全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (4) : 643～647
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 11 - 11; 修回日期 : 2005 - 01 - 123 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: cqzhang@ sdau1edu1cn)
西瓜杂交种遗传多态性的 SRAP标记分析
李　严　张春庆 3
(山东农业大学农学院 , 泰安 271018)
摘 　要 : 利用新型分子标记 SRAP ( Sequence2Related Amp lified Polymorphism ) 进行西瓜杂交种遗传多
态性的研究 , 利用 25个引物组合对当前生产上推广的 20个西瓜杂交种进行扩增 , 从中筛选得到 20个多态
性引物组合 , 共产生 135个多态性条带 , 平均每个引物组合产生 7111个多态性条带 , 显示了较高的多态性
比率。聚类分析 20个引物组合的扩增结果 , 20份材料分为 3大类 , Jaccardpis相似系数在 0129～0186之间。
关键词 : 西瓜 ; 杂交种 ; 多态性 ; SRAP
中图分类号 : S 651　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0420643205
Stud ies on Genetic D iversity w ith a M olecular M arker SRAP of W a term elon
Hybr ids
L i Yan and Zhang Chunqing3
(College of A gronom y, Shandong A gricultural U niversity, Ta ipian 271018, Ch ina)
Abstract: Study on genetic diversity of watermelon could benefit the research of cultivar p roperty right
p rotecting, seed purity testing, and genetic breeding. A new molecular marker system2SRAP ( Sequence2Re2
lated Amp lified Polymorphism ) was firstly app lied on 20 watermelon hybrids genetic diversity research. 20
p rimer pairs selected from 25 amp lified 135 polymorphic bandswith an average of 7111 polymorphic bands per
p rimer pair. Cluster analysis using UPGMA method based on the data of SRAP amp lified bands by 20 p rimer
pairs showed 20 hybrids could be distinguished into three main group s. Jaccardpis sim ilarity coefficient ranged
from 0129 - 0186.
Key words: W atermelon; Hybrid; Polymorphism; SRAP
由于西瓜本身遗传基础狭窄 , 造成品种间多态性较低 , 国内外曾利用各种技术进行西瓜多态性分
析 , 有些研究表明利用蛋白质或同工酶谱带的差异可以区分部分西瓜品种〔1, 2〕, 有的却认为同工酶和
蛋白质很难或者无法在栽培品种之间产生多态性〔3, 4〕。欧阳新星等〔5〕曾针对 ‘京欣 1号 ’及其父母本
筛选了 320个 RAPD引物 , 仅得到 1个引物可以区分母本和杂交种 , 不能区分父本和杂交种。这说明
与其他作物相比 , 西瓜需要选择多态性更高的分子标记技术才能有效地区分不同种质材料。车克鹏
等〔6〕利用 AFLP技术对 30个西瓜核心种质材料进行分析 , 建立了可以相互区分的指纹图谱。但是
AFLP技术操作复杂成本昂贵 , 应用受到限制 , 新型 PCR标记技术 ———相关序列扩增多态性 SRAP
( Sequence2Related Amp lified Polymorphism ) 可以弥补上述不足。SRAP标记最早是在芸薹属作物中开
发利用 , 目前已在马铃薯、水稻、莴苣、花椰菜、油菜、大蒜、棉花等植物中应用 , 用于遗传多样性
分析、比较基因组学、图谱构建等方面〔7〕, 在国外应用较多〔8～13〕, 国内很少。本试验利用此项技术
对当前生产上推广的 20个西瓜杂交种多态性进行鉴定 , 为解决西瓜品种多态性较低的问题提供了可
能性 , 可为葫芦科其他作物的多态性研究提供有益的参考。
1　材料与方法
供试材料为 20个当前生产上推广的西瓜 F1杂交种 (图 2) , 购自泰安市南关种子市场 , 全部为
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
2003年收获的种子 , 其熟期、果形、叶形、粒形等农艺性状各不相同 , 具有代表性。试验地点为山
东农业大学农学院种子科学与工程试验室 , 时间为 2003～2004年。SRAP引物参考 Ferriol等〔10〕论文
中的引物 , 从中选出 5条正向引物和 5条反向引物 , 正向引物和反向引物两两搭配组合 , 形成 25个引
物组合。正向引物 ( forward p rimer) 有 ME21、ME22、ME26、ME27、ME28, 反向引物 ( reverse p rimer)
为 EM21、EM22、EM25、EM23、EM26。引物由上海生工合成 , Taq酶和反应底物均购自上海生工。
DNA提取方法参考 L i等〔8〕的方法做了调整 , 将提取叶片 DNA改为提取干种子 DNA , 并进行了
扩增效果的比较。PCR扩增反应体系和反应程序参考 Ferriol等〔10〕方法。PCR反应程序在 PTC2100温
度循环仪 (美国产 ) 上进行。扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 , 凝胶浓度为 10% , 电泳
缓冲液为 1 ×TBE, 稳压 120 V , 电泳至溴酚蓝移到凝胶底部结束。凝胶银染参考张军等〔14〕的方法 ,
银染后的凝胶利用复日凝胶成像仪拍摄保存。试验 3次重复。
数据分析计算 : 每个引物组合的多态性比率 ( % ) =引物组合扩增的多态性条带数 /总条带数 ×
100, 每个引物的鉴别能力 ( % ) =此引物组合可鉴别的品种类别数 /总品种数 ×100, 采用 Jaccardpis
相似系数 , 使用 NTSYS2pc 210软件 , 非加权组平均法 (UPGMA) 聚类。相似系数计算公式为 : S ij =
a / ( a + b + c) , 其中 a表示两份样品共有带数 , b表示 i样品特有的条带数 , c表示 j样品特有的条带
数。
2　结果与分析
211　D NA提取方法的比较
将提取叶片 DNA改为直接提取干种子的 DNA, 提取的 DNA经核酸浓度测定仪检测显示质量较
好 , 与叶片提取的 DNA经过扩增后比较 , 带型和效果一致。说明可以直接利用种子 DNA进行 SRAP
分析。这对样品的运输保存、缩减检验时间和降低成本具有实用价值。
212　引物的多态性分析
将 25个引物组合用于扩增 20个杂交种 , 除了 5个引物组合 ME22 /EM 22, ME27 /EM 22, ME27 /
EM 23, ME27 /EM 25, ME28 /EM 21扩增不成功或者没有多态性之外 , 其余 20个引物均能产生多态性
(表 1) , 其中多态性较高的引物组合有 ME21 /EM 22、ME21 /EM 23、ME21 /EM 26 (图 1)、ME22 /EM 21、
　　　 表 1　20个引物组合产生的多态性
Table 1　The num ber of polym orph ic bands genera ted by 20 pr im er pa irs
组合编号
Primer pair
serial number
组合名称
Name of p rimer pair
总条带数
Total number
of bands
多态性条带数
Number of
polymorphic bands
多态性比率
Polymorphic
rate ( % )
可鉴别的类别数
Number of
distinguishable kind
鉴别能力
D istinguished
ability( % )
1 ME21 /EM21 13 4 31 6 30
2 ME21 /EM22 18 9 50 14 40
3 ME21 /EM23 22 15 68 19 95
4 ME21 /EM25 11 4 36 6 30
5 ME21 /EM26 17 10 58 10 50
6 ME22 /EM21 18 5 28 9 45
8 ME22 /EM23 21 9 43 12 60
9 ME22 /EM25 17 5 29 19 95
10 ME22 /EM26 17 8 47 14 70
11 ME26 /EM21 16 6 38 14 70
12 ME26 /EM22 23 15 65 19 95
13 ME26 /EM23 16 8 50 14 70
14 ME26 /EM25 15 2 13 3 15
15 ME26 /EM26 18 9 50 17 85
16 ME27 /EM21 12 4 33 7 35
20 ME27 /EM26 13 2 15 3 30
22 ME28 /EM22 15 5 33 6 30
23 ME28 /EM23 17 8 47 9 45
24 ME28 /EM25 13 2 15 3 15
25 ME28 /EM26 19 5 26 7 35
446
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　4期 李 　严等 : 西瓜杂交种遗传多态性的 SRAP标记分析 　
ME22 /EM 23、ME26 /EM 22、ME26 /EM 26、ME28 /EM 26等。每个组合可产生 11～23条清晰条带 (表 1)。
20个引物组合共产生 135条多态性条带 , 每个组合的多态性条带数有 2～15不等 , 平均每个引物组
合产生 7111个多态性条带 , 单个引物组合的多态性比率在 13% ～68%之间。这说明 SRAP多态性较
高 , 适于分析西瓜等遗传差异小的作物。
图 1　引物 M E21 / EM 26对 20个杂交种的扩增结果
M为 DL2000, 1～20号品种见图 2, 箭头表示多态性条带。
F ig. 1　The am plif ica tion result of 20 wa term elon hybr ids by the pr im er pa ir M E21 /EM 26
M is DNA marker (DL2000) . Cultivar number is the same as Fig. 2, A rrows show polymorphic bands.
213　品种多态性鉴定
20个引物组合的鉴别能力在 15% ～95%之间 , 其中 3个引物组合 ME21 /EM 23、ME22 /EM 25、ME2
6 /EM 22的鉴别能力均达到 95% , 可以用来区分大部分品种。没有得到完全区分所有品种的单个引物
组合。这说明部分品种之间亲源关系极为接近。本试验分别对每两组引物组合的扩增结果采用
Jaccardpis相似系数进行 UPGMA聚类分析 , 得到可以完全区分 20个品种的 14组引物组合搭配 (表
2) , 选取其中的两对引物组合分别扩增比较结果 , 就可以达到完全鉴别的目的。从表 2中可以看出 ,
13个引物组合 (编号为 3, 12, 15, 6, 11, 2, 1, 8, 13, 16, 23, 20, 10) 可以用来搭配成为双引
物组合用于鉴别 , 选择引物组合进行搭配的原则主要依据各引物组合的鉴别能力 , 一般鉴别能力越
高 , 搭配的组合的鉴别能力越高 , 品种间多态性越高。
表 2　可以完全鉴别 20个杂交种的两对引物组合的搭配表
Table 2　Two pr im er pa ir com b ina tion to iden tify 20 hybr ids
组合搭配 (序号 )
Primer pair
combination
总多态性条数
Polymorphic bands
number
相似系数范围
Range of Jpis
coefficient
组合搭配 (序号 )
Primer pair
combination
总多态性条数
Polymorphic bands
number
相似系数范围
Range of Jpis
coefficient
3 + 12 30 0125～0186 3 + 16 19 0129～0181
3 + 15 24 0125～0186 3 + 20 17 0117～0186
3 + 6 20 0128～0188 3 + 23 23 0117～0189
3 + 11 21 0125～0185 12 + 2 24 0130～0192
3 + 1 19 0120～0188 12 + 15 24 0119～0188
3 + 8 24 0134～0185 15 + 11 15 0129～0192
3 + 13 23 0129～0181 11 + 10 14 0129～0191
根据 20对引物组合的扩增结果对 20个杂交种进行聚类分析 (图 2) , Jaccardpis相似系数在 0129～
0186之间。在相似系数为 0157的水平上 , 可以将试材分为 3大类 , 1～8号为 1类 , 9～11号为 1类 ,
13～16号、19、20号为 1类。12、17、18号由于遗传差异过大 , 难以归类。结果显示 , 试材间农艺
性状越相似 , 相似系数越高 , 例如相似系数较高 2号和 3号之间以及 19号和 20号之间无论在籽粒性
状还是果实性状上甚至产地来源上均一致。一般来说 , 农艺性状相近的品种之间具有较近的亲缘关
系 , 这说明 SRAP标记可以用来研究种质资源的亲缘关系。
546
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
图 2　20个西瓜杂交种材料的 UPGM A聚类图
F ig. 2　UPGM A dendrogram of 20 wa term elon hybr ids
3　讨论
SRAP标记技术与 RAPD方法相比 , 具有较高的引物多态性比率和鉴别能力 , 能够区分绝大多数
栽培品种 , 对于遗传差异过小的个别品种虽然尚不能利用单个引物组合进行鉴别 , 但是这些往往具有
相似农艺性状、即使采用田间种植也无法鉴别的品种之间可以选择鉴别能力较高的两个引物组合联合
鉴别。SRAP聚类分析结果可以用来研究品种间的亲源关系。SRAP的上游引物和下游引物可以通用 ,
两两搭配组合 , 提高了引物的利用效率 , 与 SSR相比省却了引物开发的困难 , 与 AFLP相比省却了酶
切、连接、扩增杂交等繁琐步骤 , 成本较低。SRAP具有 RAPD同样的操作简便性 , 仅在扩增产物的
检测上采用较复杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染技术 , 但是与琼脂糖电泳检测结果相比 , 分辨率大
大提高 , 而且不使用溴化乙锭 , 不会造成环境污染 , 减少操作危险性。多次重复试验结果稳定 , 克服
了 RAPD重复稳定性差的缺点。本文仅讨论了部分 SRAP引物组合 , 而且与林忠旭等〔13〕对棉花品种
多态性的 SRAP研究结果相比 , 西瓜的 SRAP多态性水平相对低 , 是与西瓜自身遗传资源有关 , 另外
是否与反应体系和反应程序有关还有待于进一步研究。
参考文献 :
1　王　玺. PAGE法鉴定西瓜杂交种研究初报. 沈阳农业大学学报 , 1996, 3, 27 (1) : 92～94
W ang X. Studies on PAGE method for the variety identification of hybrid watermelon seeds. Journal of Shenyang Agricultural University,
1996, 3, 27 (1) : 92～94 ( in Chinese)
2　李　丽 , 郑晓鹰 , 邢宝田. SDS2PAGE蛋白电泳技术在 F1 代杂交种纯度鉴定中的应用. 种子 , 2000, 6: 51～53
L i L, Zheng X Y, Xing B T. App lication of SDS2PAGE on F1 hybrids purity identification. Seed, 2000, 6: 51～53 ( in Chinese)
3　Zam ir D, Navot N, Rudich J. Enzyme polymorphorism in C itrullus and C. colocyth is in Israel and Sinai. Plant Systematics and Evolution,
1984, 146: 163～170
4　Navot N. L inkage relationship of 19 p rotein coding genes in watermelon. Theoretical and App lied Genetics, 1996, 72 (3) : 274～278
5　欧阳新星 , 许　勇 , 张海英. 应用 RAPD技术快速进行西瓜杂交种纯度鉴定的研究. 农业生物技术学报 , 1999, 7 (1) : 23～27
Ouyang X X, Xu Y, Zhang H Y. Rap id identification of hybrid purity in watermelon using RAPD. JournalAgriculturalB iotechnology, 1999,
7 (1) : 23～27 ( in Chinese)
6　车克鹏 , 许　勇 , 梁春阳. 西瓜核心种质的 AFLP指纹图谱和 SCAR标记. 植物学报 , 2003, 45 (6) : 731～735
646
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　4期 李 　严等 : 西瓜杂交种遗传多态性的 SRAP标记分析 　
Che K P , Xu Y, L iang C Y. AFLP fingerp rint and SCAR marker of watermelon core collection. Acta Botanica Sinica, 2003, 45 ( 6) :
731～735 ( in Chinese)
7　任　羽 , 王得元 , 张银东. 相关序列扩增多态性 ( SRAP) 一种新的分子标记技术. 中国农学通报 , 2004, 12: 11～12
Ren Y, W ang D Y, Zhang Y D. Sequence2related amp lified polymorphism ( SRAP) : a novel technique for molecular marker. Chinese Agri2
cultural Science Bulletin, 2004, 12: 11～12 ( in Chinese)
8　L i G, Quiros C F. Sequence2related amp lified polymorphism ( SRAP) , a new marker system based on a simp le PCR reaction: its app lication
to mapp ing and gene tagging in B rassica. Theoretical and App lied Genetics, 2001, 103: 455～461
9　FerriolM, Pico B, Nuez F. Genetic diversity of a germp lasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers. Theoretical and Ap2
p lied Genetics, 2003, 107: 271～282
10　FerriolM, Pico B, Pascual Fernandez de Cordova, Nuez F. Molecular diversity of a germp lasm collection of squash ( Cucurbita m oschata)
determ ined by SRAP and AFLP marker. Crop Science, 2004, 44: 653～664
11　Budak H, Shearman R C, Parmaksiz I. Molecular characterization of B uffalograss germp lasm using sequence2related amp lified polymorphism
markers. Theoretical and App lied Genetics, 2004, 108: 328～334
12　L i G, Gao M, Yang B, Quiros C F. Gene for gene alignment between the B rassicaand arabidopsis genomes by direct transcrip tome mapp ing.
Theoretical and App lied Genetics, 2003, 107: 168～180
13　林忠旭 , 张献龙 , 聂以春. 新型标记 SRAP在棉花 F2 分离群体及遗传多样性评价中的适用性分析. 遗传学报 , 2004, 31 ( 6) :
622～626
L in Z X, Zhang X L, N ie Y C. Evaluation of app lication of a new molecularmarker SRAP on analysis of F2 segregation population and genet2
ic diversity in cotton. Acta Genetica Sinica, 2004, 31 (6) : 622～626 ( in Chinese)
14　张　军 , 武耀廷 , 郭旺珍. 棉花微卫星标记的 PAGE /银染快速检测. 棉花学报 , 2000, 12 (5) : 267～269
Zhang J, W u Y T, Guo W Z. Markers in cotton with PAGE / silver staining. Cotton Science, 2000, 12 (5) : 267～269 ( in Chinese)
欢 迎 购 阅 下 列 新 书
1 - 1 《英汉生物学词汇》(第二版 ) 99元
1 - 7 《PCR技术实验指南》 (译 ) 110元
1 - 8 《植物生理与分子生物学》94元
1 - 9 《汉英生物学词汇》106元
1 - 11《蛋白质结构分析》 (译 ) 46元
1 - 13《蛋白质电泳实验技术》29元
1 - 14《分子遗传学》70元
1 - 17《植物分子遗传学》 (第二版 ) 88元
1 - 22《英汉化学化工词汇》 (第四版 ) 110元
1 - 24《精编分子生物学实验指南 》 (译 ) 123元
1 - 25《植物分子生物学实验指南》 (译 ) 52元
1 - 26《蛋白质纯化与鉴定实验指南》 (译 ) 52元
1 - 27《实用分子生物学方法手册》32元
1 - 31《被子植物有性生殖图谱》96元
1 - 32《基因工程原理 》 (第二版 ) 上册 58元
1 - 33《基因工程原理 》 (第二版 ) 下册 78元
1 - 38《植物生殖遗传学》30元
1 - 39《蛋白质技术手册》33元
1 - 41《英汉生物化学及分子生物学词典》88元
1 - 43《分子细胞生物学》78元
1 - 44《现代遗传学原理》77元
1 - 48《细胞信号转导》 (第三版 ) 55元
1 - 50《细胞实验指南》 (译 ) (上、下 ) 244元
1 - 52《分子克隆实验指南 》 (第三版 )
187元
1 - 53《生物信息学 : 序列与基因组分析》82元
1 - 54《生物化学技术原理及应用》(第三版 ) 45元
1 - 56《分子生物学》89元
1 - 57《微注射和转基因实验指南》66元
1 - 58《真核生物转录调控———概念、策
略和方法》86元
1 - 59《DNA与 RNA基本操作技术》52元
1 - 60《蛋白质组学 : 从序列到功能》50元
1 - 62《植物基因工程》(第 2版 ) 97元
1 - 63《基因组》55元
1 - 64《植物数量性状遗传体系》57元
1 - 65《体外培养的原理与技术》165元
1 - 66《PCR技术实验指南 》 (第二版 )
(影印版 ) 110元
1 - 67《RNA实验技术手册》75元
1 - 68《蛋白质化学与蛋白质组学》85元
1 - 69 《蛋白质与蛋白质组学实验指南 》
(影印版 ) 110元
1 - 70《蛋白质组学 : 理论与方法》53元
1 - 71《分子酶学工程导论》56元
1 - 72《分子生物学实验室工作汉英图解
指南》53元
1 - 73《高级分子生物学要义》179元
1 - 74《高级植物分子生物学》85元
1 - 75《基础生物化学》144元
1 - 76《基因及其表达》(第二版 ) 58元
1 - 77《进化生物技术 - 酶定向分子进化 》
45元
1 - 78《景观生态学原理及应用》53元
1 - 79《抗体技术实验指南》46元
1 - 80《耐盐植物研究》108元
1 - 81《染色体带 : 基因组的图型》32元
1 - 82《生物安全》68元
1 - 83《生物芯片分析》100元
1 - 84《生物信息学 : 方法与实践》47元
1 - 85《生物信息学中的计算机技术》 (影
印版 ) 56元
1 - 86《实用生物化学与分子生物学词典 》
86元
1 - 87《数量遗传学》38元
1 - 88《统计遗传学》67元
1 - 89《探索基因组学、蛋白质组学和生
物信息学》 (附光盘 ) 67元
1 - 90《现代细胞分子生物学技术》166元
1 - 91《现代英汉生物工程词典》75元
1 - 92《植物成分功能》111元
1 - 93《植物分子育种》69元
1 - 94《植物生物化学与分子生物学》 (全
彩色 ) 289元
1 - 95《中国农作物及其野生近缘植物染
色体图谱》203元
1 - 96 《中国园林花卉植物染色体图谱 》
251元
1 - 97《种子生理研究》124元
1 - 98《种子植物系统学》111元
1 - 99《种子植物形态解剖学导论》 (第二
版 ) 57元
　　以上价格已含邮资。购书者请通过邮局汇款至北京中关村南大街 12号 《园艺学报 》编辑部 , 邮编 : 100081。
746