全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2001 , 28 (3) : 189～193
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2000 - 11 - 17 ; 修回日期 : 2001 - 02 - 21
草莓主栽品种再生和转化的研究
张志宏1 　吴禄平1 　代红艳1 　王国英2 　赵天永2 　毕晓颖1 　杜国栋1
(1 沈阳农业大学园艺系 , 沈阳 110161 ;　2 中国农业大学生物技术国家重点实验室 , 北京 100094)
摘 　要 : 建立草莓主栽品种高效、稳定的离体再生体系和遗传转化体系 , 获得了转基因
植株。‘弗吉尼亚’和‘森嘎拉’的叶片离体再生芽频率达到 100 %。试管苗叶片与农杆菌菌
株 EHA105 共培养 3 d。共培养后的叶片在附加卡那霉素 40 mg/ L 的再生培养基上选择培养 4
周后 , 外植体再生出转化芽 , 弗吉尼亚的转化芽再生频率可达 6. 8 %。采用组织化学染色法对
随机选取的 10 个 GUS 基因转化植株进行基因表达测定 , 结果 5 个植株强烈表达 GUS活性。转
bar 基因植株在附加除草剂草丁膦 10 mg/ L 的培养基上能够正常分化 , 在田间对草丁膦表现出
强烈抗性。转基因植株开花、结果正常。
关键词 : 草莓 ; 再生 ; 转化 ; 抗除草剂
中图分类号 : S 668. 4 ; Q 785 　文献标识码 : A 　文章编号 : 05132353X (2001) 0320189205
近 10 年来 , 关于草莓遗传转化的研究 , 国内外已有一些报道〔1～3〕, 方法主要是农杆
菌介导的叶盘法〔1 ,2〕。草莓是高度杂合体 , 生产上采用无性繁殖。与其他植物一样 , 草莓
试材的基因型是决定遗传转化成功与否的一个非常重要的因子。因此 , 只有建立草莓优良
主栽品种的高效、稳定的离体再生和遗传转化体系 , 利用基因工程对草莓进行改良才更有
意义。
本研究旨在建立‘丰香’、‘弗吉尼亚’等我国目前主栽的草莓优良品种的再生和转化
体系 , 探索利用基因工程技术对其进行遗传改良的可行性 , 从而为草莓基因工程的实用化
奠定基础。
1 　材料与方法
1. 1 　植物材料
草莓 ( Fragaria ananassa) 品种‘弗吉尼亚’、‘丰香’、‘鬼怒甘’和‘森嘎拉’的试
管苗由沈阳农业大学果树分子生物学实验室保存 , 在 MS + BA 0. 2 mg/ L + GA3 0. 1 mg/ L +
IBA 0. 02 mg/ L 的培养基上以单株方式增殖继代 , 每次继代 200 株以上。在继代 30 d 的试
管苗上选取平展、幼嫩的叶片 , 剪成宽约 2 mm 的叶块 , 作为再生和转化的外植体。
1. 2 　根癌农杆菌菌株及载体
试验使用的根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumef aciens ) 菌株为 EHA105 (pMOG410) 和
EHA105 (pMG8) 。EHA105 (pMOG410) 由荷兰MOGEN 公司赠送。双元载体 pMOG410 携带
一个嵌合的 NOS . N PT Ⅱ基因和一个嵌合的 CaMV35S. GUS . INT 基因 , 由于 GUS 基因有内
含子 , 所以只在植物中表达而不在细菌中表达〔4〕。双元载体 pMG8 由中国农业大学分子遗
传学实验室构建 , 它携带一个嵌合的 N PT Ⅱ基因和一个嵌合的 bar 基因 (图 1) 。
图 1 　双元载体 pMG8 图谱
Fig. 1 　Binary vector pMG8
1. 3 　转化方法
挑取农杆菌单菌落接种于 10 mL 含卡那霉素 ( Km) 50 mg/ L 的 YEB 液体培养基中 ,
在 28 ℃下振荡培养过夜。第 2 天把过夜培养的农杆菌培养物稀释于新鲜的不含抗生素的
YEB 液体培养基中。稀释的培养物振荡培养 5～7 h 后 (此时的培养物在 600 nm 下 OD 值
约为 0. 5) 用以侵染事先剪好的草莓叶块。叶块在菌液中浸泡 5 min , 随后用无菌滤纸吸
干叶块上多余的菌液。在MS + TDZ 2. 0 mg/ L + IBA 0. 1 mg/ L 的培养基上共培养 3 d 后 , 转
到附加 Km 40 mg/ L 和头孢霉素 (cefotaxime , Cef) 200 mL/ L 的相同培养基上选择培养。筛
选出的不定芽在附加 Km 25 mg/ L 的草莓继代培养基上继续筛选并增殖。
1. 4 　培养条件
试管苗在 100 mL 三角瓶中培养 , 用于再生和转化的叶块在直径为 9 cm 的培养皿中培
养。培养间温度为 (25 ±1) ℃。光照强度约为 2 000 lx , 每天光照 16 h。
1. 5 　GUS 分析
参照 Jefferson 等〔5〕的 GUS 组织化学染色法对抗 Km 的转化植株进行 GUS 检测。染液中
含氧化催化剂氰铁酸钾。染液中 X2Gluc 浓度为 0. 5 mg/ mL。
1. 6 　PCR检测
对转 bar 基因的抗性植株进行 PCR 检测分析。采用 CTAB 法从草莓试管苗叶片中提取
DNA。针对 bar 基因的两个特异引物的序列分别为 : 5′端引物 : 5′GCGGTCTGCAC2
CATCGTCA 3′; 3′端引物 : 5′GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA 3′。扩增反应在 PE9700 PCR 仪上
进行 , 采用大连宝生物公司的 PCR 试剂盒 , 反应体积 20μL , 反应程序为 : 95 ℃3 min ,
94 ℃30 s , 55 ℃1 min , 72 ℃1 min 30 s , 35 个循环。扩增产物在 1. 5 %琼脂糖凝胶中电
泳。
1. 7 　统计分析
未经转化的外植体在再生培养基上培养 7 周后 , 调查不定芽再生频率 〔 (再生不定芽
的外植体数/ 接种外植体总数) ×100 %〕和外植体平均再生芽位点数 (外植体再生不定芽
位点总数/ 再生不定芽的外植体数) 。每种处理调查 25 个外植体 , 重复 1 次。经转化的叶
块在附加 Km 和 Cef 的再生培养基上选择培养 45 d 后 , 调查转化芽再生频率 〔 (再生转化
芽外植体数/ 调查外植体数) ×100 %〕。
2 　结果与分析
接种在再生培养基上的叶块培养 1 周后 , 叶片切口边缘向远轴面卷曲 , 叶片膨大。不
同品种从接种到不定芽出现所需时间不同 , 弗吉尼亚、森嘎拉约需 15 d , 鬼怒甘 20 d , 丰
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香 25 d。不定芽出现的高峰在接种后的第 4～6 周 , 多数不定芽的形成经历了愈伤组织阶
段。对于弗吉尼亚和森嘎拉这两个品种 , 通常在一个再生点上密集数个不定芽 , 不定芽较
小 , 难以调查数目 , 也难以区分是初生芽还是次生芽 , 因此以外植体平均再生芽位点数作
为评价再生效率的一个指标。
2. 1 　基因型对叶片再生不定芽的影响
不同草莓品种的叶片再生不定芽能力差异很大 (表 1) , 说明基因型是影响草莓叶片
再生能力的一个最重要的因素。在所试验的 4 个品种中 , 弗吉尼亚和森嘎拉的再生能力最
强 , 鬼怒甘中等 , 丰香较弱。研究中发现 , 再生能力弱的品种比其较强的品种对再生培养
基中激素的种类和浓度更为敏感。因此 , 通过对培养基中激素种类和浓度进行大量的筛选
试验 , 可以在一定水平上提高再生能力弱的基因型的再生效率 , 如丰香的叶片在 MS +
TDZ 2. 0 mg/ L + 2 ,42D 0. 1 mg/ L 培养基上再生频率可达 64 %。
表 1 　草莓基因型对叶片离体再生不定芽的影响
Table 1 　Effect of genotype on bud regeneration from leaf pieces of stra wberry
培 养 基
Medium (mg/ L)
再 生 频 率
Regeneration percentage ( %)
丰 香
Toyonoka
弗吉尼亚
Tudla
鬼怒甘
Kinuama
森嘎拉
Senga Sengana
外植体平均再生芽位点数
No. of bud sites per explant
丰 香
Toyonoka
弗吉尼亚
Tudla
鬼怒甘
Kinuama
森嘎拉
Senga Sengana
MS + TDZ 1. 0 10. 0 100. 0 2. 2 100. 0 1. 0 2. 0 1. 2 2. 2
MS + TDZ 1. 0 + IBA 0. 1 14. 0 100. 0 46. 0 100. 0 1. 1 2. 7 1. 6 3. 1
MS + TDZ 1. 0 + 2 ,42D 0. 1 32. 0 82. 0 18. 0 78. 0 1. 3 1. 7 1. 2 2. 1
2. 2 　培养基中激素对叶片再生不定芽的影响
研究中使用了两种细胞分裂素类物质 , 即嘌呤类的 62BA (6 - 苄氨基嘌呤) 和苯基脲
类的 TDZ (噻重氮苯基脲) 。结果发现 , 对于所试草莓品种的再生 , TDZ 的效果明显优于
62BA。TDZ不仅提高叶片的再生效率 , 而且有效浓度范围宽 , 如在 0. 5～8. 0 mg/ L 范围
内 , 对弗吉尼亚叶片的再生频率和外植体平均再生芽位点数均无显著影响 , 这与我们在苹
果上的研究结果〔6〕基本一致。TDZ与生长素类物质配合使用可以提高叶片的再生效率 (见
表 1) , 但不同品种对不同生长素类物质的反应不同 , 弗吉尼亚、森嘎拉和鬼怒甘均以附
加 IBA 的效果最好 , 而丰香则以附加 2 ,42D 的效果最好。
2. 3 　转化植株的获得
接种农杆菌的弗吉尼亚的叶片在选择培养基上培养 3 周后形成明显可见的抗性愈伤组
织 , 几乎每个外植体上都有。4 周后开始出现不定芽。不定芽中有部分是逃逸芽 , 个别转
化芽是转化嵌合体。用携有 GUS 基因的菌株 EHA105 (pMOG410) 进行侵染 , 两次转化试
验的转化芽再生频率分别是 3. 7 % (7/ 190) 和 4. 5 % (21/ 470) 。用携有 bar 基因的菌株
EHA105 (pMG8) 进行侵染 , 两次转化试验的转化芽再生频率分别是 6. 8 % (7/ 102) 和
3. 8 % (20/ 500) 。转化芽在附加 Km 25～50 mg/ L 的草莓继代培养基上能够正常生长、分
化、生根 , 形成完整的植株 , 而对照植株则逐渐白化死亡。bar 基因的转化芽在附加除草
剂草丁膦 10 mg/ L 的培养基上能够正常生长分化 , 而对照植株继代培养 1 个月后死亡。
2. 4 　转化植株的分析
利用 GUS 组织化学染色法对随机选取的 10 个独立的 GUS 基因转化植株进行 GUS 基因
1913 期 　　　　　　　　　　　张志宏等 : 草莓主栽品种再生和转化的研究 　　　　　　　　　　　
表达测定 , 结果 5 个转化植株表现出明显的蓝色反应 , 即 GUS 阳性反应。
　　对随机选取的两个独立的 bar 基因转
化植株进行 PCR 分析 , 结果均扩增出明显
的特异带 (图 2) 。
1998 年 4 月 , 转 bar 基因植株在温室
中移栽成活。1998 年 5 月 , 对转 bar 基因
植株和未转化对照植株喷 400 倍的有效成
份为草丁膦的除草剂 Basta (德国艾格福公
司产品 , 草丁膦的有效浓度为 18 %) , 未
转化对照植株喷洒 1 次后即表现出叶片焦
枯 , 10 d 后全部死亡 ; 而转 bar 基因植株
连续喷洒 3 次 (间隔 3 d 喷洒 1 次) 后仍
正常生长 , 对 Basta 表现出完全的抗性 (见
插页 1 , 图版 , A) 。1999～2000 年的两年
间 , 转 bar 基因植株均正常开花、结果
(见插页 1 , 图版 , B) , 其他生物学性状也
均表现正常。
图 2 　草莓部分 bar 基因转化植株的 PCR扩增检测结果
1 : DNA 分子量标记 ( EoR Ⅰ+ Hind Ⅲ酶切λDNA)
2 : 未转化对照植株　3 , 4 : bar 基因转化植株
Fig. 2 　PCR amplification results of stra wberry
plants transformed with bar gene
1 : DNA molecular marker (λDNA digested by EoR Ⅰ+
Hind Ⅲ) 　2 : Non2transformed control plant
3 , 4 : Transformed plants with bar gene
3 　讨论
本研究从多个方面对转化植株进行了筛选和鉴定 : 1. 在试管苗阶段 , 对转化植株进
行了严格的抗性筛选 ; 2. 利用 PCR 技术、GUS 组织化学染色法技术分别从外源基因的整
合和表达两个方面对转化植株进行了鉴定 ; 3. 对转化植株的目的性状在田间的表现进行
了鉴定。多方面的筛选鉴定结果表明 , 对于转 bar 基因植株 , 试管苗阶段的抗 Km 筛选结
果与 PCR 检测结果及田间的抗除草剂表现一致。表明本研究建立起草莓品种弗吉尼亚高
效、稳定的遗传转化系统 , 获得了转 bar 基因植株。目前 , 我们正在进行草莓抗白粉病基
因工程育种的研究。
越来越多的证据表明 , 对于多数植物的离体再生 , 基因型是最重要的因子。包括烟草
在内的模式植物也是这样。本研究结果也证实了这一点。培养条件 , 特别是培养基中的激
素对叶片再生能力有很大影响 , 这表明内源激素在再生反应中是很重要的 , 基因型对再生
能力的影响可能是由于那些和植物激素代谢及激素信号传递有关的基因的不同造成的。改
变培养条件 , 特别是对培养基中的激素的种类和配比进行调节 , 可以提高再生能力 , 如在
本研究中发现 , TDZ的效果显著优于 62BA , TDZ与 2 ,42D 配合使用 , 可以使丰香草莓的叶
片再生能力显著提高。但是外因毕竟是通过内因而起作用的 , 由于目前对再生的分子机制
仍知之甚少 , 所以大量组培条件的筛选工作并不一定能完全克服再生对基因型的依赖。
参考文献 :
1　Nehra N S , Chibbar R N , Kartha K K. Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium tumefaciens using a leaf disk
regeneration system. Plant Cell Rep . , 1990 , 9 : 293～298
2 　James D J , Passey A J , Webster A D , et al . Transgenic apple and strawberry : advances in transformation , introduction of genes
291　　　　　　　　　　　　　　　园 　　艺 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　28 卷
for insect resistance and field studies of tissue cultured plants. Acta Horticulturae , 1993 , 336 : 179～184
3 　刘风华 , 郭　岩 , 谷冬梅 , 等. 转甜菜碱醛脱氢酶基因植物耐盐性研究. 遗传学报 , 1997 , 24 : 54～58
4 　Hood E E , Gelvin S B , Melchers , et al . New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Res. , 1993 ,
2 : 208～212
5 　Jefferson R A , Kavanagh T A , Bevan M W. GUS fusion : β2glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher
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6 　张志宏 , 景士西 , 王关林 , 等. 苹果品种新乔纳金离体再生体系的建立. 农业生物技术学报 , 1997 , 5 : 305～306
Regeneration and Transformation in Vitro of the Stra wberry Varieties
Zhang Zhihong1 , Wu Luping1 , Dai Hongyan1 , Wang Guoying2 , Zhao Tianyong2 , Bi Xiaoying1 ,
and Du Guodong1
(1 Department of Horticulture , Shenyang Agricultural University , Shenyang 110161 ;　2 College of Biology , China Agri2
cultural University , Beijing 100094)
Abstract : An efficiency and stable regeneration system in vitro and genetic transformation system
for the commercial strawberry varieties were developed , and transgenic plants were obtained. Bud re2
generation percentage of leaf pieces of strawberry varieties‘Tudla’and‘Senga Sengana’reached
100 %. Leaf pieces from in vitro2grown plants‘Tudla’were cocultivated for 3 days with Agrobacte2
rium tumef aciens EHA105. After the cocultivated leaf pieces were incubated on regeneration medium
containing 40 mg/ L kanamycin for 4 weeks , the transformed buds appeared on the explants. The re2
generation percentage of transformation buds of strawberry variety‘Tudla’reached 6. 8 %. The result
of histochemical staining of GUS gene showed , of the 10 independent plants transformed with GUS
gene , 5 expressed GUS activity strongly. The plants transformed with bar gene were able to differen2
tiation on the medium containing glufosinate 10 mg/ L , and expressed strongly resistance to glufosinate
on field. The transgenic plants flowered and fruited normally.
Key words : Strawberry ; Regeneration ; Transformation ; Resistance to herbicide
中国园艺学会第九次全国代表大会暨学术年会征文通知
根据中国园艺学会章程关于每届理事会任期四年的规定 , 第八届理事会将于 2001 年第四季度期满。
经第八届第十次京津保常务理事扩大会议研究决定 : 将于 2001 年第四季度召开中国园艺学会第九次全国
代表大会暨学术年会 , 特向全国征集学术论文。
1. 征文范围 : 果树、蔬菜、西瓜甜瓜、观赏植物的遗传育种、栽培技术、种质资源、病虫害防治、
贮藏加工、生物技术、宏观发展战略等有关内容。
2. 论文要求 : 内容新颖 , 具有一定的学术水平。文字简练 , 全文在 4000 字以内 , 字迹清楚 , 一式
三份。第八届中国园艺学会会员的论文优先录用。
3. 征文截止时间 : 2001 年 8 月 15 日 (以当地邮戳为准) 。已在期刊、论文集或全国性会议上发表过
的文章请勿报送。
4. 论文寄送地址 : 按专业分别寄送各专业委员会。果树论文 : 辽宁省兴城中国农科院果树所
(125100) ; 蔬菜论文 : 北京中国农科院蔬菜花卉所 (100081) ; 观赏园艺论文 : 北京林业大学园林学院
(100083) ; 西瓜甜瓜论文 : 河南郑州中国农科院郑州果树所 (450004) 。
中国园艺学会
2001 年 4 月 16 日
3913 期 　　　　　　　　　　　张志宏等 : 草莓主栽品种再生和转化的研究