全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (1) : 29～33
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2003 - 04 - 17 ; 修回日期 : 2003 - 06 - 053 通讯作者 , E2mail : yiganjun @vip11631com
番木瓜茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生
曾继吾1 ,2 　易干军1 3 　张秋明2
(1 广东省农业科学院果树研究所 , 广州 510640 ;　2 湖南农业大学园艺园林学院 , 长沙 410128)
摘 　要 : 研究了番木瓜 ( Carica papaya L. ) 茎尖玻璃化法超低温保存的一些影响因素。结果表明 : 无
菌试管苗在 MS + BA 015 mg/ L + NAA 011 mg/ L + GA3 110 mg/ L 的培养基上生长较好。番木瓜茎尖超低温保存
较佳体系是 : 3～5 cm的茎尖在含有 5 %二甲基亚砜 (DMSO) 培养基上预培养 3 d , 解剖镜下剥取含 1～2 个
叶原基的茎尖 (115～215 mm长) , 先在室温下于 60 %的玻璃化溶液 (PVS2) 中装载 40～50 min , 再用 PVS2
于 0 ℃下处理 30 min , 换 1 次 PVS2 溶液后迅速投入液氮。保存 24 h 后 , 在 40 ℃水浴中化冻 , 用 112 mol/ L 的
蔗糖培养液洗涤两次 , 转入继代培养基上再培养 , 成活率和再生率分别达 5317 %和 5216 %。再生植株生根
后可移栽成活。
关键词 : 番木瓜 ; 茎尖 ; 超低温保存 ; 玻璃化法
中图分类号 : S 667 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0120029205
Cryopreservation of in Vitro Papaya Shoot2tips by Vitrif ication Technique and
Its Regeneration
Zeng Jiwu1 ,2 , Yi Ganjun1 , and Zhang Qiuming2
(1 Fruit Research Institute , Guangdong Academy of Agricultural Sciences , Guangdong 510640 , China ;　2 College of Horticulture , Hu2
nan Agricultural University , Changsha 410128 , China)
Abstract : Experiments were conducted about tissue culture systems and cryopreservation on papaya ( Carica
papaya L. ) . The cluster buds were subcultured on the proliferation medium containing 015 mg/ L BA , 011 mg/ L
NAA and 110 mg/ L GA3 . The procedure of cryopreservation was studied using the shoot tips as materials. In vitro ,
the shoot tips of papaya about 3 - 5 cm in length were precultured for 3 days at 25 ℃on MS medium supplemented
with 5 % DMSO. Shoot tips about 115 - 215 mm in length with one or two leaf primordium were loaded in a solution
containing 60 % PVS2 for 40 - 50 min at room temperature. The shoot2tips were sufficiently dehydrated with a high2
ly concentrated vitrification solution (PVS2) for 40 min at 0 ℃. After changing the solution with fresh PVS2 , the
shoots were immersed into liquid nitrogen directly and conservated for 24 hour. After rapidly thawing in a water
bath at 40 ℃, the shoot tips were washed twice with 112 mol/ L sucrose solution and transferred on the same MS
medium as the previous one. Survival rates of shoot tips was 5317 % , and regrowth rate reached 5216 %. Almost
all the shoot tips formed roots on hormone2free solidified MS medium and were successfully transferred to soil in
pots. The plantlets could normally root and survive after transplantion.
Key words : Papaya ( Carica papaya L. ) ; Shoot2tips ; Cryopreservation ; Vitrification
番木瓜 ( Carica papaya L. ) 具有雌株、雄株和两性株 3 种株性 , 本身遗传性高度杂合 , 采用常规
的种子繁殖易混杂 , 很难保持母株的优良性状 , 且部分优良品种产生的种子少或不产生种子 , 因而以
种子繁殖有实际困难。同时 , 番木瓜对多种病毒病敏感 , 特别是 20 世纪 50 年代番木瓜环斑病毒
(PRSV) 曾几乎使我国的番木瓜绝收 , 生产上不得不将其由多年生改为 1 年生种植。番木瓜多以种子
保存 , 有效期大多在 1～2 年。番木瓜的组织培养已有一些报道〔1 ,2〕。常规的离体保存需要经常继代 ,
耗费大量人力、物力 , 而且易污染和变异。玻璃化法超低温保存是植物细胞和组织长期稳定保存的较
好方法 , 节省空间 , 避免继代、病虫害和气候因素等干扰而造成种质丢失 , 并且设备简单 , 操作简
便 , 已经成功应用于柑橘〔3 ,4〕、杏〔5〕、魔芋〔6〕、苹果和梨〔7〕、桑树〔8〕、樱桃〔9〕、甜菜〔10〕、云杉〔11〕、
芋〔12〕等组织和细胞保存。本研究以番木瓜茎尖为试材 , 研究影响番木瓜茎尖玻璃化法超低温保存的
一些因素 , 以期为番木瓜茎尖超低温保存提供理论和实践借鉴。
1 　材料与方法
111 　材料
供试番木瓜材料为广东省农业科学院果树研究所试验果园内栽培品种‘穗中红’和夏威夷番木瓜
‘Hawaii Solo Sunset’。选取健康、无病毒的母株上成熟果实 , 取其种子在自来水下洗净 , 除去外种皮
后放在湿润的河沙内 , 20 d 后种子萌发 , 待长至 10 cm 长时取其顶芽。除掉子叶 , 把顶芽放在自来水
内冲洗 30 min , 然后用 75 %的酒精浸泡 30 s , 用无菌水冲洗 2 次后加 011 %的升汞灭菌 10 min (每升
加入 2 滴吐温) , 再用无菌水冲洗 4～5 次 , 放在无菌纸上吸干多余水分后作为外植体。基本培养基为
MS , 加蔗糖 30 g/ L , 017 %的琼脂粉 , 用 1 mol/ L 的 HCl 或 1 mol/ L 的 NaOH 调节 pH 值到 518 , 经
121 ℃高压灭菌 15 min。培养温度为 (25 ±2) ℃, 每天 14 h 光照。附加不同浓度的 6 - 苄基腺嘌呤 (62
BA) 、萘乙酸 (NAA) 、赤霉素 ( GA3) 。
112 　玻璃化法保存
11211 　预培养 　选择继代 20 d 左右生长健壮的番木瓜茎尖 (长约 3～5 cm) , 于 MS + 5 %二甲基亚砜
(DMSO ) + 5 %蔗糖的培养基上预培养不同天数。
11212 　预处理 (装载) 　把经过预培养后的茎尖在解剖镜下剥取含有 1～2 个叶原基的茎尖 , 约为
115～215 mm 长 , 转移到 118 mL 的冷冻管中 , 每管 10 个茎尖 , 在室温下用 60 %的玻璃化溶液
(PVS2 , 0115 mol/ L 的蔗糖培养基溶液与 PVS2 按体积比 40∶60 配合)〔4〕进行不同时间处理。
11213 　玻璃化溶液处理 (脱水) 和冰冻处理 　经过以上处理后的茎尖 , 再用 PVS2 〔30 %甘油 ( Gly) ,
15 %乙二醇 ( EG) , 15 %二甲基亚砜 (DMSO) , 014 mol/ L 的蔗糖〕于 0 ℃下处理不同时间 , 移去原
液 , 换 1 次新鲜的 PVS2 溶液 , 然后将冷冻管装在金属套上 , 套上一根细线 , 每个金属套上套两个管 ,
然后将材料迅速投入到液氮中。
预培养、60 % PVS2 溶液预处理和 PVS2 溶液处理均进行单因子试验。每处理 20 个茎尖 , 3 次重复。
11214 　解冻处理和再培养 　保存 24 h 后 , 从液氮中取出冷冻管 , 在 40 ℃下迅速化冻 , 待冷冻管内冰
化尽以后 , 用 112 mol/ L 的蔗糖 + MS 基本培养基洗涤两次 , 每次 10 min。再转到继代培养基上 , 先进
行暗培养一周 , 然后转移到光下 , 以与对照相同的条件进行再培养。一周统计成活率 (茎尖颜色恢复
为绿色 , 有部分长芽或长愈伤组织的茎尖占全部试验茎尖数的百分率) , 转变为绿色的计为成活 , 否
则计为死亡 , 一个月统计植株的再生率 (直接再生成芽或生长成愈伤组织的茎尖占全部试验茎尖数的
百分率) 。最后将再生的植株转入到生根培养基上进行生根培养 , 生根后移入到温室内。
2 　结果与分析
211 　不同浓度的 BA和 NAA对番木瓜茎尖培养的影响
经过消毒的‘穗中红’的顶芽接种在 MS + BA 015 mg/ L + NAA 012 mg/ L 培养基上〔2〕, 4 周后 , 每
个茎尖获得 4～5 个小丛芽 , 以该茎尖为材料进行继代培养。
将番木瓜茎尖继代到附加不同浓度的 BA (0、012、015、110 mg/ L) 和 NAA (0、011、012、
014 mg/ L) 的培养基上 , 结果表明 , BA 对番木瓜茎尖生长有明显的促进作用 , 在低浓度下产生的小
苗叶片泛白 , 丛芽不多 , 基部有白色愈伤组织产生 ; 随着浓度升高 , 产生的丛芽增多。同时 , NAA 对其
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生长也有重要作用 , 当 NAA 的浓度很小或为 0 时 , 外植体愈伤化明显 , 增殖倍数不高 , 但 NAA 浓度过
高时 , 外植体生长慢 , 产生大量愈伤化根 , 叶片不舒展 , 小部分芽畸形生长 , 小苗木质化程度高而不适
宜于继代。而当加入 110 mg/ L GA3 后 , 芽数相对减少 , 丛芽伸长。综合茎尖生长情况 , 以 MS + BA
015 mg/ L + NAA 011 mg/ L + GA3 110 mg/ L 的组合较为适合番木瓜茎尖继代培养 (图版 , A) 。
212 　无菌苗的生根培养和植株移栽
选取生长较健壮的小苗 , 切取 115 cm 长 , 接种到MS + IBA 210 mg/ L + 活性碳 (AC) 012 %的生根
培养基上 , 接种两次共 16 瓶 , 一共 64 个芽 , 第 7 天有部分开始生根 , 4 周后统计 , 有 44 个小芽生
根 , 生根率为 6814 % (图版 , B) , 当根生长到 5～7 条时 , 在组培室内打开瓶盖 2～3 d , 转移到有机
质土壤∶河沙 = 1∶1 的基质中进行炼苗 , 薄膜封盖 , 保持土壤湿润 , 2 周后盆栽 , 成活 39 株 , 成活率
8816 % (图版 , C) 。
213 　预培养对超低温保存结果的影响
预培养对提高超低温保存后的成活率有很大影响〔13〕。在本试验中 , 用 MS 基本培养基附加 5 %的
二甲基亚砜 (DMSO) 进行预培养对保存效果有明显影响。预培养 3 d 后保存效果最好 , 成活率和再
生率分别达 5010 %和 4718 % (图 1) 。随着预培养时间延长 , 成活率迅速下降 , 因 DMSO 的毒害作用 ,
材料叶片变黄、脱落 , 7 d 后叶片全部变黄 , 此时剥下的茎尖再培养 , 不能再生。王子成等〔3〕在柑橘
茎尖超低温保存时 , 用 5 %的 DMSO 进行预培养 , 大大提高了成活率。Niino 等〔7 ,8〕在对苹果、梨和樱
桃进行超低温保存时 , 将材料放在低温下 (4 ℃) 保存一段时间 , 可以大大地提高成活率。但番木瓜
属于热带植物 , 对低温十分敏感 , 当温度连续几小时低于 12～14 ℃就会发生冷害〔14〕, 因而不可能采
用低温进行预培养。
214 　PVS2 预处理时间对超低温保存结果的影响
预处理 (Pretreatment) 即装载 (loading) 过程 , 在用 PVS2 进行快速脱水前 , 用较高浓度的溶液进
行处理 (60 %的 PVS2) , 以初步降低组织的含水量 , 从而可以避免由于渗透压变化太强而对材料造成
伤害。预培养 3 d 后的无菌小芽 , 剥取茎尖后放在 60 % PVS2 中 , 处理 20 min 时的成活率和再生率分
别为 3817 %和 2910 % , 处理 50 min 时 , 分别高达 5212 %和 5110 % , 而处理 70 min , 分别降为 2311 %
和 2110 % (图 2) 。因此 , 番木瓜茎尖以在 60 % PVS2 溶液中处理 40～50 min 效果比较好。
图 1 　预培养时间对成活率和再生率的影响
Fig. 1 　Effect of different time of preculture in 5 %DMSO
medium on the survival and regeneration rate
图 2 　60 % PVS2 预处理对成活率和再生率的影响
Fig. 2 　Effect of different time pretreatment with 60 % PVS2
on survival and regeneration rate
215 　PVS2 处理时间对超低温保存结果的影响
把预培养 3 d , 经 60 % PVS2 预处理 40 min 后的茎尖 , 再在 0 ℃下用 PVS2 处理 , 使组织进一步脱
水 , 这是超低温保存最关键的步骤之一。经过预培养和预处理后的茎尖 , 放在 PVS2 中处理 0～
60 min (图 3) , 结果表明 , 未经处理的 , 保存后茎尖全部死亡 ; 处理 30 min 的成活率和再生率达最
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高 , 分别为 5317 %和 5216 % ; 随着处理时间延
长 , 因为一部分冰冻保护剂渗透到材料内 , DM2
SO 等对材料造成伤害 , 成活率和再生率又迅速
下降 , 60 min 时分别为 3213 %和 2612 %。用 PVS2
处理使茎尖内组织进一步脱水 , 一些易形成玻璃
化状态的分子 (DMSO、EG、Gly) 很快进入到茎
尖组织 , 一旦快速冷冻 , 茎尖组织形成玻璃化状
态 , 可以减轻伤害 , 从而提高保存后的成活率和
再生率 , 而选择低温 (0 ℃) 比在室温下可以减
轻保护剂对材料的毒害〔3 ,10 ,11〕。
图 3 　PVS2 处理时间对成活率和再生率的影响
Fig. 3 　The effect of different time exposing with PVS2
on survival and regeneration rate
216 　解冻后的形态发生与植株再生
解冻后 , 将材料接种到培养基上 (其激素组合同以前) , 2～3 d 茎尖绿色先褪去 , 一周后成活的茎尖再
转为绿色。成活茎尖中 3317 %直接成苗 (图版 , D) , 而其它则形成愈伤组织 (图版 , E) , 这是茎尖保存所
应该避免的 , 因为经过愈伤组织 , 会增加体细胞变异的机率。经过保存后再生的芽苗在形态上与对照无异
(图版 , F) 。最后将能再生的植株转入到生根培养基上进行生根培养 (生根培养的条件与对照一致) , 保存
后的小芽能正常生根 , 生根后移栽到温室内。
综合以上结果 , 番木瓜茎尖超低温保存比较适宜的程序为 : 3～5 cm长的茎尖 , 在含有 5 % DMSO 培养
基上预培养 3 d , 然后剥取 115～215 mm长的茎尖 , 先在室温下用 60 % PVS2 溶液预处理 40～50 min , 再用
PVS2 处理 30 min , 换一次新鲜的 PVS2 溶液后 , 迅速投入到液氮中。保存 24 h 后 , 在 40 ℃水浴中化冻 , 洗
涤两次后接种到再生培养基上 , 成活率和再生率分别为 5317 %和 5216 %。
217 　超低温保存番木瓜茎尖品种间的差异
为了比较不同品种采用超低温保存后的成活率和再生率之间的差异 , 本试验将另外一个番木瓜品
种‘Hawaii solo Sunset’ (2000 年由美国夏威夷引种) , 采用相同的程序对其茎尖进行超低温保存 , 其
成活率和再生率分别为 4418 %和 4310 % , 结果与‘穗中红’有一定差别。
3 　讨论
在番木瓜的组织培养中 , 仅加生长素时 , 无菌苗生长势差 , 并且长出很多愈伤化的根 ; 但仅有细
胞分裂素时 , 愈伤组织生长多 , 叶片多白化 ; 只有当细胞分裂素和生长素结合使用时 , 才能够很好地
诱导丛芽 , 适宜于茎尖培养。一定程度地增加细胞分裂素浓度 , 可以增加丛芽数 , 但过高会导致丛芽
短 , 加入 110 mg/ L 的 GA3 , 可以使芽伸长 , 有利于茎尖培养。
番木瓜茎尖经过本方法保存后 , 一部分经过茎尖直接成苗 (图版 , D) , 但大部分茎尖在生长一
段时间后完全愈伤化 , 成为一团愈伤组织 (图版 , E) , 其中一部分愈伤组织可以转变为胚性愈伤组
织 , 通过体细胞胚胎发生途径实现植株再生 , 也有些愈伤组织不能通过体胚发生途径 , 最后死亡。在保
存杏茎尖时也发现类似的情况 , 将保存后的茎尖先在无激素的培养基上培养 2 周 , 然后再转移到有激素
的培养基上 , 克服了这个问题〔5〕。用该方法处理番木瓜 , 结果不理想 , 有待进一步研究。
超低温保存过程中 , 材料在液氮中保存的时间长短可能不是影响保存效果的因素。保存 1 d 和保
存 10 个月的樱桃在保存效果上没有明显区别〔9〕, 至于在超低温保存过程中给材料造成的损伤 , 有必
要从细胞的超微结构上对其进行探讨。
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图版说明 : A. 茎尖继代产生丛芽 ; B. 组织培养苗生根 ; C. 移栽成苗 ; D. 超低温保存后茎尖直接成苗 ; E. 超低温保存后茎尖愈
伤化 ; F. 保存前后对照。
Explanation of plates : A. Cluster buds of papaya derived from tissue culture ; B. Rooted plantler cluster buds ; C. Regeneration plantlet derived from
tissue culture ; D. Shoots regenerated directly from cryopreserved shoot2tips ; E. Calli formed from cryopreserved shoot2tips ; F. Left papaya plants de2
veloped from cryopreserved shoot2tips , right untreated control .
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