全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (5) : 905～907
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 01 - 03; 修回日期 : 2005 - 08 - 13
基金项目 : 国家科技攻关项目 (2001BA511B208212) ; 农业部农业结构调整项目 (04206202B)3 通讯作者 Author for correspondence
四川‘竹根姜 ’胚性细胞悬浮系的建立与植株再生
郭英华　关秋竹　张振贤 3
(中国农业大学农学与生物技术学院蔬菜系 , 北京 100094)
摘 　要 : 选用四川省地方品种 ‘竹根姜 ’的茎尖组织建立了体细胞胚性细胞悬浮系 , 并通过悬浮培养
获得了姜再生植株。结果表明悬浮细胞干质量受 pH影响。接种量和 AgNO3 对悬浮细胞的生长都有影响 :
最佳接种量为 110% , 最适 AgNO3浓度为 610 mg·L - 1。胚性细胞悬浮系增殖后 , 接种到前期筛选的成熟分
化培养基上获得了再生植株。
关键词 : 姜 ; 悬浮系 ; 体细胞胚 ; 植株再生
中图分类号 : S 63215　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0520905203
Establishm en t and Plan t Regenera tion of Soma tic Em bryogen ic Cell Suspen2
sion Cultures in G inger ( Zingiber off ic ina le Rosc. )
Guo Yinghua, Guan Q iuzhu, and Zhang Zhenxian3
(A gronom y and B iotechnology College, Ch ina A gricu ltura l U niversity, B eijing 100094, Ch ina)
Abstract: Somatic embryogenic suspension cultures of‘Zhugenjiang’ginger cultivars of Sichuan p rov2
ince were established. From which, regenerated p lantlets were obtained. The relationship between the dry
mass of suspension cultures and pH changes in medium was also discussed. The effects of inoculation and
AgNO3 on the growth of embryogenic suspensions were also discussed. The op timum concentrations of inocula2
tion and AgNO3 were 110% and 610 mg·L - 1 , respectively.
Key words: Ginger; Suspension culture; Somatic embryogenesis; Plant regeneration
1　目的、材料与方法
姜 ( Z ing iber off icina le Rosc. ) 由于开花和结籽障碍 , 无法采用有性杂交手段进行种质创新和品种
改良 , 且长期无性繁殖 , 极易造成种性退化。迄今已在姜的组培脱毒快繁〔1〕、花器官培养、体细胞
胚胎发生〔2〕、器官发生〔3〕、原生质体培养和种质保存等方面取得一定进展。但有关姜胚性细胞悬浮
系的建立和植株再生方面的工作尚未见报道。作者选择我国特产之一四川省地方品种 ‘竹根姜 ’, 利
用其茎尖组织建立了胚性细胞悬浮系并获得了再生植株。
选取色泽好、无病菌的种姜 , 洗净后 (28 ±2) ℃催芽。约 30 d后出芽。取长 115～210 cm初生
芽 , 无菌处理后剥取 110 mm大小生长点接种于胚性愈伤组织诱导培养基 MSN (硝酸铵含量减半的
MS培养基 ) + 2042D 110 mg·L - 1 + KT 012 mg·L - 1 +蔗糖 3% +琼脂 017% , (26 ±1) ℃下暗培养。
形成的胚性愈伤组织每 4周继代 1次。继代时挑选外观疏松、色泽鲜黄、细胞结构致密的愈伤组织。
以继代培养后的胚性愈伤组织作为悬浮培养的起始材料 , 置于 100 mL三角瓶内 , 加入 40 mL液
体培养基 (MSN + 2042D 110 mg·L - 1 + KT 012 mg·L - 1 +蔗糖 3% )。三角瓶置于恒温旋转摇床上
〔100～120 r·m in - 1 , (26 ±015) ℃〕黑暗条件下振荡培养。每 2周继代 1次 , 隔代用孔径为 015 mm
的尼龙网过筛处理 , 使其大小均一。定期在倒置显微镜下观察悬浮细胞生长发育情况。
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
悬浮细胞系的干质量及 pH测定 : 每隔 2 d取其充分摇匀的悬浮培养物 10 mL, 离心 ( 100 ×g,
10 m in) , 沉淀烘干 (60℃, 24 h) 后称其质量 , 同时测其上清液 pH值。液体培养基中 , 加入不同浓
度的 AgNO3 (0, 2, 4, 6, 8和 10 mg·L - 1 ) , 培养 20 d后测定悬浮细胞的鲜质量增加值。
将直径约 1～2 mm的胚性细胞团转移到前期筛选得到的固体胚性愈伤组织诱导增殖培养基上
(MSN + 2042D 110 mg·L - 1 + KT 012 mg·L - 1 +蔗糖 3% +琼脂 017% )。待愈伤组织长到直径 015 cm
左右时接种到成熟分化培养基上 (MS + 2042D 012 mg·L - 1 + BA 510 mg·L - 1 +蔗糖 3% +琼脂
017% )。第 1片真叶展开后转到再生培养基上 (MS +BA 310 mg·L - 1 +NAA 011 mg·L - 1 +蔗糖 3%
+琼脂 017% ) 获得再生植株。
2　结果与讨论
211　胚性细胞悬浮系的建立及生长特性
‘竹根姜 ’外植体接种到胚性愈伤组织诱导培养基上 1周后 , 基部开始膨大 , 形成花环状结构
(图版 , 1)。约 30 d左右开始出现细小颗粒状、结构松脆的淡黄色胚性愈伤组织 (图版 , 2)。选择
此类愈伤组织进行液体振荡培养 , 建立了胚性细胞悬浮系 (图版 , 3)。悬浮系中大多数细胞呈圆球
形 , 细胞质浓厚 , 细胞核明显 , 细胞分裂旺盛 , 多为均等的有丝分裂 , 细胞分散度良好 , 主要由单细
胞和小型细胞团组成 (图版 , 4)。
　　胚性悬浮细胞系的干质量增加值变化呈 “S”
形曲线 , pH的变化近似 “V”形曲线 , 在接种后
1～9 d的范围内 pH不断下降 , 从 518下降到最
低点 4105, 此阶段干质量增长缓慢 ; 9～13 d pH
迅速回升 , 从 4105增加到 5119, 此阶段干质量
增长迅速 , 悬浮细胞处于对数生长期 ; 13～17 d,
pH缓慢回升 , 干质量缓慢增加 ; 第 17天以后 pH
和干质量的增加都几乎停滞 (图 1) , 如不及时添
加新鲜培养基 , 悬浮细胞将老化死亡。pH与干质
量之间的这种关系 , 可能是外源生长素 2042D引
起 pH下降 , 促进内源生长素在细胞内的不断积
累 , 诱导与细胞生长有关基因的表达 , 从而促进
细胞生长。
212　接种量和 AgNO3 对悬浮细胞生长的影响
21211　接种量对悬浮细胞生长的影响 　接种量的
大小影响悬浮细胞的生活力 , 接种量小于 015% ,
悬浮细胞增殖缓慢 , 容易衰老、逐渐失去分化能
力 , 最终死亡 , 10 d时干质量增加 61 mg; 接种
量大于 210% , 细胞繁殖迅速 , 分散度差 , 养料
及氧气供应不足 , 悬浮细胞团容易褐化 , 10 d时
干质量增加 86 mg; 最适宜的接种量为 110% , 10
d时干质量增加 154 mg (图 2)。
21212　AgNO3 对悬浮细胞生长的影响 　添加低浓
度 AgNO3 (210～610 mg·L - 1 ) , 悬浮细胞的鲜
质量增加值高于对照 , 褐化速度减慢 (表 1) , 可
见低浓度 AgNO3 对悬浮细胞的生长有一定促进作
图 1　四川 ‘竹根姜’胚性细胞悬浮系干质量和 pH关系
初始接种量为 015%。
F ig. 1　Var ia tion of dry ma ss and pH of em bryogen ic
suspen sion s of‘Zhugen jiang’g inger
Inoculum at 015%.
图 2　接种量对四川 ‘竹根姜’悬浮系干质量增加值的影响
F ig. 2　Effect of inoculum s on the dry ma ss increa se of
‘Zhugen jiang’g inger suspen sion cultures
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　5期 郭英华等 : 四川 ‘竹根姜 ’胚性细胞悬浮系的建立与植株再生 　
用。而附加高浓度的 AgNO3 ( > 810 mg·L - 1 ) ,
鲜质量增加值与对照差别不明显 , 但是有加速褐
化的现象 (表 1) , 可见高浓度 AgNO3 对悬浮细
胞生长有毒害作用。可能低浓度的 AgNO3 抑制了
乙烯的合成 , 从而抑制乙烯对细胞的毒害作用 ,
促进了细胞增殖 , 减缓了细胞的老化 ; 另一方面
高浓度的 Ag+对细胞造成毒害作用 , 因此导致细
胞过早老化死亡。
表 1　AgNO 3 对四川 ‘竹根姜’胚性悬浮细胞生长的影响
Table 1　The effect of AgNO 3 on the growth of em bryogen ic
suspen sion s of‘Zhugen jiang’g inger
AgNO3
(mg·L - 1 )
鲜质量增加值
Increase of fresh mass( g)
褐化时间
Time of brownness ( d)
0 116 ±0104 10 ±0
210 119 ±0105 12 ±016
410 213 ±0104 14 ±016
610 214 ±0104 15 ±110
810 116 ±0110 8 ±0
1010 115 ±0103 7 ±0
213　胚性细胞悬浮系的分化及植株再生
悬浮细胞团接种到固体培养基后 , 其直径扩增到 015 cm需要 20 d左右。胚性愈伤培养在扩增培
养基上将一直保持其体细胞胚胎发生能力 , 很难再分化 , 只有接种到附加低浓度 2042D的分化培养基
(MS + 2042D 012 mg·L - 1 +BA 510 mg·L - 1 +蔗糖 3% +琼脂 017% ) 上后 , 才开始器官分化 (图
版 , 5)。小苗第 1片真叶展开后 , 转到不含 2042D的培养基上 (MS +BA 310 mg·L - 1 +NAA 011 mg
·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 +琼脂 017% ) 更利于茎叶的伸展和根的生长 , 附加低浓度 NAA (011 mg·
L - 1 ) 有利于茎的伸长 , 叶片的伸展和根的生长 , 一个月左右形成根、茎、叶具全约 2 cm高的小苗 ,
获得了完整的再生植株 (图版 , 6)。
参考文献 :
1　Sharma T R, Singh B M. H igh2frequency in vitro multip lication of disease2free Z ingiber of icina le Roscae. Plant Cell Reports, 1997, 17: 68～
72
2　Babu K N, Sam sudeen K, RatnambalM J. Embryogenesis and p lant regeneration from ovary derived callus cultures of ginger ( Z ingiber offici2
nale Rosc. ) . Journal of Sp ices and A romatic Crop s, 1996, 5 (2) : 134～138
3　Babu K N, Sam sudeen K, Ravindran P N. D irect regeneration of p lantlets from immature inflorescence of ginger ( Z ingiber off icina le Rosc. )
by tissue culture. Journal of Sp ices and A romatic Crop s, 1992, 1 (1) : 43～48
图版说明 : 1. 花环状结构 ; 2. 胚性愈伤组织 ; 3. 胚性细胞悬浮系 ; 4. 胚性悬浮细胞团 ; 5. 分化芽和根 ; 6. 再生植株。
Explana tion of pla tes: 1. Flower like callus; 2. Embryogenic callus; 3. Embryogenic suspension cultures; 4. Embryogenic cell cluster; 5
Redifferented shoots and roots; 6. Regenerated p lantlets.
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