全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (6) : 1121～1124
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 12 - 22; 修回日期 : 2005 - 05 - 11
基金项目 : 广东省科技攻关项目 (2002A204, 2003A2010401)3 通讯作者 Author for correspondence
中国兰属植物种间及品种间亲缘关系的 RAPD分析
孙彩云　张明永　叶秀 3 　梁承邺　夏快飞
(中国科学院华南植物园 , 广州 510650)
摘 　要 : 利用 RAPD分子标记分析中国兰属 (Cym bid ium ) 的 28个原生种和部分种的不同品种及 3个
杂交种共 50个材料间的亲缘关系。获得 250条可明显区分的 DNA扩增片段 , 除 S1432850 bp 1条带为全部
材料共有外 , 其余带均为多态性位点。这些带最大的为 2 100 bp, 最小的为 200 bp, 以集中在 1 031～300
bp的带居多。UPGMA进行聚类分析显示 : RAPD的聚类树状图所呈现出的亲缘关系大体与 ITS系统发育树
一致。建兰亚属可能为一自然类群。大花亚属并非自然类群 , 其成员之一文山红柱兰 (C. W enshanense Y.
S. W u et. ) 偏离出去而与兰亚属聚在一起。兰亚属则为一高度异质性的类群 , 分散成互不关联的 3支。本
结果和 ITS系统发育分析表明 , 有必要对经典分类的兰属属下分类 , 特别是兰亚属进行修订。对 3个亚属
中各组的划分基本与传统分类的一致。春兰品种间的多样性高于其它测试品种。
关键词 : 兰属 ; 兰科 ; RAPD
中图分类号 : S 682131; Q 941 + 12　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0621121204
Studies on Rela tionsh ip between Spec ies, Cultivars of Cym bidium Using RAPD
Sun Caiyun, Zhang M ingyong, Ye Xiulin3 , L iang Chengye, and Xia Kuaifei
(Sou th China Institu te of B otany, Chinese A cadem y of Sciences, Guangzhou 510650, China)
Abstract: Cym bid ium is a genus with very important values of horticulture. In the p resent study genetic
closeness of various species of Cym bid ium was determ ined using RAPD. A total of 250 amp lified bands was
gotten from all PCR reactions by 12 selected p rimers, and their band size was from 200 bp to 2 100 bp. Ex2
cep t of the 850 bp band amp lified from S143 p rimer, all other amp lified bands were diversity locus, and most
of the bands were located between 1 030 bp and 300 bp. The UPGMA dendrogram showed some congruence
with the p revious ITS phylogeny, which revealed the paraphyly of subgen. Cyperorch is, and high polyphyly of
subgen. Cym bid ium. The subgroup s within each subgenus revealed by the RAPD were, however, correspond
to the traditional taxonomy based on gross morphology. This study also shows higher genetic diversity of C.
goering ii, being cultived for long history, than other Cym bid ium species.
Key words: Cym bid ium ; O rchidaceae; RAPD
1　目的、材料与方法
日本学者曾应用 RA PD技术对兰属 ( Cym bid ium ) 36个栽培品种的遗传多样性进行研究〔1〕。
国内梁红健等〔2〕用 RA PD对中国兰属 5个种 19个品种的亲缘关系进行探讨。张明永等〔3〕用 PCR
扩增和直接测序的方法分析兰属的 27个种、3个栽培种和 3个外来类群间的核 DNA ITS序列。
研究结果表明大花亚属和兰亚属都表现为一复系群 , 建兰亚属为一并系群 , 各亚属内组间的关
系不明确。
本研究利用 RAPD技术研究兰属的 50个材料 , 包括 28个原生种 , 3个变种 , 16个品种 , 3个杂
交种的遗传多样性和亲缘关系。材料详见表 1。
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
表 1　试验所用种或品种
Table 1　The spec ies, cultivars of Cym bidium for RAPD
编号
Code
种或品种
Species or cultivars
来源
Source
编号
Code
种或品种
Species or cultivars
来源
Source
1 纹瓣兰 C. aloifolium (L. ) Sw 云南 26 墨兰 C. sinense (Jackson ex Andr. ) W illd. 广东
2 西山纹瓣兰 C. aloifolium (L. ) Sw‘xishan wenbanlan’云南 27 白墨 C. sinense (Jackson ex Andr. ) W illd.‘baimo’ 广东
3 下关纹瓣兰 C. aloifolium (L. ) Sw‘xiaguan wenbanlan’云南 28 线艺墨兰 C. sinense (Jackson ex Andr. )W illd.‘xianyi molan’ 云南
4 硬叶兰 C. bicolor lindl. Subsp. obtusum Du Puyet Cribb 云南 29 海南墨兰 C. sinense (Jackson ex Andr. ) W illd.‘hainan molan’海南
5 冬凤兰 C. dayanum Rchb. f. 云南 30 黑墨 C. sinense (Jackson ex Andr. ) W illd.‘heimo’ 广东
6 多花兰 C. floribundum L indl. 云南 31 企黑 C. sinense (Jackson ex Andr. ) W illd.‘qihei’ 广东
7 台兰 C. floribundum L indl. ‘ tailan’ 云南 32 软剑白墨 C. sinense (Jackson ex Andr. ) W illd.‘ruanjian baimo’华南植物园
8 果香兰 C. suavissim um Sander ex C. Curtis 云南 33 落叶兰 C. defolia tum Y. S. W u et S. C. Chen. 云南
9 西藏虎头兰 C. tracyanum L. Castle 云南 34 莎叶兰 C. cyperifolium W all. ex L indl. 云南
10 虎头兰 C. hookerianum Rchb. f. 云南 35 寒兰 C. kanran M akio 广东
11 滇南虎头兰 C. w ilsonii (Rolfe ex Cook) Rolfe 云南 36 青寒兰 C. kanran M akio‘qinghanlan’ 广东
12 美花兰 C. insigne Rolfe 浙江 37 紫寒兰 C. kanran M akio‘zihanlan’ 云南
13 朱砂蝉兰 C. irid ioides D. Don 云南 38 蕙兰 C. faberi Rolfe. 云南
14 长叶兰 C. ery thraeum L indl. 云南 39 春兰 C. goering ii (Rchb. f. ) Rchb. f. 云南
15 碧玉兰 C. low ianum (Rchb. f) Rchb. f. 云南 40 朵香 C. goeringii (Rchb. f. ) Rchb. f. ‘duoxiang’ 云南
16 文山红柱兰 C. wenshanense Y. S. Wu et F. Y. L iu 云南 41 豆瓣兰 C. goeringii(Rchb. f. ) Rchb. f.‘doubanlan’ 云南
17 莎草兰 C. elegans L indl. 云南 42 春剑 C. goering ii (Rchb. f. ) Rchb. f. var. longibracteatum 云南
18 大雪兰 C. m astersii Griff. ex L indl. 云南 43 白花春剑 C. goering ii (Rchb. f. ) Rchb. f.‘baihua chunjian’ 云南
19 马关兰 C. m astersii Griff. ex L indl.‘maguan lan’ 云南 44 广东朵香 C. goering ii (Rchb. f. ) Rchb. f.‘duoxiang’ 广东
20 独占春 C. eburneum L indl. 云南 45 莲瓣兰 C. L ianbanlan Tang etW ang 云南
21 象牙白 C. eburneum L indl.‘xiangya bai’ 海南 46 黄花莲瓣兰 C. L ianban lan Tang etW ang‘huanghua lianbanlan’云南
22 斑舌兰 C. tigrinum Parish ex Hook. 云南 47 兔耳兰 C. lancifolium Hook. 云南
23 韶关建兰 C. ensifolium (L. ) Sw. ‘shaoguan jianlan’ 广东 48 白墨 ×象牙白 C. S inense ×C. eburneum 华南植物园
24 大青 C. ensifolium (L. ) Sw.‘daqing’ 广东 49 西藏虎头兰 ×象牙白 C. tracyanum ×C. eburneum 华南植物园
25 铁骨素 C. ensifolium (L. ) Sw. ‘ tiegusu’ 云南 50 大花蕙兰 C. ×hybridus 华南植物园
总 DNA的提取主要用常规 CTAB法〔4〕, 叶片相对肉质的果香兰、斑舌兰、台兰、多花兰、纹瓣
兰、硬叶兰用低盐 CTAB沉淀法〔5〕。除美花兰用干叶之外 , 其它材料均为新鲜叶片。20μL PCR反应
体系包括 10 mmol·L - 1 Tris2HCl (pH 910) , 50 mmol·L - 1 KCl; 200μmol·L - 1的各种 dNTPs; 013
μmol·L - 1的 p rimer; 20 ng的模板 DNA; 1 units的 Taq聚合酶 ; 210 mmol·L - 1的 Mg2 + 25μL的矿物
油。用于扩增的随机引物见表 2。 PCR反应在 PTC2100TM 上进行。反应程序 : 94℃ 4 m in ; 36℃ 1
m in; 72℃ 2 m in, 1个循环。94℃ 1 m in; 36℃ 1 m in; 72℃ 2 m in, 28个循环。94℃ 1 m in; 36℃ 1
m in ; 72℃ 10 m in, 1个循环。扩增产物用 115% Agarose检测 , 电泳结果用无镀膜黑白速照胶片照
相记录。
以 100 bp Marker作为分子量标记 , 确定胶上
各 RAPD带的位置和分子量大小。在同一位置上
的带属同一位点 ( locus) , 在某一个位点上 , 有
带的样品记为 “1”, 无带记为 “0”。所得的位点
按分子量从大到小排列。所获数据用 NTSYS2pc
V1180软件处理 , 计算 Jaccard系数 , 用 UPGMA
进行聚类分析 , 得出树状图。
表 2　用于 RAPD的引物序列
Table 2　Sequence of the random nucleotide pr im ers
引物
Primer
序列
Sequence
引物
Primer
序列
Sequence
S106 ACGCATCGCA S167 CAGCGACAAG
S121 ACGGATCCTG S174 TGACGGCGGT
S133 GGCTGCAGAA S178 TGCCCAGCCT
S140 GGTCTAGAGG S180 AAAGTGCGGG
S142 GGTGCGGGAA S198 CTGGCGAACT
S143 CCAGATGCAC S199 GAGTCAGCAG
2　结果与讨论
211　RAPD扩增结果
从 100个购自上海 SanGon的引物中初选出 20个 , 对 50个材料进行 RAPD扩增 , 从中选出 12个
带多且亮 , 重复性好的引物的扩增产物作为最后结果 , 共获得 250条可明显区分的 DNA扩增片段 ,
2211
　6期 孙彩云等 : 中国兰属植物种间及品种间亲缘关系的 RAPD分析 　
除 S143 - 850 bp 1条带为全部材料共有外 , 其余带均为多态性位点。这些带最大的为 2 100 bp, 最小
的为 200 bp, 以集中在 1 031 bp～300 bp之间的带居多 (图 1)。
图 1　引物 S143的 RAPD扩增结果
1～50为不同材料的编号 , 详见表 1。
F ig. 1　The RAPD am plif ied prof ile using the pr im er S143
1 - 50 are material codes, see table 1.
　　兰属 50个材料的聚类树状图的 Jaccard相似
性系数主要集中在 01100～01250之间 , 其中建兰
的两个品种 : 韶关建兰和大青之间的相似系数最
大 , 为 01644。白花春剑和碧玉兰、白墨 ×象牙
白和冬凤兰、西藏虎头兰 ×象牙白和蕙兰、大花
蕙兰和冬凤兰之间的相似系数最小的为 01050。
212　亚属的划分
RAPD的 UPGMA聚类树状图 (图 2) 所呈现
出亚属间的亲缘关系大体与 ITS〔3〕系统发育一致。
建兰亚属可能为一自然类群 (虽然其成员之一广
东朵香与建兰亚属的主体和大花亚属的主体构成
三歧分支 )。大花亚属并非自然类群 , 其成员之
一文山红柱兰偏离出去与兰亚属聚在一起。兰亚
属则为一高度异质性的类群 , 图 2中兰亚属分散
成互不关联的 3支。本文的结果和 ITS系统发育
分析表明 , 有必要对经典分类〔6〕兰属属下分类 ,
特别兰亚属进行修订。
213　组的划分和组间及种间亲缘关系
RAPD的研究结果支持传统分类对兰亚属组
的划分 , 但文山红柱兰在硬叶组 , 长叶兰在带叶
组。
图 2　兰属种间、品种间 RAPD的 UPGM A聚类树状图
F ig. 2　UPGM A dendrogram of 50 Cym bidium spec ies,
cultivars in Ch ina ba sed on Jaccard coeff ic ien t obta ined
from 12 RAPD pr im ers
　　大花亚属中 , 大花组和腋花组亲缘关系最近 , 莎草组和斑舌兰组亲缘关系最近。在腋花组中 , 独
占春与大雪兰最先聚合 , 然后是马关兰 , 最后是象牙白 , 这一结果不支持传统分类认为马关兰是大雪
兰的变种 , 象牙白是独占春变种的观点。
《中国植物志 》第十八卷〔7〕把建兰亚属分为 3个组 , 其中把春兰组合到建兰组。而有文献把春兰
组和建兰组分开〔6〕。从树状图看 , 建兰亚属的 3个组中 , 建兰组和春兰先聚合成 1个大分支 , 兔耳兰
3211
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
组与落叶兰和一些野生花组成另一分支。所以 , 建兰组和春兰组无论分开或合并都可以。本研究与
Puy等〔6〕、梁红健等〔2〕对寒兰的分类的看法不同 , 而支持陈心启〔8〕的观点 , 把寒兰与莎叶兰、春兰、
蕙兰、莲瓣兰放在一起构成春兰组。建兰组中 , 传统分类把落叶兰归在建兰组中 , 本研究却显示它与
兔耳兰亲缘关系较近。建兰和墨兰的各个品种都先聚合 , 然后再构成建兰组 , 说明两者亲缘关系很
近。
214　种间多样性
RAPD结果显示种内不同品种间的多样性不同 , 仅春兰各品种间的变异较高 , 这造成品种间形成
了两个分枝 , 而纹瓣兰、大雪兰、墨兰、韶关建兰、寒兰、台兰等种内各品种都聚在一起形成 1个单
独的分枝 , 这些种内不同品种间的遗传多样性不高。
参考文献 :
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L iang H J, L iu M, Zhong Z Y, W u Y X, L iW B. Identificaiton and classification Cym bid ium of Chinese Cym bid ium with RAPD. Acta Hor2
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Fu R Z, Sun Y R, J ia S R. Manual of genetic transformation in p lant. Beijing: Science and Technic. Press of China, 1994. 131～137 ( in
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Chen S C. Fl. Reipubl. Popularis Sin. (Vol. 18) . Beijing: Science Press, 1999. 18, 197～227 ( in Chinese)
8　陈心启 , 吉占和. 中国兰花全书. 北京 : 中国林业出版社 , 1998. 70～102
Chen S C, J i Z H. The orchids of China. Beijing: China Forestry Publishing House, 1998. 70～102 ( in Chinese)
中国园艺学会第七届青年学术讨论会
中国园艺学会第九届第 8次常务理事扩大会决定 , “中国园艺学会第七届青年学术讨论会 ”由山东农业大学园艺
科学与工程学院和山东省园艺学会承办 , 将于 2006年 7月或 8月在山东泰安举行。
会议交流主题 : (1) 园艺作物种质资源、遗传育种与生物技术 ; (2) 园艺作物有机、无公害及标准化安全生产 ;
(3) 园艺作物栽培及生理、生态 ; (4) 园艺作物采后处理、贮藏与加工技术 ; (5) 园艺作物病虫害综合治理 ; (6)
园艺环境与工程 ; (7) 设施园艺 ; (8) 园艺作物种业 ; (9) 园艺教育 ; (10) 园艺产品的国内与国际贸易 ; (11) 其
他。会议征文需提交未公开发表过的论文。其撰写格式请参照 《园艺学报 》论文的格式要求 , 字数 (含图表 ) 勿超
过 5 000字。论文可通过电子邮件 ( xkzhao@ sdau1edu1cn; yykx2238@1631com ) 提交 , 也可邮寄拷贝有该论文的 315
寸软盘 (M icrosoftWord格式 )。经专家评审被接受的论文将在会议召开之前编辑成论文集 , 正式出版发行。征文截止
日期 : 2005年 12月 31日。
联系人 : 赵祥奎、王秀峰 ; 联系地址 : (271018) 山东泰安岱宗大街 61号 , 山东农业大学园艺科学与工程学院
“学术会议秘书组 ”; 电话 : 0538 - 8242654, 8242456; 传真 : 0538 - 8242654, 8242456; 电子信箱同上。
山东农业大学
园艺科学与工程学院
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