rehd.D ifferent letters indicate statistical significance,Duncanpis new multip le test ( P < 0105) .
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　2期 高华君等 : 一氧化氮在吲哚丁酸诱导平邑甜茶幼苗侧根形成中的作用 　
　　SNP处理影响根系形态。10μmol·L - 1 SNP处理后 , 新根多集中在根系先端 , 数量较多 , 长度最
长 , 整个根系呈黄白色 ; 50μmol·L - 1 SNP处理新根遍布整个根系 , 数量多 , 长度较短 , 新根生长
点多 , 根系呈白色 ; 100μmol·L - 1 SNP处理虽然有较多的新根生长点遍布整个根系 , 但伸长生长受
阻 , 根系呈黄褐色 ; 500μmol·L - 1 SNP则严重抑制新根生长 , 根系颜色较深 , 呈黑褐色 , 而对照根
系呈浅黄褐色。
3　讨论
侧根的发生经过诱导期、侧根原基形成期和侧根的伸长生长 3个阶段 , IBA可促进侧根的发生和
发育 (Casim iro et al. , 2003; Casson & L indsey, 2003)。外源信号触发侧根发生需要经过一系列的信
号转导过程 , 而信号转导需要信使分子的介导。NO作为信使分子在植物发育中起重要作用 , 如 Pag2
nussat等 (2002, 2003, 2004) 在黄瓜上发现 NO可通过促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 途径介导
IAA对不定根的诱发。
本试验结果显示 , IBA能够促进平邑甜茶根系内源 NO水平升高 , 并且在 IBA诱导侧根形成过程
中出现两个 NO含量高峰期 , 即处理后 15～30 m in和 48～96 h。第 1个高峰期在侧根原基出现之前 ,
这一次升高与 Pagnussat等 (2002) 在黄瓜上观察到的现象类似 , 而 NO被 Pagnussat等 (2004) 认为
是 IAA诱导黄瓜幼苗不定根产生的信号分子。由此可以得出 , NO同样可能在 IBA诱导平邑甜茶幼苗
侧根发生中起中间信使的作用 , 这次 NO含量的短暂增加可能与 IBA诱导侧根原基的形成有关 , 应当
处于侧根发生的诱导期。
Correa2A ragunde等 (2004) 认为在番茄幼苗侧根发生过程中 , 内源 NO主要产生于侧根原基上。
本试验中观察到的 NO含量的第 2次升高正值侧根原基大量出现时期 , 而侧根原基的出现是侧根原基
快速生长并突破皮层的结果 , 这是根系生理代谢比较活跃的一个时期 , 因此 IBA处理后期 NO含量的
第 2次显著升高可能与侧根原基的形成和快速生长有关。
本试验还发现外源 NO虽然显著促进平邑甜茶幼苗新根发生 , 但高浓度 NO严重抑制新根的伸长
生长 , 与生长素在较高浓度时促进新根形成但抑制根系生长的效果基本一致 , 进一步表明 IBA和 NO
对在诱导平邑甜茶幼苗新根发生过程中具有密切的相关性。调控根系生长发育是园艺植物栽培的一项
重要技术 , NO对根系生长发育有明显调节作用。Lamattina等 (2003) 发现一种专一与根系质膜结合
的亚硝酸盐 —NO还原酶 (N I2NOR) 参与根系 NO的生成 , 而 IAA引起的环境酸化可启动 N I2NOR活
性 ; 在土壤中 , 硝酸盐和亚硝酸盐等氮素肥料也可以通过 N I2NOR的转化形成 NO ( StÊhr & U llrich,
2002; StÊhr & Strem lau, 2006) ; 本试验证明 , 适宜浓度的 NO能够促进平邑甜茶根系的生长发育 ,
这些认识对于在生产上制定根系管理措施会有指导意义。
quercetin是一种蛋白激酶抑制剂 , 可通过抑制蛋白激酶活性而抑制 IBA引起的蛋白磷酸化 (李
佳 等 , 2004)。本研究表明 , 蛋白激酶抑制剂明显抑制了 IBA对 NO产生的诱导作用 , 表明蛋白激酶
可能参与 IBA引起的 NO产生。蛋白激酶能够引起某些 “靶酶 ”发生磷酸化 , 从而改变 “靶酶 ”的
活性 , 蛋白激酶抑制剂抑制 IBA诱导的 NO产生 , 很可能控制 NO生物合成的酶是蛋白激酶的一种
“靶酶 ”, 这一 “靶酶 ”受 IBA诱导的蛋白激酶的调控 , 至于这一 “靶酶 ”究竟是一氧化氮合酶、N I2
NOR还是其他与 NO生物合成有直接或间接关系的酶 , 还需要试验来证明。实际上 , 目前 IBA引起
内源 NO产生的机制或途径仍很不清楚 , 蛋白激酶调控 NO生物合成的机制也有待于进一步研究 , 这
不仅是果树生理学的问题 , 更是基础生物学的重要课题。
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