全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2002 , 29 (2) : 153～157
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 05 - 17 ; 修回日期 : 2001 - 11 - 26
基金项目 : 广东省自然科学基金资助项目 (001425)
豇豆种子萌发过程中多胺氧化酶活性的变化及其影
响因素
何生根1 　黄学林2 　傅家瑞2
(1 仲恺农业技术学院 , 广州 510225 ;　2 中山大学生命科学学院 , 广州 510275)
摘 　要 : 吸胀而未萌发的豇豆 ( Vigna unguiculata L. ) 种子检测不到多胺氧化酶 (PAO) 活性 , 直至萌
发开始 (吸胀后 36 h) 才在胚芽、子叶和胚轴测到 PAO 活性 , 此后各部分的 PAO 活性以不同速度增加 , 而
胚根一直没能检测到 PAO 活性。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺 (CHM) 吸胀处理可显著抑制萌发种子胚芽
和子叶的 PAO 活性 , 同时强烈抑制种子的萌发 ; 核酸合成抑制剂放线菌素 D 处理对豇豆胚芽和子叶的 PAO
活性以及种子萌发的影响则远不及 CHM 处理。豇豆种子在黑暗条件下萌发 , 胚芽和子叶的 PAO 活性都明
显高于光下。适宜浓度的腐胺和 CuCl2 吸胀处理也可提高胚芽和子叶的 PAO 活性。
关键词 : 豇豆 ; 多胺 ; 多胺氧化酶 ; 种子萌发 ; Cu2 +
中图分类号 : S 643. 4 ; Q 945 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2002) 0220153205
种子萌发过程中多胺 (polyamines , PAs) 的水平及其合成酶的变化受到不少研究者的重视〔1〕。近
十年来 , 人们十分重视种子萌发阶段催化 PAs 降解的关键酶 ———多胺氧化酶 (polyamine oxidase , PAO)
的研究〔2～5〕。已有的研究结果表明 , PAO 在豌豆、扁豆和菜豆等豆类蔬菜的种子萌发阶段异常活跃。
一些研究者根据 PAO 活性主要集中在豌豆和扁豆等幼苗木质化程度最高的下胚轴基部的分布特点 ,
认为 PAO 可能参与种子萌发阶段的细胞壁木质化〔2 ,3 ,6〕而涉及幼苗出土成苗过程。但 Scoccianti 等〔7〕研
究表明 , PAO 活性在菜豆幼苗中的分布与上述植物完全不同 , 其 PAO 活性绝大部分集中在幼苗的初
生叶和子叶 , 而下胚轴反而检测不到 PAO 活性。笔者最近的研究结果也表明 PAO 活性在豇豆初生幼
苗中的分布特点与菜豆类似〔8〕。本文拟进一步分析豇豆种子萌发过程中 PAO 活性的变化特点及影响
因素 , 籍此探索该酶与种子萌发之间的关系 , 并为生产上提高豇豆以及其它种子萌发质量提供依据。
1 　材料与方法
1. 1 　材料与处理
豇豆 ( Vigna unguiculata L. ) 品种为‘金丰 1 号’, 购于广东省种子公司。
1. 1. 1 　种子萌发处理 　取饱满健康、大小一致的种子用 1 %次氯酸钠溶液表面消毒 , 用无菌水冲洗 3
次 , 室温下吸胀 6 h 后播种在铺有滤纸的培养皿 ( ª 30 cm) 中 , 置于 (28 ±1) ℃, 光 16 h/ 暗 8 h ,
光强 90μmol·cm - 2·min - 1的培养箱萌发。萌发期间添加适量蒸馏水以保持滤纸湿润。
1. 1. 2 　光照和黑暗处理 　将消毒后种子播于铺有滤纸的培养皿内 , 加无菌水至浸没种子 , 然后放入
28 ℃培养箱吸胀 6 h 后倾去多余水分 , 分别在连续黑暗 (简称为黑暗处理) 和 16 h 照光 (90μmol·
cm
- 2·min - 1) / 8 h 黑暗 (简称为光照处理) 两种条件下萌发。每处理设 3 皿 , 每皿播豇豆种子 50 粒。
在种子吸胀后 144 h 剥取胚芽和子叶备用。
1. 1. 3 　药剂吸胀处理 　处理方法基本同上 , 仅在种子吸胀阶段进行如下处理 : (1) 分别在 50 mg/ L
Act2D (核酸合成抑制剂放线菌素) 和 20 mg/ L CHM (蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺) 溶液中吸胀
(以蒸馏水作为对照) ; (2) 将种子分别在不同浓度的 Put (腐胺) 溶液中吸胀 ; (3) 将种子在不同浓
度 CuCl2 溶液中吸胀。吸胀处理 6 h 后 , 倾去多余溶液继续在暗中萌发。在种子吸胀后 144 h 统计处
理 (1) 的发芽率 , 同时取 (1) ～ (3) 处理的萌发种子剥取胚芽和子叶备用。
1. 2 　测定方法
豇豆种子萌发阶段各部分 PAO 的提取和活性测定参照文献 〔8〕的方法。在豇豆种子吸胀后取种
子按胚芽、胚轴、子叶和胚根分成 4 个部分 , 各称取 0. 5 g 分别加入 10 mL 磷酸缓冲液 (0. 1 mol/ L ,
pH 7. 0) 研磨成匀浆 , 4 层脱脂纱布过滤 , 取滤液于 10 000 ×g 离心 20 min (4 ℃) , 上清液即为 PAO
提取液 , 置于冰浴中保存备用。PAO 活性测定的反应混合液含 2 mL PBS (0. 1 mol/ L , pH 7. 0) 、
0. 2 mL愈创木酚 (25 mmol/ L) 、0. 1 mL 过氧化物酶溶液 (1 mg/ mL) 及 0. 2 mL PAO 提取液。混合液
于 30 ℃水浴预保温 2 min 后分别加入 0. 1 mL Put (20 mmol/ L) 起动反应 , 并用 Beckman DU640 UV 分
光光度计连续测定波长 470 nm 处光密度值的变化。以 0. 01ΔOD470/ min 为 1 个酶活力单位 (U) 。蛋白
质含量测定按文献 〔9〕的方法 , BSA 为标准蛋白质。
2 　结果与分析
2. 1 　豇豆种子萌发过程中 PAO 活性的变化
如图 1 所示 , 吸胀而未萌发的豇豆种子 (吸胀后 0～24 h) 测不到 PAO 活性 , 直至吸胀后 36 h 才
在胚芽、子叶和胚轴测到较低的 PAO 活性 , 此后胚芽和子叶两部分的 PAO 活性迅速增加 , 而胚轴的
PAO 活性增加却很缓慢 , 至吸胀后 96 h , 胚芽 PAO 活性的增幅开始趋缓 , 并于吸胀后 144 h 达到高
峰。胚轴和子叶的 PAO 活性分别在吸胀后 96 h 和 120 h 即开始下降 , 而胚根中则一直未能测到 PAO
活性。
图 1 　豇豆种子萌发过程中 PAO 活性的变化
Fig. 1 　Change of the PAO activity during
the cowpea seed germination
图 2 　光照和黑暗处理对豇豆萌发种子胚芽
和子叶 PAO 活性的影响
Fig. 2 　Effects of light and dark treatment on the PAO activity
in plumule and cotyledons of the cowpea germinating seeds
2. 2 　光照和黑暗处理对豇豆萌发种子 PAO 活性的影响
黑暗与光照两种萌发条件下 , 豇豆萌发种子的胚芽和子叶中均以暗萌发条件下的 PAO 活性高
(图 2) 。
2. 3 　Act2D 和 CHM 处理对豇豆种子 PAO 活性和发芽率的影响
Act2D 和 CHM 处理对豇豆种子发芽率和萌发种子 PAO 活性的抑制程度不同 (表 1) 。Act2D 处理对
种子萌发的影响较小 (抑制率为 27. 6 %) , 而 CHM 则强烈抑制萌发 (抑制率为 90. 6 %) , 并且 Act2D
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处理萌发种子胚芽和子叶的 PAO 活性高于 CHM 处理。
表 1 　Act2D 和 CHM 吸胀处理对豇豆种子发芽率及其胚芽和子叶 PAO 活性的影响
Table 1 　Effects of Act2D and CHM treatment on the germination percentage
and the PAO activity in the plumule and cotyledons of cowpea seeds
处　理
Treatment
种子发芽率
Seed germination ( %)
PAO 活性 PAO activity (U·mg - 1 protein)
胚 芽 Plumule 子 叶 Cotyledons
对 照 Control 100 14. 8 ±0. 5 (100 %) 4. 8 ±0. 2 (100 %)
Act2D (50 mg/ L) 72. 4 ±2. 2 10. 5 ±0. 4 (70. 9 %) 3. 2 ±0. 3 (66. 7 %)
CHM (20 mg/ L) 9. 4 ±0. 6 1. 9 ±0. 2 (12. 8 %) 0. 7 ±0. 1 (14. 6 %)
2. 4 　Put 处理对豇豆萌发种子 PAO 活性的影响
经不同浓度 Put 吸胀处理后豇豆萌发种子胚芽和子叶的 PAO 活性变化见图 3 , 较低浓度的 Put
(0. 1和 0. 5 mmol/ L) 处理胚芽和子叶的 PAO 活性高于较高浓度的 Put (1. 0 和 2. 0 mmol/ L) 处理。
2. 5 　CuCl2 处理对豇豆萌发种子 PAO 活性的影响
CuCl2 吸胀处理对豇豆萌发种子 PAO 活性的效应与其浓度有关 (图 4) , 10μmol/ L 的 CuCl2 对胚芽
和子叶的 PAO 活性都有一定的促进作用 , 而 100μmol/ L 的 CuCl2 则对二者的 PAO 活性表现出抑制效
应 , 其他浓度对该酶活性影响不明显。
图 3 　Put 处理对豇豆萌发种子胚芽和子叶 PAO 活性的影响
Fig. 3 　Effects of Put treatment on the PAO activity in plumule
and cotyledons of the cowpea germinating seeds
图 4 　CuCl2 处理对豇豆萌发种子胚芽和子叶 PAO 活性的影响
Fig. 4 　Effects of CuCl2 treatment on the PAO activity in
plumule and cotyledons of the cowpea germinating seeds
3 　讨论
3. 1 　豇豆种子萌发过程中 PAO 活性的变化特点
已有的研究结果表明 , PAO 活性在一些豆科植物的种子萌发阶段会发生显著的变化 , 吸胀而未萌
发的豌豆、扁豆、绿豆和花生种子无 PAO 活性 , PAO 活性仅在萌发开始后才出现并随着萌发进程逐
渐增加〔2 ,3 ,10〕。本试验以豇豆为材料所得的结果与此相似 , 表明豇豆种胚的 PAO 活性是在种子萌发过
程中逐渐形成的。另外 , 豇豆萌发种子的 PAO 活性一直都是胚芽高于子叶 , 这与已报道的豌豆、扁
豆、花生等植物 PAO 活性主要集中在萌发种子的胚轴或幼苗的木质化程度较高的下胚轴不同。一些
研究者曾基于上述植物的 PAO 分布特点提出 , 该酶催化 PAs 氧化的产物 H2O2 , 可能参与种子萌发过
程的木质化和细胞壁硬化〔2 ,6 ,10〕。但我们根据豇豆种胚中 PAO 分布与变化特点认为 , 豇豆 PAO 的生理
功能可能主要不在于此 , 从子叶中具有不低的 PAO 活性这一现象来看 , 动用种子中贮备的 PAs 作为
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种子萌发和幼苗生长初期的氮源很可能是此酶的重要功能之一〔1〕。
本研究显示 CHM 处理对豇豆种子萌发的抑制效应和对胚芽、子叶 PAO 活性的抑制作用均比 Act2
D 强得多 (表 1) 。这一方面说明豇豆种胚中 PAO 的 mRNA 很可能在种子发育过程中已合成并贮于成
熟种子中 , 萌发时 PAO 活性的出现主要是由于这些 mRNA 转译合成了 PAO 的结果 ; 另一方面还表明
豇豆种胚中的 PAO 活性与种子萌发之间有着密切的关系 , 我们已证实花生胚轴中的多胺氧化酶是花
生种子萌发的相关蛋白之一〔10〕。
3. 2 　豇豆种子萌发过程中 PAO 活性变化的影响因素
本研究表明黑暗条件下豇豆种子胚芽和子叶中的 PAO 活性均高 , 说明黑暗更有利于该酶活性的
表达。这与豌豆〔2〕、扁豆〔11〕和花生〔10〕等材料所得研究结果一致。已有研究表明 , 小麦和扁豆幼苗的
PAO 活性形成与功能可能涉及到光敏素的介导〔5 ,11〕。
Angelini 等〔11〕研究表明扁豆幼苗中的 PAO 活性受其底物 Put 诱导 , 本研究表明 , 0. 1 和 0. 5 mmol/
L 的 Put 处理可促进胚芽和子叶 PAO 活性的提高。但高浓度的 Put (1. 0 和 2. 0 mmol/ L) 处理反而会抑
制胚芽和子叶的 PAO 活性 , 这是否与高浓度 Put 的直接毒害作用或者是过多 Put 氧化而产生并累积大
量的氨基醛、H2O2 及某些自由基导致细胞损伤有关〔12〕, 尚需进一步证实。
Rossi 等〔13〕曾报告 CuSO4 吸胀处理扁豆种子可提高萌发阶段 PAO 活性 , 但不影响萌发种子 PAO 酶
蛋白的合成。我们前期的工作证实豇豆 PAO 是一种含 Cu2 +的 PAO , 且 Cu2 + 为该酶活性所必需〔14〕。本
试验用 CuCl2 吸胀处理豇豆种子的结果表明 , 10μmol/ L 的 CuCl2 对萌发种子胚芽和子叶的 PAO 活性表
达有一定的促进作用 , 对于 100μmol/ L 的 CuCl2 对种胚 PAO 活性所表现出的抑制效应 , 很可能与
Cu2 +的直接毒害作用有关。
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651 　　　　　　　　　　　　　　　　　园 　　艺 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　29 卷
Change of Polyamine Oxidase Activity during Cowpea Seed Germination and Its
Influencing Factors
He Shenggen1 , Huang Xuelin2 , and Fu Jiarui2
(1 Zhongkai Agrotechnical College , Guangzhou 510225 , China ;　2 The School of Life Sciences , Zhongshan University , Guangzhou
510275 , China)
Abstract : No PAO activity was detected in ungerminated cowpea (Vigna unguiculata L. ) seeds (form 0 to
24 h after imbibition) , but it could be detected in the plumule , cotyledons and embryonic axis of the germinating
seeds whose radicles were just visible (36 h after imbibition) . The PAO activities in these three parts increased at
different rates during germination , while no PAO could be detected in radicle at all times. Soaking with Act2D only
inhibited the seed germination by 27. 6 % , but CHM could inhibit the germination by 90. 6 %. Moreover , the
inhibitions of the PAO activity in the plumule and cotyledons by Act2D were just 29. 1 % and 33. 3 % , and those by
CHM were up to 87. 2 % and 85. 4 % respectively. Light had a remarkable inhibitory effect on the PAO activity in
plumule and cotyledons. Soaking with putrecine (0. 1 and 0. 5 mmol/ L) or CuCl2 (10μmol/ L) for 6 h could
enhance the activity of PAO.
Key words : Cowpea ( Vigna unguiculata L. ) ; Polyamine ; Polyamine oxidase ; Seed germination ; Cu2 +
7512 期 　　　　　　　　何生根等 : 豇豆种子萌发过程中多胺氧化酶活性的变化及其影响因素