全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (1) : 137～139
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 03; 修回日期 : 2005 - 11 - 28
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30170649)
扁桃自交不亲和基因的多态性分析
马　艳 1, 2 　马荣才 2
(1 河北科技师范学院园艺系 , 昌黎 066600; 2 北京市农林科学院生物技术研究中心 , 北京 100089)
摘 　要 : 根据蔷薇科树种 S基因的保守序列设计引物 , 利用 PCR技术对 8个新疆扁桃品种 S基因进
行扩增 , 获得了 10个大小不同的 S基因片段。测序结果表明 , 这些 DNA片段的核苷酸序列中都具有编
码蔷薇科 S2RNAase 5个高度保守区域 : C1、C2、C3、RC4、C5的序列、编码高变区 ( RHV ) 的序列以
及变异度很大的内含子序列 , 并且其高变区和内含子序列具有扁桃 S基因特异性。同源性分析表明 , 获
得的 10个氨基酸序列与蔷薇科中李亚科 S2RNase的氨基酸序列同源性达 67% ～96% , 扁桃与樱桃、杏应
同属于李亚科。
关键词 : 扁桃 ; 自交不亲和 ; S基因 ; PCR; 序列
中图分类号 : S 66219　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120137203
Ana lysis on Polym orph ism of S Gene in A lm ond
Ma Yan1, 2 and Ma Rongcai2
(1 Hebei N orm al College of Science and Technical, Chang li 066600, Ch ina; 2B eijing A gro2biotechnology Research Center, B ei2
jing 100089, China)
Abstract: To investigate the characteristics of the S gene in almond, we degenerative p rimers according
to conservative sequence of S gene in rosaceous p lant and got 10 S gene fragments by PCR app lication from 8
almond cultivars in China. A ll sequences were aligned with S genes in GeneBank by BLAST software. The re2
sult indicated that all 10 fragments contained domain encoding 5 high conservation regions (C1, C2, C3,
RC4, C5) and hypervariable region (RHV) of rosaceous S2RNase . RHV and intron characterized S gene
furthermore. Homology analysis showed that the am ino acid sequence between putative pep tides from above S
gene fragments and that from S2RNase of rosaceous p lant were 67% - 96% of homology. A lmond should be
assigned to p lum subspecific group s with cherry and ap ricot.
Key words: A lmond; Self2incompatibility; S gene; PCR; Sequence
1　目的、材料与方法
扁桃 (Am ygda lus comm unis L. ) 是典型的配子体自交不亲和树种 , 生产中需要合理配置授粉树或
人工授粉。我们克隆并测序了部分扁桃优良品种的自交不亲和基因片段 , 希望通过对扁桃自交不亲和
基因进行研究 , 能够在分子水平上了解自交不亲和的机理 , 鉴定 S基因型 , 为生产上合理配置授粉
树、克服自交不亲和性带来的减产问题提供理论依据。
材料取自新疆喀什地区莎车县二林场品种资源圃 8个扁桃品种 : 矮丰 , 大巴旦 , 多果 , 寒丰 , 黄
双 , 双仁薄壳 , 晚丰 , 尖嘴黄。选取健壮、无病虫害的枝条 (带有新萌发的嫩叶 ) 插入吸水的海绵
中放入保鲜袋 , 扎紧袋口 , 竖立放在自制的冰盒里 , 24 h内运回实验室。将枝条上的嫩叶去柄剪下、
洗净 , 用吸水纸吸干叶面水分后放入保鲜袋中 - 70℃保存。
基因组 DNA的提取采用经过改进的 CTAB法。根据蔷薇科 S基因的保守序列设计引物 , 由上
海生工生物工程公司合成。引物序列为 : ① 5pi2CARTTYGTBCARCARTGGCC23pi; ② 5pi2CTATG2
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
GCAAAGTAATTATTCAACCC23pi; ③ 5pi2TACCACTTCATGTAACAACTG23pi; ④ 5pi2TGTTTGTTCCATTCG2
CYTTCCC23pi。
PCR反应体系为 : 10 ×PCR Buffer 5μL, MgCl2 (25 mmol·L - 1 ) 5μL, dNTP (10 mmol·L - 1 )
1μL, Lower (25μmol·L - 1 ) 1μL, Upper ( 25μmol·L - 1 ) 1μL, DNA ( 100 ng·μL - 1 ) 5μL,
ddH2 O 3112μL, TaqDNA酶 (3 U·μL - 1 ) 018μL, 总体积 50μL。循环条件 : 94℃ 2 m in; 循环中 :
94℃ 1 m in, 退火 58℃ 1 m in, 72℃ 2 m in, 共计 35个循环 ; 72℃延伸 10 m in。反应在 Perkin2Elmer2
thermocycler 2000 PCR仪上进行。
将 PCR扩增产物回收纯化后分别与 pUCmT载体连接 , 转化 DH5α菌株 , 蓝白斑筛选阳性克隆 ,
提质粒 , 酶切鉴定正确的克隆进行序列分析。将序列在 Genebank进行 BLASTx搜索 , 对其编码的氨
基酸序列进行同向排列 , 用 DNAStar 4105进行序列的对比。
采用距离系数法中的邻接法 ( neighbor joining method) , DNAStar 4105中的 Clustal Method进行系
统树的构建。
2　结果分析与讨论
211　扁桃 S基因的特异性扩增、测序及序列分析
为了研究扁桃的自交不亲和基因 , 作者根据
蔷薇科果树自交不亲和基因的保守序列设计引物 ,
以寒丰、黄双、双仁薄壳、尖嘴黄、晚丰、矮丰、
多果、大巴旦 8个扁桃品种基因组 DNA为模板 ,
进行 PCR 扩增得到 10个大小不同的片段 (图
1)。将这些片段进行克隆测序 (表 1)。
从所得序列推导其产物的氨基酸序列并进行
分析发现 , 分离的 10个 S基因片段编码的氨基酸
序列含有 5个高度保守的结构域 : C1、C2、C3、
RC4和 C5, 许多不定的位点被划分为高变区
(RHV ) , 并且这 10个 S基因片段高变区和内含
子序列具有 S特异性。在 5个不同区域中有 31个
完全保守位点。
用 BLAST软件 , 将所得的 S基因片段编码的
氨基酸序列与 NCB I网站蛋白质数据库中的 S2
RNase氨基酸序列进行比较发现 , 这 10个 S基因
片段编码的氨基酸序列与其它蔷薇科果树 S2
RNase基因同源性在 67% ～96%之间 (表 2)。我
国扁桃品种大巴旦 S基因编码的氨基酸序列与国
外扁桃 P runus du lcis S基因同源性为 96% , 说明
蔷薇科李属植物扁桃、杏、甜 (酸 ) 樱桃 S2
RNase基因有着相同的进化机制和共同的起源。
212　扁桃与其他蔷薇科树种的亲缘关系分析
将本研究中所得到的 10个基因与目前蔷薇科
中已知的 S2RNase进行比较 , 构建系统进化树如
图 2所示。这些物种通过 S2RNase进行分类可分
为两大类 : 苹果亚科和李亚科 , 与常用传统分类
表 1　我国扁桃 8个品种的 10个 S2RNa se基因
Table1　10 new S2RNa se genes of 8 a lm onds in Ch ina
品种
Cultivars
定名
Denom ination
片段大小
The fragment
of length ( bp)
登录号
GenBank
accession No.
矮丰 A ifeng S512RNase 997 AY613338
大巴旦 Dabadan S522RNase 1 713 AY613339
大巴旦 Dabadan S532RNase 2 021 AY613340
多果 Duoguo S542RNase 775 AY613341
多果 Duoguo S552RNase 1 685 AY613342
寒丰 Hanfeng S562RNase 775 AY613343
黄双 Huangshuang S572RNase 787 AY613344
双仁薄壳 Shuangren Baoke S592RNase 1 359 AY613346
晚丰 W anfeng S602RNase 973 AY613347
尖嘴黄 J ianzuihuang S642RNase 992 AY613920
图 1　扁桃 S2RNa se基因扩增产物的 018%琼脂糖凝胶电泳结果
M: 1 kb分子量标准 ; 1. 寒丰 ; 2. 黄双 ; 3. 双仁薄壳 ; 4. 尖嘴黄 ;
5. 晚丰 ; 6. 矮丰 ; 7. 多果 ; 8. 未采用品种 ; 9. 大巴旦。
F ig. 1　018% agrose gel electrophoresis of S2RNa se genes
am plif ied product of a lm ond
M: 1 kb molecular marker; 1. Hanfeng; 2. Huangshuang;
3. Shuangren Baoke; 4. J ianzuihuang; 5. W anfeng; 6. A ifeng;
7. Duoguo; 8. A non2adop ted cultivar; 9. Dabadan.
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　1期 马 　艳等 : 扁桃自交不亲和基因的多态性分析 　
结论相同。从此系统树中可以看出 , 扁桃和杏、樱桃亲缘关系比较近 , 同属于李亚科。亚科内 S2
RNase的相似性 (9915% ) 比亚科间的相似性 (1014% ) 高。在进化系统树中 , 蔷薇科 S2RNase形成
专一性亚科亚种 , 但没有形成专一性种 , 两个亚科的 S2RNase可能是一个共同祖先 , 因为它们都有蔷
薇科特有的保守区域 RC4。
图 2　蔷薇科中系统树的构建
F ig. 2　Ne ighbour2jo in ing genetic tree of Rosaceae S2RNa se
213　讨论
扁桃生产中受粉树配置不当是是造成产量低的一个重要原因 , 为了合理配置受粉树就必须要正确
鉴定 S基因型。目前鉴定 S基因型所用方法主要是利用 S等位基因专一的 PCR与限制性内切酶分析
结合 , 从 DNA水平上鉴定 S基因型〔2, 3〕。这一方法利用已经具有的 S2RNase基因序列 , 设计专一的
PCR引物 , 并且对 PCR产物进行序列专一的内切酶分析 , 其前提是要克隆有关的基因 , 然后才能研
究这些基因的组合。目前我国扁桃 S基因的等位基因的数量和组成还不清楚 , 还没有分子水平的鉴定
S基因的方法。为了有效确定鉴定我国扁桃等位基因的方法还需要做大量细致的工作。
参考文献 :
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