全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(3)：381～383
Aeta Horticulturae Sinica
甘蓝和油菜中类硫氧还蛋白THL2基因的克隆与序
列分析
王茂广 吴俊岩 吴能表 朱利泉 王小佳
( 西南农业大学农学与生命科学学院生化实验室，重庆400716； 西南农业大学园艺园林学院，重庆市蔬菜学重点实
验室，重庆400716)
摘 要：采用PCR和RT—PCR方法，对甘蓝和油菜的基因组DNA和柱头总RNA进行扩增，获得了类
硫氧还蛋白THL2的DNA和eDNA。序列分析首次表明THL2基因有两个内含子，并且在油菜和甘蓝中的大
小不同。进一步分析表明，油菜和甘蓝中THL2 DNA序列的同源性为96％。
关键词：自交不亲和性；THL2基因；克隆；序列分析
中图分类号：S 635 文献标识码：A 文章编号：0513．353X (2004)03-0381-03
Cloning and Sequence An~ysis of Thioredoxin-h-like 2 Gene in Brassica
napus L and Brassica olereacea L．
Wang Maoguang ，Wu Junyan ，Wu Nengbiao ，Zhu Liquan ，and Wang Xiaojia
( Laboratory ofBiochemistry，College ofAgronomy and Life Sciences，Southwest Agricultural University，Chongqing 400716，
China； Chongqing Key Laboratory of Olericulture，College of Horticulture and Gardens，Southwest Agricultural University，
Chongqing400716．China)
Abstract：Thioredoxin．h．1ike protein舰 DNA and c DNA were amplifed from genomic DNA and stig．
ma total RNA in Brassica napus L．and B．olereacea L by PCR and RT．PCR method respectively．Sequence
analysis first indicated山at凇 gene contained two introns．which were diferent in size between B．nap
L and B．olereacea L Homologous analysis demonstrated that there was 96％ identity of DNA from B．
napus L and B．o[ereacea L．．
Key words：Self-incompatibility； gene；Cloning；Sequence analysis
1 目的、材料与方法
自交不亲和性 (serf-incompatibility，si)在遗传上受s一位点 (S-locus)控制。在孢子体型自交
不亲和的芸薹属中，S位点受体激酶 (S-locus receptor kinase，SRK)是柱头S基因编码的一种跨膜的
蛋白质激酶 ．¨2 ；s位点富含半胱氨酸蛋白 (S—locus cysteine rich protein，SCR)是花粉s基因编码的
一 种配体蛋白 ]，当白花花粉落到柱头上时，SCR特异地结合在SRK的受体结构域上，启动一个信
号传递过程，最终导致SI反应。而类硫氧还蛋白THL2(Thioredoxin—h—like 2)能与SRK的胞内激酶
结构域特异结合，抑制SRK的自磷酸化作用 ，从而阻止sI反应信号的传递。但是目前对THL2抑
制SRK活性的分子机理还知之甚少。在油菜中已经克隆了它的cDNA ，但对其与基因组DNA的比
较分析尚未见报道。本试验以西南农业大学提供的 ‘西园四号’甘蓝和 ‘2001817’油菜为试材，分
别克隆甘蓝和油菜中THL2 DNA和cDNA，对其序列进行比较分析，以期为进一步弄清 THL2编码基
因的结构与遗传变异提供新内容。
用本实验室改良的CTAB法提取甘蓝和油菜基因组DNA，根据THI2的cDNA序列，设计合成了
收稿日期：2003—07—15；修回日期：2003—1O一14
基金项目：国家自然科学基金资助项目 (30170646)；重庆市应用基础项目 (6870)
}通讯作者Corresponding author；zhu一1q2002@yahoo．con1．cn；xj@swau．cq．cn
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1对寡核苷酸引物：P (5 IGCAGAAGAGGGAC~AG。l"-3’)和 P：(51_AGGCAATGGTCTI"ATGATG·
3’)。为了符台引物设计的合理性，5’引物设计刚从起始密码子之后的碱基开始，引物合成由上海生
工公司完成。用PCR反应试剂盒 (上海 工)扩增THI2 DNA 用UNIQ一10 Tfizd Total RNA Prepara-
lion Kit抽提甘蓝和油菜柱头总RNA。以总RNA为模板，用eDNA First Strand Synthesis Kit和特异性引
物P1进行反转录台成eDNA第一链．再以eDNA第 一链为模板，用引物P 和P：进行PCR扩增THI2
eDNA。PCR和RT—PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳．目的带经回收纯化后．与pUCm T载体 (七海
生工)连结，然后转化大肠杆菌DH5t~感受态细胞进行蓝白筛选．通过菌液PCR和酶切分析筛选阳
性克隆，然后送上海生工测序+得到甘蓝和油菜THIO_的DNA与eDNA序列。
2 结果分析与讨论
2．1 PCR和RT-PCR扩增产物电泳分析
PCR和RT—PCR产物经 1％的琼脂糖凝胶电
泳显示，分别获得了880 bp左右和520 bP左右的
扩增条带 (图1)．谱带显示扩增的DNA和cDNA
在油菜与甘蓝中的的大小基本相同：
2．2 测序结果及序列分析
扩增产物经回收纯化、克隆和验证后，进行
两端测序 测序结果 (图2)表明克隆的油菜中
THL2 DNA长为888 bp，eDNA氏为524 bp；甘蓝
中THL2 DNA长为879 bp．cDNA长为516 bp 比
较THL2 DNA与eDNA序列发现，油菜THI2 DNA
在86～348位和475～575位序列不编码任何氨基
酸，是非编码区，推测这两部分序列为内含子．
大小为263 bp和 l0l bp；甘蓝中 THL2 DNA与
eDNA序列比较相似，两个内含子起止位点分别
●卜-88t~p
●卜-．~20bp
M A B C D
圉1 PCR和RT·PCR产鞫电泳
M：Marker hDNK．"HindⅢ+EeoRI A：油菜PCR产物；B：油菜
I¨-PCR产物：c：甘蓝PCR产物；D：甘蓝HT—PCR产物
Fig．1 PCR and RT·PeR products
M：№ 加N IE Ⅲ+ 佣 ； ：^|U pm·h-I 跏瑚 岬 L：
B：RT—PCR product of且 m I ；C：PcR product 0f
且 n ⋯ ¨【 ；I)·RT—PCR p~luct of ．o／e~aea 1．
在86～354位和481—574位，大小为269 hp和94 l p 这两个内含子的剪切位点都符合典型的GT-
AG法则。
将甘蓝与油菜的 THIQ_DNA序列比较发现，在编码区仅有四处碱基不同 (cAG—GCG，A丌一
AAT，AcA—Acc，AAT—A( )，其中AcA—ACC未造成氨基酸的变化，属于同义突变；其余3个
碱基都是在第2位密码子的位置上发生突变，造成了氨基酸的变化，属于错义突变=这表明THI2基
因在不同作物中存在进化上的差异 用MegAlign程序 (DNAStar公司)分析表明油菜与甘蓝中THL2
DNA序列的同源性为96％：进一步将 THL2 DNA的编码区与非编码区序列比较发现，编码区序列高
度保守，而两个内含子序列和3’的非翻译区 (UTR)保守程度较低，反映了这些序列比编码区累积
突变的程度更高。
根据cDNA推导了THL2的氨基酸序列，克隆的THL2基因含有编码 117个氨基酸的开放阅读框，
由3个外显子组成，在第2个外显子中有1个与SRK的Cys*s-特异结台的反应活性位点CPPC ，这
两个Cys在与SRK的结合中起关键作用 。油菜中THI2编码的氨基酸与文献报道 的一致，从而肯
定了所克隆基因的正确性；甘蓝中THL2编码的氨基酸与文献报道 的有3处差异 (图2)，由于我
们采用的PCR扩增错误率小于万分之一，而扩增的c．DNA大小仅为516 bp，认为该差异是甘蓝中
THL2基因本身造成突变的可能性较大 这种变异是否会影响THL2蛋白的空间构象及其在孢子体型
自交不亲和性信号转导过程中与SRK的结合情况，还需要进行深入研究。
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3期 王茂广等：甘蓝和油菜中类硫氧还蛋白THL2基因的克隆与序列分析 383
napus
B olereacea
napus
olereacea
GcA GAA GAG GGA CAA ATC GGT TGC CAC GAG ATT 6AT 6TA TGG GCC GTG cAG C11。
GAC ACA GCC C』 TCC hAC AAG CTG
58
58
gtgaaaatttctctccctttt gaat ccgacaagctaa 122
+++ ++++a++++++++++t++++at++++++++++++ 1 25
tacgtcggattgtcggtattgtttcgtctgtt gatttggaattaggttttcgtttttttttctcattttatzcttg 198
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ATT GTG ATA GAT TTC ACT GCT TCA TGG TGC CCA CCA TGC CGC ATG ATT GCT CCA GTT
十 + + 十 十十 ++ + + +十 十+ + + ++ ++ + + + + + + + ++ ++ + + ++ ++ + ++ + +
I V I D F T A S W C P P C R M I A P V
木 木 木 半 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木
TTC GCA GAT CTG GCC AAG AAG TTC ATG TCA AGT GCC ATC TTC TTC AAG GTG GAC GTC
+ ++ ++ + + ++ ++ + + + + ++ + + ++ ++ + + + + + + + + + + +
F A D L A K K F M S S A I F F K V D V
木 木 木 术 木 木 木 木 木 木 木 术 木 木 木 木 木 木 木
GAT GAA CTG CAG gtcaacagcattcttatgtttgcacttataattatttattacacccatatatatatataca
200
274
277
348
354
405
411
462
468
535
536
602
601
N V A Q E F G V E
S 木 木 木 木 木 宰 木 木
GCA ATG CCG ACC TTT GTG TTC ATC A从 GAC GGA AAT GTT GTT GAT AAG GTC GTT GGT 659
+++ +++ +++ +++ +++ +++ 一++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 658
A M P T F V F I K D G N V V D K V V G
木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 半 木 木 木 木 木 木 木
GCA AGG AAG GAA GAT CTT CAT GCC ACA ATA GCC AAG CAT AcT GGT GTT GCT ACT GCT TAft．719
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ + ++ + 71 Q
A R K E D L H A T I A K H T G V A T A End
木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木
agttggttatgagacaataataagttccagttagttttattttaagtttcgctaatagtaatggggatattgtagat 796
+++十+++++++++++++++++++ac+++++++一++十+++++ +++++++++++++ ++++++++++++++++++++ 795
gtagaagaataatgtagtggttaagtgatctctgactcttttgagtctgcaagactgcaacaatactataatg~atcI 873
tg++tt++++++++++++a+++++++++++++ +++++++ c++++++++++ +++++t++++++a++++ 864
r————————————] lataagaccattgcctI 888
+++++++++++++++ 879
图2 油菜和甘蓝中THL2基因DNA和cDNA的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列比较
核苷酸大写部分为开放阅读框，其下为相应的氨基酸序列；单下划线部分为内含子序列，其中黑体部分为可能的内含子
剪切位点；双下划线为 THI2的反应活性位点；方框内序列为THI2扩增引物。+示相同的碱基； 示相同的氨基酸。
Fig．2 Comparison ofnucleotide sequencesof the THL2DNA and eDNAfrom B．napu．$L．an d丑．olereacea L．
and derived amino acid sequences
The ORF is indicated witl capital leter and its deduced amino acid sequence is shown in one．1etter code under山e DNA．sequence：
The introns are sin~e underlined and the putative splice site of intmns are shown with black leters；Active site residues are double
underlined；Th e primers a boxed． +indicatod identical nucleotide： indicated identical am ino acid
．
参考文献：
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