全 文 ：园 艺 学 报 一
右〕
利用分子标记对辣椒抗马铃薯 病毒的 个
进行选择
王 立浩’ , 张宝玺 ” , , 毛胜利 ’,
‘
’ 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 法国农业科学院蔬菜与果树遗传改良中心 , 法国蒙发威 ,
一
摘 要 为获得含有特定基因型的个体 , 深人研究辣椒抗马铃薯 病毒 不同 之间的关
系 , 利用 、 和 标记在辣椒材料 ‘ ’ 和 ‘ 。 ’ 组成的 和 , 分离世
代对抗 的 个 位点进行了选择 。 结果从 群体中选出 个在主效 上含有抗性位点的单
株 , 从中选出 个在 染色体上含有抗性位点的单株 , 最后选出 个在 染色体上含有抗
性位点的单株 从 群体中选出 个在 染色体上具有纯合抗性位点的单株 , 从中选出 个
在主效 上纯合抗性位点的单株 。 经卡平方检测 , 实际分离比例同理论分离比例差异不显著 。
关键词 辣椒 马铃薯 病毒 分子标记辅助选择
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 朋 刁
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叮
即 , 卯
,
在我国 , 马铃薯 病毒 对辣椒的危害仅次于烟草花叶病毒 和黄瓜花叶病毒
。 根据病毒与寄主抗性 基 因的相互关 系 , 该病毒可 划分为 个小种 —
。 、 、
,
一 , 。 目前在辣椒上 已发现 了 个单抗基 因 尸 , 尸 , 尸 ,
尸右麟 , 夕。 , 尸 和 组 、 , 甲 , 。 年 甲 等将
收稿 日期 一 一 修回 日期 一 一
基金项 目 国家 ‘ ’ 计划项 目 国家支撑计划项 目 田 农业部蔬菜遗传与生理重点开放实
验室项 目
通讯作者 肠 , 一 ,
园 艺 学 报 卷
脚 定位 , 与最近的 标记 的遗传图距为 。 等 将 定位到 连
锁群上 , 连锁距离最近的分子标记为 标记 。 和 测 两个基因连锁 ,
, 尸。 和尸 没有连锁关系 , 和尸 、 尸 也没有连锁关系 ,
, , 。 等 在辣椒 ‘ ’ 上发现 了 基因 , 抗
的所有小种 , 抗性呈显性遗传 。 等 年发现了数量遗传控制的 抗性 , 并进行了
数量性状位点 分析 , 发现共有 个 参与了性状控制 , 其中 个主效 位于染色体
上 , 抗 , , 和 , 有 个 具有上位互作 , 另有 个 与脚 , 币 位点
重合 。 由于单基因控制的垂直抗性很容易被病原小种通过突变而克服
,
学者们认为受多基因控制的水
平抗性可能更为持久 , 但利用传统的育种方法转育数量性状有较大困难 。 为了深人研究不同 之
间的关系 , 实现多个 在同一材料中的聚合 , 作者利用辣椒品种 ‘ ’ 和
‘ ’
的 群体和 ,群体 , 对 个染色体
、
和 上抗 的 进行
了分子标记选择 。
材料与方法
材料
抗 的辣椒 甲 材料 ‘ ’ , 由印度 大学 博士惠赠
含有部分抗性位点的感病甜椒 ‘哪〕 材料 ‘ ’
, 引自加里佛尼亚 。
来自于 的双单倍体 , 含有来自于 ‘ ’ 在连锁群
和 上的 个抗性位点和染色体 上的 个主效 感病位点
「 」 , 回交 自交 群体含有 个单株
仁 〕 回交 代 群体含有 个单株 。
数量位点和分子标记的选择
在材料 ‘ ’ 和 ‘ ’ 组成的作图群体中 , 个 的位置
、
抗性来源及其在
分离群体中的分布如表 所示 , 。 本研究针对其中 个 —位于上的主效 、 位于染色体 和 上的 个 进行选择 。 根据抗病基因内部序列
差异 , 开发了一个 标记 , 用于对主效 进行分析 利用在 置信区间两端的来源
于 ‘ ’ 的 一 和 两个标记和来源于 ‘ ’ 的 一 和 一
两个标记对 染色体上的 进行选择 。 在 的 置信区间两端 , 分别利用来源于
‘ ’ 的标记 夕
、 、 和 , 以及来源于 ‘ ’ 的
标记 、 多
、 , 对供试群体进行选择 。
提取
参考 等 微量法提取 。 摘取 片辣椒幼苗新叶于 离心管中 , 加人少量
石英砂 , 快速研磨 , 加人 提取液 林 , ℃提取 , 再加人等体积的氯仿 异戊醇
,
· 一 ’离心 。 吸取上清液加人 倍体积预冷的无水乙醇 ,
· 。 一 ’离心
, 用 乙醇和无水乙醇各洗 次 , 风干 。 用 溶解 , 的琼脂糖检测浓度 , 稀释到
· 林 一 ’备用 。
标记的设计与分析
在克隆和测序 ‘ ’ 和 ‘ ’ 主效位点的 脚 位点序列的基础上 , 设计
标记 。 利用 ‘ ’ 软件设计长度为 的两端引物 。 林 扩增体系 ,
公司 ,
· 一 ‘ 公司 ,
· 一 ’ , 引物 , 酶
公司 , 基因组 。 扩增程序 ℃ ℃ , ℃ , ℃ ,
期 王立浩等 利用分子标记对辣椒抗马铃薯 病毒的 个 进行选择
个循环 ℃ 。 酶切扩增产物 林 产物 , 公司 , 酶
公司 终体积 协 ℃酶切 , 酶切产物在 琼脂糖胶 ,
· 一 ’电泳 ,
染色观察结果 。
表 在 , 、 、 , 群体里的分布情况以及用于选择的分子标记
讲 一 , , , 哭 代 训 由
位置 抗病位点来源
基因型 其理论比例
罗
, , ,
标记
罗
《
一
,
,
、 ,
,
多
」 一
肠
,
川
、 , 妈厂 , ,
, 一 ,
只 巴
注 , 置信区间所在位置
, 其两边分别为不同的分子标记 黑体 选择的 基因互作 该位点同 ‘
’ 的基因型 该位点同 ‘ 。 ’ 基因型
,
罗 ‘ ’ ‘ ’
标记分析
的扩增程序
、 反应体系参考 , 等 的方法 。 利用 显影技术进行结果显示 。
标记分析
体系 卜 , 其中含 基因组 , 公司 ,
· 一 ’
公司 ,
· 一 ’ , 引物 气 一 ’ , ’
一 ‘ , 酶 公司 。 程序 ℃ ℃
, ℃ , , ℃ , , 个循环 ℃ 。 扩增产物在 琼脂糖胶 以 ,
· 一 ’电泳
, 染色观察结果 。
选择方法
首先采用易操作的 和 标记筛选 , 再利用 标记筛选 。 对 个 单株用标记
对主效 进行筛选 , 中选植株再用 标记 对 上的 进行筛
选 , 再在中选的植株中用 标记 进行确认 , 然后利用 标记 ,
, , 一 和 对 一 上 的 选择 , 并用 进行确
认 。 对 个 , 单株 , 首先经过 对主效 的筛选 , 再利用 标记 一 和
标记 对 上的 进行选择 。 对经过筛选获得的实际分离比例同理论分离比例
进行 尸测验 。
结果与分析
标记选择
利用设计的 引物对 ‘ ’ 、 ‘ ’ 、 和 、 , , 群体单株进行 扩
增 , 均扩增出约 的片段 。 图 显示了 扩增产物经酶切后的图像 。 ‘ ’ 具有
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条约 的亮带 , ‘ ’ 出现了 和 的 条带 , 出现同
‘ ’ 相同的
条带 , 但 的条带更亮 。 对 群体 , 经过 标记的选择 , 得到了 个在主效
上杂合 位点的单株
,
个纯合的 单株 , 株不确定 根据表 所列的 ,代该位点的
杂合基因型 , 代该位点理论上是 分离 , 实际分离比例经检测 厂 表 , 尸
,
说
明实际分离比例同理论比例差异不显著 , 符合理论分离假设 。 对 ,群体 , 经 的筛选 ,
在 株中 , 株在主效位点的基因型是 ‘ ’
,
株的基因型是 ‘ ’ 根据表 所列的 代的
该位点的杂合基因型 , 代该位点理论上是 分离
,
实际分离比例经检测 厂 】 表 ,
尸 , 说明实际分离比例同理论比例差异不显著 , 符合理论分离比例 二
图 标记对 群体选择的结果
理
一 长 〕 , 。 一一 一 一 一, 一 一 一 ” 一 ”
表 中选的 个 群体单株在 个 位点上的基因型
仁效
。、
染色体 刃
、
标记
基因型
二 译 一
『
一 ,
、
染色 本 一。
一宜劝 一。 一 、
一 一
丫
注 该位点同
‘ ’ 的基因型 该位点同 ‘
’ 基因型
一 ‘ 。一 ’ 罗 一一 ‘ ’
表 对 群体 个 位点进行选择后的中选单株的基因型和株数
,
上的基因型 主效 仁的基因型
子 ,
’
植株数
一 、
】即竹即料竹
注 该位点同 ‘
’
的基因型 飞
、, 。、 终 一一
、 ‘ 。· 一 ’
该位点
‘
,
’ 基因版
尸 〔一 下〕 ‘ 、
一
从 〔一 〔 ’
标记和 标记
标记的 产物经过检测
, ‘ ’ 没有打
’‘
增条带 ,
‘
,、 ’ 出现了
条约 的明亮条带
, 具有同样的条带 图 。 图 显示
」
标记 对
群体扩增的结果 , 通过 和 一 对 的筛选 , , 群体检测到 个
纯合抗性位点
一
单株
,
个纯 合感性 位点 单株 根 据 表 所 示 的位点 的 基 因 型
,
期 王立浩等 利用分子标记对辣椒抗 马铃薯 病毒的 个 、 进行选择
在 ,应当符合 的分离比例 , 经检测 厂 二 , 尸 , 说明实际分离比例同理
论比例差异不显著 。 群体再通过 一 的选择 , 检测到 个位于 的 ‘ ’ 基因型
个 , 株 的单株 , 根据表 所列的 , 代该位点的杂合基因型 , 代该位点理论上是
分离 , 经检测 厂 二 表 , 尸 , 说明实际分离比例同理论比例差异不显著 , 符合理论分
离假设 。 利用 标记
、 、 、 、 、 和
对 在中选的 单株中选择 , 仅选出 株含有需要的 个 , 根据表
所列的 ,代的该位点的杂合基因型 , 代该位点理论上是 分离
, 经检测 厂 表 , 尸
, 说明实际分离比例同理论比例差异不显著 , 符合理论分离假设 。
图 标记
,
对 群体中单株选择的结果
一 一
丫 一, 一 一 ,‘
、 一 一 弓 一 ,
选择结果
群体经过 标记的选择得到了在主效 上 个杂合 位点的单株 , 个
纯合 位点的单株 通过 一 的选择和 的确认 , 检测到 个位于 的
‘ ’ 基因型 的单株 株 , 株不确定 再经过 标记 , ,
, 〕 , 对 的选择 , 仅选出 株含需要的抗病位点的杂合型 , 表
显示 了其在 个 。上的基因型 。
对 , 群体 , 经过 一 巧 和 一 的筛选
, 得到 株纯合抗性位点 , 株纯合
感性位点 , 经检测 厂 , 尸 , 说明实际分离比例同理论比例差异不显著 , 符合
的分离比例 。 再经 少 的筛选 , 在 株中 , 株在主效位点的基因型是 ‘ ’ , 株基因型是
‘ ’ 株感性植株中 株在主效位点的基因型是 ‘ ’ , 株是 ‘ ’ , 实际分离比例经检测 厂
表 , 尸 , 说明实际分离比例同理论比例差异不显著 , 符合 的分离比例 。
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讨论
分子标记辅助选择可在早期对目标性状进行筛选 , 受环境影响小 , 因此快速而准确 。 在抗病育种
的实际工作中 , 由于数量性状抗性遗传的非质量性 , 同一抗病水平的材料之间遗传背景往往不同 , 利
用分子标记对 的选择可以较好解决这一问题 。 目前 , 美国
、 法国 、 韩国等国家在辣椒育种中都
在大量开发适用于辅助选择的分子标记 , 在抗疫病
、
病毒病抗病材料的品种选育中已经取得了不少成
绩 , 。 本文作者利用
、
和 种标记 , 对辣椒抗 的 进
行选择 , 在我国辣椒育种工作中相关研究还不多见 , 希望对辣椒分子标记辅助选择的发展会有推动作
用 。 在本文采用的
、 和 种标记中 , 前 种标记操作较简便 , 是用做分子标记辅助
选择的首选 。
本研究开发了一个新的 标记用于抗 主效 的辅助选择 。 该主效位点同抗病基因
尸 在相同的遗传位点 , , 通过比较 ‘ ’ 和 ‘ ’ 在该位点
上的基因序列 , 发现仅有 个碱基发生变化 , 基于此设计了 标记 , 。 由于
该 标记是基于基因序列本身产生的 , 因此该标记同基因的图谱位置是重合的 , 在选择过程中的
准确率很高 。 标记对辣椒的抗 选育将起到重要作用 。
本研究通过卡平方检测表明分离群体中来源于父母本的抗感位点实际分离比例同理论的分离比例
差异不显著 , 证实选择数据可靠 。 其中对 群体 , 经过 和 一 标记对主效
的筛选 , 得到 株纯合位点 , 株杂合感性位点 , 厂 , 尸 , 其卡平
方值略高 , 可能是读取数据时 , 没有将条带不清楚的计算在内而引起的误差 。 本试验是为了进一步研
究抗 不同 之间的关系 , 以及实现不同 在同一材料的聚合 , 因此对育种有一定意义 。
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