全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(4)：487～490
Aeta Horticuhurae Sinica — —
利用 RAPD标记鉴定和区分梅花 42个宫粉型品种
张俊卫 柴玉荣 包满珠
(华中农业大学园艺林学学院，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070)
摘 要：利用 RAPD标记，对形态特征相似的42个宫粉型梅花品种的基因组 DNA进行随机引物 PCR
扩增。从 120个引物中筛选出21个引物，共扩增出96条谱带，其中多态性谱带 68条，占扩增谱带数的
70．8％，品种问相似系数范围为0．737～0．961。在21个引物中，7个引物扩增的谱带可区分27个品种，7
个引物相互组合可区分其余的 l5个品种。梅花品种RAPD指纹图谱的建立可以为品种知识产权保护提供依
据。
关键词：梅花；宫粉型；RAPD；指纹图谱
中图分类号：S 685．17 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2004)04-0487-04
RAPD Identification and Discrimination of 42 Ornamental Pink Double Form
Cultivars of P nus mume Sieb．et Zucc．
Zhang Junwei，Chai Yurong，and Bao Manzhu
(Key Laboratory of Horticultural Plant Biology，Ministry of Education，College of Horticulture and Forestr) Sciences，Huazhong
Agricultural University，Wuhan 430070，China)
Abstract：The genomic DNA was used as template and random primers were used to develop fingerprint—
ing of 42 cuhivars of Pink Double Form of Pr“n aurae Sieb． et Zucc． by PCR． Of the 120 primers
screened．21 primers can generate 96 fragments，70．8％ of which were polymorphic ones．The similarity c0ef-
ficient of cultivars was between 0．737—0．96 1．The 42 cuhivars can be identifed and discriminated eficiently
with seven primers．The establishment of RAPD fingerprinting is applicable in cuhivar identifcation and
breeders rights protection of Pr“m aurae．
Key words：Prunus aurae；Pink Double Form ；RAPD；Fingerprinting
梅花 (Prunus murn~Sieb．et Zucc．)宫粉型品种出现于汉代，在品种演化上为出现较早的类型，
分化极其丰富复杂，是一个高度杂合的群体。以往的形态描述和蛋白质水平研究提供的信息有限，难
以揭示品种间的本质差异。
在梅的RAPD研究方面，国内刘青林等⋯1999年用 3个引物对28个梅栽培品种、8个梅花杂交
种、8个近缘种进行了RAPD研究，国外 Shimada等 1994年对日本的果梅品种进行了RAPD分析，
Ozaki等 1995年用 RAPD技术进行梅的亲子鉴定，但这些研究所选用的梅花品种缺乏系统性，不能
显示RAPD在梅品种分类与鉴定中的作用。作者用 RAPD技术对42个梅花宫粉型品种进行分析，并
对品种进行区分、鉴别，以期构建宫粉型梅花品种的指纹图谱。
1 材料与方法
供试的42个梅花宫粉型品种 (表 1)采自武汉市梅园中国梅花研究中心的品种资源圃。
DNA提取：采集幼嫩干净的叶片，保存于4℃冰瓶带回实验室。将叶片用蒸馏水冲洗后用吸水纸
收稿 日期：2004—03—29；修回日期：2004—06—07
基金项目：国家自然科学基金 (30170666)项目；教育部骨干教师资助计划项目；高校博士点基金资助项目
$通讯作者 Author for correspondence
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吸干，取0．1 g左右于研钵内，加液氮研磨至细
粉状，转入 1．5 mL离心管，加入 1 mL 65~C预热
的提取 液 (0．5 tool·L～ Tris—HC1，0．05 tool·
L～ EDTA．0．5 tool·L～ NaC1。 2％ PVP， 1．4％
SDS，0．5％ 13一巯基乙醇，pH 5．5)于65℃下水
浴30 rain。水浴结束后离心 (8000 r·rain～，15
rain)，上清液转入另一干净离心管；加入2／3体
积的2．5 tool·L KAe(pH 4．8)，冰浴 30 min。
冰浴结束后离心 15 rain(8000 r·rain )，上清
液转入另一干净离 t2,管，加等体积～20~C预冷的
异丙醇沉淀DNA (放置于 一20℃冰箱中20 rain)。
最后离心 15 rain(8000 r·rain )，去上清液。
沉淀用 一20℃预冷的70％乙醇清洗后，室温干
燥，干燥后的DNA用TE溶解。
DNA纯化：向 DNA溶液中加入 RNase A(1
mg·L )5 L，37℃水浴 30 rain；然后加入等
体积氯仿：异戊醇 (24：1)抽提，离心 15 rain
(8000 r·min )，上清液转入另一干净离心管，
用0．6倍体积的一20℃异丙醇沉淀DNA 30 rain，
离心 10 rain(10000 r·rain )，弃上清液，用
70％预冷乙醇清洗管壁后，在室温下干燥 DNA，
最后用适当体积TE溶解DNA。
表1 用于RAPD分析的梅花宫粉型品种
Table 1 Cultivars of Pink Double Form of Itlu$mume
usedforRAPD
譬品种名称
N o
C“1ti ar
品种名称
N o
C“lti
虎丘晚粉 Huqiu Wanfen 22
洪岭二红 Hongling Erhong 23
玫粉台阁 Meifen Taige 24
算珠台阁 Suanzhu Taige 25
小鸥宫粉 Xiao’OH Gongfen 26
贵妃台阁 Guifei Taige 27
银红台阁Yinhong Taige 28
桃红台阁 Taohong Taige 29
晚碗宫粉Wanwan Gongfen 30
大羽 Dayu 31
凝馨 Ningxin 32
粉皮宫粉 Fenpi Gongfen 33
淡妆宫粉Danzhuang Gongfen 34
娇枝 Jiaozhi 35
大宫粉 Da Gongfen 36
复瓣小宫粉Fuban Xiao Gongfen37
小红 Xiaohong 38
蔡山宫粉 Caishan Gongfen 39
JI西小粉 Chuanxi Xiaofen 40
方流阁Fangliuge 41
乙女 Yinti 42
绿枝宫粉Lazhi Gongfen
红粉台阁nongfen Taige
白阁宫粉Baige Gon n
老人美大红[aorenmei Dahon~
磨山宫粉 Moshan Gongfen
富春Gongchun
南京红 Nangjing Hong
扣瓣大红 Kouban Dahong
粉口Fenkou
重瓣粉朱 Chongban Fenzhu
粉桩台阁 Fenzhuang Taige
淡晕宫粉 Danyun Gongfen
惊蛰Jingzhe
淡粉 Danfen
人面桃花 Renmian Taohua
迎春 Yingchun
早凝馨 Zao Ningxin
江南 Jiangnan
粉红 Fenhong
粉玉宫粉 Fenyu Congfen
重瓣粉口Chongban Fenkou
PCR扩增仪为Perk Elman公司的GeneAmp 9700。随机引物参照El本Shimada 和Ozaki 3 所做的
工作以及 PCR扩增对 G+C含量的要求，随机选取 Sangon公司生产的S 。～S。∞，S， ～S，∞120个，
Taq酶为上海BioStar公司产品，dNTPs为Sangon公司产品。
扩增反应条件：PCR扩增总反应总体积20 L，其中含20 ng模板 DNA，1．5 mmol·L～MgC1，，
1×bufer，dNTPs 100 Ixmol·L一，Taq酶1 U，引物0．4 Ixmol·L一。对照加入除模板DNA外的以上
各成分，用双蒸水代替总DNA。
扩增程序 ：94oC 3 rain，1个循环；94oC 30 S，36oC 50 S，72oC 90 S，38个循环；72℃ 10 rain。
样品冷却到4 后取出电泳。
电泳检测：RAPD产物用 1．4％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 1×TAE。用200 bp DNA ladder
作分子量标记。在凝胶中加入0．5 Ixg·mL 的EB。电泳完毕于紫外透射仪上观察拍照。
记录每个引物扩增的谱带数，有带记为 “1”，无带记为 “0”。用 200 bp DNA ladder作分子标
记，对照反应产物在胶上的对应位置，得到原始数据。计算品种间的遗传距离。
2 结果与分析
2．1 随机引物筛选及 PCR扩增结果分析
本试验筛选了Sangon公司的s ～s。∞，S 一$36o共计120个 10寡核苷酸的随机引物，选出的42
个引物对42个品种进行PCR扩增，再次筛选。筛选条件为：①条带清晰，不弥散，不模糊；②所有
的样品均有质量好的条带；③空白中无或少假带；④条带重复性好。最后，筛选出21个引物，其扩
增结果用于遗传分析。图1为随机选取的21个引物之一的S 嘶引物扩增的结果，从图中可以看出，
该引物从42个宫粉型梅花品种间共扩增出8条谱带，其中3条为共有带，其余 5条为多态带，具有
2 ， 4 6 7 8 9
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4期 张浚 等：利用RAPD标f 鉴定{¨ 忤悔化42个目粉 盟 } !
较高的多态性．21个引物共扩增出96条带．多态性谱带比例为70，8％．引物与基罔组 I)NA随机结
合，最多扩增的值点有12个．最少有2个．21个 I物平均扩增的位点数为5～6个，扩增产物的分
子量集中在0．38～2 2 kb之间 、j=】l=验数据的统汁分析表明，42个梅花宫粉型品种的相似系数 为
0．73"／～0．961，说H玎型内晶利t间较为相似 差异较小。
圉 1 l勘 s106扩增的42个宫jli}型梅花品种的 RAPD图谱
浊道 l～42 li^ 刮芏 依跌化表宫柑 癣也 ：审 ftA的品种 I．E袭 1l M～!∞ 14-DNA怀 己．43 中l】计j!f{
P ． 1 I_he profile of RAPD of42 Pink Double Form ~~ltivars of m mP amplifed with Slit
hine~I一42 from rigJ,iIoleli⋯ h¨{l川 w n ^-lr Pink[~auMeIon1nLIt⋯ t：uJl⋯ u-；cd n li sl~t⋯ Iahl rI1：
M !呻 DNA la一 ：43 lane is the uegati⋯ l litrol
2．2 聚类分析
根据RAPD数据计辣品种的遗传距离．用系统聚茭法对42个宫粉型品种进行聚獒j}析，得到
UPGMA村状聚类图 (图2)．从图2中可以看出．昔以类平均距离1．0为聚台线，42 1 宵粉 悔花·
种大致可分为3个聚合群，其巾聚类群I包含的品种最多 (30个)．聚类群 lI包含的品种疚之 (9
个)，聚类群IⅡ最少 (3个) 聚娄群I巾的品种比较复杂．既有重瓣，也有复瓣品种，既有花色较
淡的品种．亦有花色较深的- 种，从形苍 J．看没有一定的姚律性；聚类群 ll中的品种除 ’桃 台
阁’、‘洪岭二红’为桃红色花色外．其余7个品种为淡色审瓣品种；聚类群 II包含 ‘虎丘晚精’、
‘复瓣，】、官粉’、‘淡粉’3个品种．多 开花相对较晚的品种
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丽而
2．3 42个宫粉型品种的DNA指纹
经过引物筛选，扩增产物分析，7个随机引物L543、s62、$65、$74、$95、SI26 $344或其组
合可以把42个 种 分开 (袁2)，其中分别用一个引物即可以区分的品种有27个，其余的 I5个
品种需两个引物组台才能区分 7个随机引物产生4()个RAPD标记+可用于掏建 行品种的指纹
图谱
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3 讨论
开发稳定可靠、信息丰富、区分能力较强的
遗传标记，对植物遗传育种，品种鉴定、保护、
开发和利用是非常必要的。新一代的分子标记如
RAPD用于植物遗传分析、品种鉴别具有操作简
单、方便、不需要知道物种遗传背景等特点，但
该标记对反应条件敏感，故其稳定性直接关系到
试验结果的可靠性。本试验使用了严格一致的反
应条件及扩增程序，选取具有重复性的强带进行
分析，以确保结果的准确性。在 RAPD扩增循环
中，Mg“、DNA浓度、Taq酶对扩增的可重复性
影响较大，使用较低的 Mgh、DNA浓度以及同
批量同剂量的 Taq酶可增强 RAPD结果的稳定性 ；
使用 1．5 mmol·L Mg“、20 ng DNA浓度、1 U
同批量Taq酶，每试验重复 3次，3次试验结果
除少数弱带外，其它谱带基本相同，因而试验结
果是可靠的
表2 品种 RAPD指纹分析的所用随机引物及
鉴别宫粉型梅花品种的编号
Table 2 The random pdme~ for RAPD fingerprinting and No．of
distinguished cultivars of nk Double Form
引物 区分的宫粉型梅花品种编号 扩
Nu
增
mb
带
er
数
of
‘
a
多
m
态
pli
带
fied
数
b a d
“andorn N0．of cuItiv躺distin ished (Number of pdymorphic
p bands)
$62 11，16，17，29，31，35，38 10(10)
$65 8，23，30，36，39 5(4)
$74 6，13，14，18，21，37，41，42 6(6)
$95 28 6(4)
Sl26 1．4，25．33．34 9(6)
S344 2 4(3)
$65+$95 9，12，19
$43+S344 5．32
$62+$74 10，24，27
S43+$74 7
$43+$65 20．22
Sl26+S62 l5
$43+$62 3．26
S65+$74 40
梅花宫粉型品种一般为花色粉红，复瓣至重瓣的品种，但在花粉形态 和同工酶 谱带上表现
出较大的差异，显示为杂合度较高的品种。本试验选取的42个品种多为传统栽培品种，其中15个品
种在2O世纪6O年代已有记载。这42个品种问形态上的差异极小，只有在开花时才能辨认。RAPD
结果也显示这些品种差异较小，如有些品种问的相似性达0．961，这与观赏植物，只要观赏性状有变
异，且变异能保留，即被列为新品种相符。尽管试验最终能把42个宫粉型品种区分开，说明RAPD
用于梅花品种鉴别是可行、有效的，但需要多个引物以及多个引物的组合才能将其鉴别。造成这种情
况的原因可能有两个方面，一是RAPD的鉴别能力有限，需选用扩增谱带更多、扩增信息量更大的分
子标记，如AFLP；二是筛选的引物量不够，使用的扩增引物不太适合梅花宫粉型品种的鉴定，可通
过筛选更多的引物，扩增较多的多态性谱带，达到鉴别的目的。
梅花品种目前已有300多个，有些在形态上极易混淆，如 ‘虎丘晚粉’与 ‘虎丘淡晚粉’；‘宫
粉’和 ‘小宫粉’，‘深小宫粉’，‘重瓣小宫粉’等。本研究认为RAPD方法可与梅花品种的花粉形
态，染色体核型 ¨，同工酶谱带研究互为补充，从而解决目前生产、科研中存在的问题，为梅花品
种的管理、保护及品种登录提供依据。
参考文献：
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7 黄燕文，包满珠，沈清宇，等．野梅和栽培梅染色体数目及形态的研究．北京林业大学学报．1995，17(1)：37 41
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