全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (4) : 571 - 576
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 12 - 17; 修回日期 : 2008 - 02 - 22
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30660153) ; 华南热带农业大学院校科技基金项目 (Rndy 0605; Rnd 0612)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: song1strong@1631com)
致谢 : 本研究野外调查工作得到霸王岭国家级自然保护区王文毅、杨世彬、陈庆和王进强等同志的大力协助 , 谨表诚挚谢意。
五唇兰菌根化育苗技术
柯海丽 1 , 宋希强 1, 23 , 罗毅波 2 , 朱国鹏 1 , 凌绪柏 3
(1 海南大学园艺园林学院 , 海南儋州 571737; 2 中国科学院植物研究所 , 系统与进化植物学国家重点实验室 , 北京
100093; 3 海南博大兰花科技有限公司 , 海口 571101)
摘 　要 : 为探索菌根技术在兰科植物保育中的应用 , 以野生五唇兰的内生菌根真菌和五唇兰组培苗为
材料 , 进行组培瓶苗和盆栽苗的菌根化研究。利用固体培养的菌丝体与五唇兰无菌组培苗进行共生培养 ,
15 d后 , 根染色法检测结果表明 , 真菌能够成功侵染根 , 菌根化苗的移栽成活率均达到 100% (对照为
63133% )。种植 90 d后各菌株处理苗的鲜样质量增长率均高于对照 , 其中 F29菌株处理苗的鲜样质量增长
率高于对照 3113%。在大棚栽培条件下 , 利用液体菌剂对盆栽苗进行菌根化培养。90 d后各菌株处理苗的
成活率和鲜样质量增长率均高于对照 , 其中 F29菌株处理成活率比对照高出 35% , 鲜样质量增长率比对照
高 33124%。
关键词 : 兰花 ; 五唇兰 ; 内生菌根真菌 ; 育苗
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0420571206
Seedling Cultiva tion of D oritis pu lcherrim a L indl. w ith M ycorrh iza l Fung i
KE Hai2li1 , SONG Xi2qiang1, 23 , LUO Yi2bo2 , ZHU Guo2peng1 , and L ING Xu2bo3
(1 College of Horticulture and L andscape A rchitecture, Hainan U niversity, D anzhou, Hainan 571737, China; 2 S ta te Laboratory of
System atic and Evolutionary B otany, Institu te of B otany, Chinese A cadem y of Sciences, B eijing 100093, China; 3B oda O rchid
Technology Com pany L td. , Haikou 571101, Ch ina)
Abstract: It aim s at the app lication of mycorrhization technique in the orchid conservation. The endoge2
netic fungi from the root of the wild p lant of D oritis pu lcherrim a L indl. were inoculated with seedlings of D.
pu lcherrim a in flask and in pot. Firstly, the symbiotic cultivation of asep tic seedlings with the mycelium of so2
lid culture was carried out in flask. According to the method of root coloration, the result showed that the fungi
can successfully infect the root of D. pu lcherrim a seeding after 15 d, with 100% survival rate, while that of
the control without mycorrhizal fungi was 63133%. After 90 d, the fresh mass of these seedlings treated with
fungi were all higher than the control, especially as for the treatment with fungi F29, there were even 3113%
higher than the control. Secondly, seedlingswere also cultivated with the liquid strain in pot. After 90 d, both
the survival rate and the fresh biomass of the mycorrhization seedlings were higher than those of the control.
For the mycorrhization seedlings with F29, they have 35% survival rate and 33124% fresh mass higher than
those of the control, respectively. The results suggested that there was remarkable or significant difference be2
tween the inoculated p lants and the control.
Key words: orchid; D oritis pu lcherrim a L indl. ; endomycorrhizal fungi; seedling cultivation
菌根化育苗技术已广泛应用于造林工程中 , 世界上许多发达国家已将其作为营造速生丰产林不可
缺少的生物措施。菌根化育苗不仅可促进苗木的早期生长 , 而且可提高苗木质量 (蒋家淡 等 ,
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
2001; 仲崇禄 等 , 2002)。
兰科植物是典型的菌根植物 , 在长期的进化过程中已形成依赖菌根成活和生长的特性 (Ram say
& D ixon, 2003)。许多兰花特别是腐生兰对菌根已产生绝对的依赖性 , 在自然条件下没有菌根就生长
不良 , 甚至死亡 (Hadley, 1982; 徐锦堂和郭顺星 , 1989)。所有的兰花种子在自然条件下都需要与
真菌共生才能萌发 , 形成菌根是它们在自然条件下成活和生长的前提 (Benzing & Friedman, 1981;
A rditti et al. , 1990)。已有的研究结果表明 , 共生真菌有助于提高幼苗移栽后的成活率 ( Zettler et
al. , 2005) 和生长速度 (Ram say & D ixon, 2003) , 增加植株对逆境的抵抗能力 , 维持较低的发病
率 , 增加花的数量和提高花的品质等 (Chang & Chou, 2001)。
自 1924年美国植物学家 Knudson利用人工添加营养物质的方法代替共生真菌 , 成功实现了兰花
种子的室内无菌播种以来 , 组织培养技术已成为兰花产业种苗生产的一种常规方法 (A lam et al. ,
2002)。但是该技术应用于兰科植物的栽培仍有许多问题亟待解决 : (1) 组培苗移栽成活率低 , 人们
虽然已成功培育出多种野生兰科植物组培苗 , 但极低的试管苗移栽成活率成为规模化繁育的主要限制
因子。 (2) 幼苗生长缓慢 , 如国兰 Cym bid ium 组培苗移栽在大田栽培时出现幼苗生长停滞 , 需经历
一段较长时间的 “墩苗期 ”才能恢复。 (3) 组培苗抗逆性差 , 易遭受病虫害。因此 , 如何提高组培
苗移栽成活率和植株的抗病性 , 减少化肥农药的施用 , 降低生产成本成为兰科植物生产者急切关注的
问题。
本研究中从野生五唇兰分离获得一批菌种 (柯海丽 等 , 2007a) , 同时以野生五唇兰种子为外植
体获得了一批组培苗 (柯海丽 等 , 2007b)。在组培瓶内培养和盆栽条件下 , 用筛选出来的内生真菌
对五唇兰进行接种 , 从真菌的处理、菌根染色、真菌的重分离、五唇兰植株生物量的增长等方面研究
菌根化育苗技术 , 以建立一套五唇兰菌根化育苗技术体系 , 为五唇兰的资源保存奠定基础 , 同时也为
其它兰科植物的菌根化育苗 , 快速繁殖和保存提供技术参考。
1　材料与方法
111　材料
供试植株 : 瓶内接菌植株为具有 4～5片叶 , 3～4条根 , 生长较为一致的五唇兰无菌播种苗。盆
栽接菌植株为移栽 7 d后的盆栽组培苗。
供试菌种 : 菌株分离自野生五唇兰根部 , 编号为 F23、F29、F33、F58、F80, 分别经固体培养和
液体发酵。固体培养从菌落边缘打取直径为 015 cm的菌饼作为接种材料 , 液体培养的菌种将菌丝体
和发酵液打碎制成液体菌剂。
112　培养基及栽培基质
共生培养基为 DE培养基 (D ijk & Eck, 1995) , 共生栽培基质为苔藓 (121 ℃灭菌 2 h)。
113　组培苗的瓶内菌根化
取直径为 015 cm的菌饼接种于共生培养基上 , 菌种活化 7 d后接种五唇兰无菌苗 , 每瓶接种 10
株苗 , 每个处理重复 3次。
15 d后利用菌根染色法进行组培苗菌根化的快速检测。检测菌根化成功后 , 将苗移栽到穴盘中 ,
用经 121 ℃高压灭菌 2 h的新鲜苔藓进行种植。移栽前对每株小苗进行编号并称其鲜样质量 ( a)。90
d后统计苗的移栽成活率并称取苗的鲜样质量 ( b) , 计算苗的鲜样质量增长率 ( % ) : ( b - a) / a ×
100。
从每个处理的植株和对照植株中随机抽取 5株苗进行真菌的重分离。
114　盆栽苗菌根化培养
对供试组培苗进行编号并称取其鲜样质量 , 以无菌的苔藓为栽培基质 , 将苗种于 5 cm小盆中 ,
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　4期 柯海丽等 : 五唇兰菌根化育苗技术 　
每盆种植 1株幼苗。培养 7 d后在苗的根部喷施 5 mL菌液 (菌液共施 3次 , 每隔 15 d喷洒 1次 ) , 以
喷洒无菌水作对照。每个处理重复 20盆。培养 90 d后统计鲜样质量增长率。从每个处理植株和对照
植株中随机抽取 5株苗进行真菌的重分离。
115　幼苗菌根化检测
菌根染色法 : 将对照和不同处理的根分别放入 10% KOH中 , 121 ℃脱色 20 m in, 无菌水冲洗 3
次 , 用苯胺蓝 90 ℃条件下染色 4 h, 在碱性条件下用 H2O2脱色 8 m in。脱水后根段中尚有蓝色的即为
菌根 (Batty et al. , 2001)。
真菌的重分离 : 取其新生根在严格的表面消毒程序下 , 采用根段法对内生菌根真菌进行分离
(柯海丽 等 , 2007a)。
116　数据处理
采用 DPS7155统计软件比较不同处理对五唇兰组培苗鲜样质量增长率 ( % ) 的影响 , 并进行差
异显著性分析。
2　结果与分析
211　真菌的侵染及染菌根段的快速检测
真菌与五唇兰无菌播种苗共培养 15 d后 , 可见菌丝缠绕于五唇兰的根上 , 但并未往上蔓延侵染
植株的叶片 (图 1)。
菌根染色结果显示 5种处理植株的根均被染上颜色 , 说明真菌已侵入根 , 对照的根并无蓝色
(图 2)。
采用固体菌丝和组培苗进行瓶内菌根化育苗 , 真菌能够获得很好的生长 , 接种组培苗后对无菌苗
的根部侵染性强 , 组培苗菌根化的成功率高。
212　菌根化苗的移栽
将菌根化苗 (图 3) 移栽到穴盘中 , 用经过 121 ℃高压灭菌 2 h的苔藓进行种植。90 d后 , 各处
理苗的成活率均达到 100% , 高于对照 36167% (表 1)。瓶内菌根化苗有助于提高五唇兰组培苗的抗
性 , 大大提高了组培苗的移栽成活率。
各处理苗的平均鲜样质量增长率均不同程度的高于对照 , F29、F23、F58、F33、F80的鲜样质量
增长率分别高于对照 3113、6162、4192、413和 3178个百分点 , 其中 F29与 F23菌株处理苗的鲜样
质量增长率极显著高于对照 , F58菌株处理苗的鲜样质量增长率显著高于对照 (表 1)。
90 d后 , 对五唇兰移栽苗的根进行内生真菌的重分离 , 在各处理苗的根中均分离到了原接种菌
株 , 而对照苗的根受外界环境的感染 , 在其根内分离到了 Fx (镰刀菌 , 表 1)。
表 1　组培瓶苗的菌根化培养
Table 1　M ycorrh iza tion of seedling of D. pu lcherrim a in vitro
处理
Treatment
处理植株数
Number of
treated p lant
真菌检测
Fungi detection
成活株数
Number of live
p lant
成活率 /%
Survival rate
存活植株平均鲜样质量增长率 /%
Average increment of fresh mass
真菌重分离
Reisolated
F23 30 + 30 100 4413073 3 F23
F29 30 + 30 100 6819953 3 F29
F33 30 + 30 100 411993 F33
F58 30 + 30 100 4216123 F58
F80 30 + 30 100 411476 F80
对照 Control 30 - 19 63133 371692 Fx
　　注 : “ + ”真菌侵染成功 , “ - ”未检测到真菌 ; “3 ”差异显著 ( P = 0105) , “3 3 ”差异极显著 ( P = 0101)。
Note: “ + ”Success fungal infection, “ - ”No fungi ; “3 ”Significant difference ( P = 0105) , “3 3 ”Remarkably significant differ2
ence ( P = 0101) .
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷475
　4期 柯海丽等 : 五唇兰菌根化育苗技术 　
　　可见菌根化苗不但促进了植株的生长 , 而且受环境中的杂菌侵染的可能性小 , 有利于抵御病原菌
的入侵。
213　盆栽苗菌根化培养
五唇兰盆栽苗培养 90 d后 , 菌液处理苗明显表现出旺盛的生长势 , 叶宽而翠绿 , 苗生长迅速且
健壮。F29菌株处理的苗根系发达 , 有大量的新根产生。各菌液处理的苗均不同程度的提高了苗的成
活率 , F29、F80、F23、F58、F33处理苗的成活率分别为 100%、95%、85%、75%、75% , 比对照
分别高出 35、30、20、10和 10个百分点。
造成盆栽苗的处理植株中出现部分植株死亡的原因 , 可能是菌根化未获得成功 , 或由于菌液中含
菌量的不均匀 , 造成菌剂量过大 , 使共生关系失去平衡。
各菌液处理 90 d后苗平均鲜种增长率均高于对照 , F29、F80、 F23、 F58、F33处理苗分别比对
照高出 331244、211442、141847、31076和 11849个百分点 , 其中 F29、F80、F23、 F58与对照差异
达到了极显著 , F33菌株处理的苗也显著高于对照 (表 2, 图 4)。
接菌苗新生营养根中均分离获得了原接种菌株 (表 2) , 在 F33和对照处理苗中均分离到镰刀菌
( Fx) , 推测可能原因是早期浇灌的 F33菌液并未在苔藓上存活 , 而来自环境中的 Fx侵染成功 ; 或菌
株 F33与菌株 Fx能够很好的共生于五唇兰根部中。
表 2　盆栽菌根化苗栽培情况
Table 2　Culture of the m ycorrh iza l plan t of D oritis pu lcherrim a w ith pot
处理
Treatment
处理植株数
Number of treated
p lant
成活株数
Number of live
p lant
成活率 /%
Survival rate
平均鲜样质量增长率 /%
Average increment of fresh mass
菌株重分离
Reisolated
F23 20 19 95 5219523 3 F23
F29 20 20 100 7113493 3 F29
F33 20 15 75 3919543 F33, Fx
F58 20 15 75 4111813 3 F58
F80 20 17 85 5915473 3 F80
对照 Control 20 13 65 381105 Fx, Fy
　　注 : “3 ”差异显著 ( P = 0105) , “3 3 ”差异极显著 ( P = 0101)。
Note: “3 ”Significant difference ( P = 0105) , “3 3 ”Remarkably significant difference ( P = 0101) .
3　讨论
兰科菌根真菌为内生菌根类型 , 菌根化育苗首先要解决的就是兰苗菌根化的检测。在瓶内菌根化
育苗时 , 由于接种的菌株单一 , 采用菌根染色法可以快速检测菌根化的成功与否。移栽后的菌根化苗
和盆载菌根化苗的检测则采用真菌的重分离 , 既可观察到接种的菌根真菌的存活状况又可检测菌根化
苗的抗性。试验证明接种的菌根真菌可以在移栽苗的根中很好的生存 , 而且菌根化苗可以减少其它菌
种的侵染。
一直以来兰苗的种植受环境因素的影响很大 , 特别是组培苗的培育。目前兰花的组培苗在育苗棚
里经过精心的管理其成活率虽然可达到 80% ～90% , 但仍需经过几个月的炼苗才能稳定的成长并转
为常规的栽培管理 , 从炼苗到出棚所需的设备、材料、时间都大大增加了组培苗的成本。本试验的菌
根化苗在较为粗放的环境下 , 未经肥料、农药的管理 , 其成活率最高可达 100% , 且鲜样质量增长率
均高于同等条件下的无菌苗。可见菌根真菌在兰花育苗中的应用具有广阔的前景 , 不仅可为兰花工厂
的育苗节约成本 , 而且有望降低兰苗种植受环境因素的限制。
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