全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1321～1324
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 02 - 21; 修回日期 : 2006 - 07 - 28
基金项目 : 北京市自然科学基金资助项目 (6052004) ; 北京市属市管高校人才强教计划资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: qinlingbac@1261com)
短雄花序板栗芽变的 AFL P分析
徐　月 1, 3 　曹庆芹 2 　冯永庆 1 　杨　凯 2 　秦　岭 13 　廖　康 3
(1 北京农学院植物科学技术系 , 北京 102206; 2 北京农学院生物技术系 , 北京 102206; 3 新疆农业大学园艺学院 , 新
疆乌鲁木齐 830052)
摘 　要 : 利用 AFLP分子标记技术对板栗短雄花序芽变及其母株进行了初步研究 , 72种引物组合共产
生 5 129条清晰谱带 , 多态性位点 53个 , 多态性 2105% , 相似性系数 019897, 差异片段主要集中于 300～
900 bp之间。研究表明短雄花序芽变和对照个体之间变异与遗传物质的改变相关 , 其中一些可能与雄花序
变短的基因有关。
关键词 : 板栗 ; 芽变 ; 短雄花序 ; AFLP
中图分类号 : S 66412　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621321204
AFL P Ana lysis on the Short Ca tk in sM uta tion of Chestnut
Xu Yue1, 3 , Cao Q ingqin2 , Feng Yongqing1 , Yang Kai2 , Q in L ing13 , and L iao Kang3
(1D eparm ent of P lant Science and Technology, B eijing U niversity of A griculture, B eijing 102206, Ch ina; 2D eparm ent of B iology
Technology, B eijing U niversity of A gricu lture, B eijing 102206, China; 3 Institu te of Horticulture, X in jiang A gricu ltura l U niversity,
U rum chi, X injiang 830052, China)
Abstract: AFLP was used to compare the short catkins sport and its mother p lant in chestnut (Castanea
m ollissim a B l. ). A total of 72 selective p rimer pairs amp lified 5 129 clear bands, of those 53 were polymor2
phic loci. The polymorphic rate and Neipis association coefficient between them were 2105% and 019897
respectively. The molecular weight range of the polymorphic fragments was mainly 300 - 900 bp. The results
indicated that there were some molecular2level differentiation between chestnut and its short catkins sport.
Some of the specific segments had been considered as markers of short catkins in chestnut.
Key words: Chestnut; Sport; Short catkin; AFLP
1　目的、材料与方法
板栗 (Castanea m ollissim a B l. ) 短雄花序芽变是 1995年在北京密云县推广板栗疏雄技术时发现
的 , 承租人反映一株树的一大枝上雄花序极短 , 不需要疏雄剂处理。该芽变最显著的特征是雄花序短
小 , 母株雄花序平均长度约 14 cm左右 , 而芽变的雄花序长度仅为 2 cm左右。芽变母株是一株自然
实生变异体 , 在同一株树上分为两个大枝 , 一个枝上的雄花序正常 , 而另一枝上的雄花序短小 , 观察
树基部 , 无嫁接的迹象 , 经与树主人核对 , 证明没有嫁接〔1〕。笔者采用 AFLP (Amp lified Fragment
Length Polymorphism) 技术对该板栗短雄花序进行遗传差异分析 , 以期从 DNA分子水平揭示对照与芽
变之间的差异及表现形式 , 为进一步对这些差异片段克隆测序并研究其序列构成 , 揭示板栗短雄花序
芽变的分子机理等奠定基础。
于 2005年 5月初采集芽变母树上对照枝和芽变枝新萌发的嫩叶。采用改良 CTAB法〔2〕提取 DNA。
AFLP技术参照 Vos等〔3〕的方法。板栗 AFLP反应体系参照文献 〔4〕: 取 500 ng DNA样品 , 用 EcoR I
和 M se I (BB I) 各 5 U于 37℃下酶切 6 h, 反应体积为 25μL; 酶切后 , 加入 EcoR I和 M se I接头各
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50 pmol, ATP 10 mmol, T4 2DNA连接酶 2 U , 于 37℃连接 12 h; 然后取稀释 1倍的连接样品 5μL,
加入 E00和 M00引物各 100 ng, 用 015 U Taq酶 (BB I) 进行预扩增 , 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2
m in, 共 30个循环 , 反应体积为 20μL; 预扩增产物稀释 20倍后取 5μL, 加入选定的 EcoR I和 M se I
引物各 75 ng, 进行梯度 PCR选择性扩增 94℃ 30 s, 65℃ 30 s (每循环降低 017℃, 12个循环后为
5616℃ 30 s, 再进行 25个循环 ) , 72℃ 2 m in。扩增产物各加入 10μL Loading Buffer, 混匀 95℃变性
5 m in后冰浴 , 取 4μL样品于 610%变性聚丙烯酰胺凝胶中 , 用 B io2Rad PAC3000电泳系统 75 W恒功
率下电泳 2 h, 银染分析。
2　结果分析与讨论
211　扩增引物的筛选
以 9种 E端引物和 8种 M端引物共 72种引物组合对芽变和对照进行 AFLP分析 (图 1为部分电
泳图谱 )。据全部电泳图谱统计 , 共出现 5 129条可分辨的 AFLP带 (为了确保准确性和可靠性 , 只
记清晰谱带 )。初步观测发现 : 与对照相比 , 芽变母株的扩增片段出现质 (扩增片段有无及片段数 )
或量 (强弱 ) 的变化。其中有 24种引物组合产生差异片段 , 多态性位点 53个 , 差异片段的最小分
子量 120 bp, 最大分子量 1 200 bp, 大部分集中在 300～900 bp。推测其中的一些差异片段可能与雄
花序变短这一性状有关 , 有待进一步研究验证。各组合出现的带型数如表 1所示 , 产生差异片段的引
物组合和分子量大小如表 2所示。
图 1　引物组合 E端 ACA, ACC, ACG和 M 端 CTA, CAG, CTG对芽变 ( S) 和对照 ( C) 的 AFL P电泳图谱
F ig. 1　D NA band pa ttern s of sport ( S) and con tra st ( C) am plif ied by pr im er com b ina tion
E2ACA, ACC, ACG and M 2CTA, CAG, CTG
1: E2ACA /M2CTA; 2: E2ACA /M2CAG; 3: E2ACA /M2CTG; 4: E2ACC /M2CTA; 5: E2ACC /M2CAG;
6: E2ACC /M2CTG; 7: E2ACG/ M2CTA; 8: E2ACG/ M2CAG; 9: E2ACG/ M2CTG.
2231
　6期 徐 　月等 : 短雄花序板栗芽变的 AFLP分析 　
表 1　各引物组合出现的 AFL P带数及其多态性
Table 1　AFL P fragm en t num ber am plif ied by d ifferen t pr im er com b ina tion
引物 Primer M2CTT M2CAT M2CAA M2CTA M2CAG M2CTG M2CAC M2CTC
E2AAC 66 53 59 52 62 57 (1) 90 132 (2)
E2AGG 62 (2) 53 58 60 84 56 79 (3) 132 (6)
E2AGT 66 52 74 (2) 68 (2) 59 (1) 66 66 92 (2)
E2ACA 45 (1) 52 92 56 44 52 (3) 72 68
E2ACC 84 75 (1) 46 60 104 76 74 84
E2ACG 43 78 68 75 (1) 48 70 88 (2) 92 (3)
E2ACT 74 (4) 75 (3) 83 (1) 46 44 60 72 (3) 88
E2AGC 98 (3) 62 96 65 (1) 56 38 80 76
E2AAG 80 106 58 70 (2) 93 (3) 131 (1) 68 66
　　注 :括号内是观测发现的差异带数。
Note: Numbers in bracket show the specific segments found by elementary observation.
表 2　芽变和对照 AFL P扩增产生差异片段的结果
Table 2　Polym orph ic fragm en ts between sport and con tra st
引物组合
Primers
分子量
Base pair
芽变
Sport
对照
Contrast
引物组合
Primers
分子量
Base pair
芽变
Sport
对照
Contrast
E2AAC /M2CTC 450 - E2ACA /M2CTT 330 -
550 - E2ACA /M2CTG 920 -
E2AAC /M2CTG 600 - 580 -
E2AGG/M2CTT 160 - 340 -
270 - E2ACC /M2CAT 350 -
E2AGG/M2CAC 540 - E2ACG/M2CTA 580 -
670 - E2ACG/M2CAC 870 -
950 - 900 -
E2AGG/M2CTC 230 - E2ACG/M2CTC 450 -
310 - 550 -
330 - 680 -
600 - E2ACT/M2CTT 290 -
850 - 300 -
900 - 340 -
E2AGT/M2CAA 340 - 1 200 -
400 - E2ACT/M2CAT 860 -
E2AGT/M2CTA 520 - 920 -
750 - 1 100 -
E2AGT/M2CAG 520 - E2ACT/M2CAC 350 -
E2AGT/M2CTC 650 - 400 -
760 - 420 -
E2ACT/M2CAA 700 - E2AAG/M2CTG 340 -
E2AGC /M2CTT 350 - E2AAG/M2CAG 430 -
620 - 560 -
700 - 660 -
E2AAG/M2CTA 330 - E2AGC /M2CTA 150 -
370 -
　　注 :“ - ”表示差异带。
Note:“ - ”show the specific fragments.
212　短雄花序芽变与对照的遗传相似性分析
为进一步说明芽变与对照之间的差异程度 , 对多态性进行了统计分析。采用 Nei & L i (1979) 的
遗传相似系数 ( Genetic Sim ilarity, GS) , 其计算公式 : GS = 2N ij / (N i + N j ) , 其中 N ij表示样本 i和 j
的公共带数 , N i、N j分别是样本 i、 j的带数 ; 遗传距离 D = 1 - GS。多态性 ( % ) =多态性片段数 /
总扩增片段数 ×100 = (N i +N j - 2 N ij ) / (N i +N j - N ij ) ×100。
扩增结果中迁移距离相同为单态性片段 , 否则为多态性片段。据表 2, 通过 72种引物组合分析
芽变和对照 , 筛选出 24个有差异片段的多态性引物组合 , 芽变和对照各有 2 565条和 2 564条可辨清
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晰谱带 , 共有谱带 2 538条 , 53条多态条带数 , 多态百分比 2105% , 相似系数 019897, 两者之间的
遗传距离是 010103。表明芽变与对照的遗传背景虽然基本一致 , 但是芽变的遗传物质发生较大的变
化。这些多态性片段可能与花序变短形成的结构基因有关 , 或者与这些基因的表达调控有关 , 但它们
是否全部与雄花序变短的变异相关 , 以及对相关片段的研究 , 还有待深入。
参考文献 :
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Beijing Agriculture College, 2005, 20 (3) : 1～5 ( in Chinese)
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4　徐红梅. 中国板栗品种遗传多样性和遗传结构的 AFLP分析及其品种数据库的建立 : 〔硕士论文 〕. 乌鲁木齐 : 新疆农业大学 ,
2004. 16～20
Xu H M. Genetic diversity and genetic structure of Chinese chestnut by AFLP analysis and the establishment of database about varietal resource
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