全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(6)：668 672
Acta Horticldturae s】niea
利用 eDNA．AFLP技术鉴定甘蓝显性核不育基 因相
关表达序列
娄 平 王晓武 Guusje．Bonnema2 方智远
( 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ，北京 100081； [al~ratory of Plant Breeding，Wageningen University，Wageningen 6700AJ，
Netherlards)
摘 要：利用 eDNA—AFLP技术 ，比较分析 了一个甘蓝与两个青花菜 自交系 回交转育的显性核基 因雄性
不育材料与对应可育亲本植株花蕾发育过程 中基 因表达的差异。将 花蕾混合提取 RNA合成 eDNA建立 6个
eDNA池 ，分析 128个弓l物组合获得了 26000个片段 ，共鉴定 24个片段与雄性不育相关 ，其 中 13条表现为
质的差异 ，11条表现为量 的差异 ；将其 中引物组合 A16T15产生 的 300 bp左 右的差异片段进行克隆测序 ，
BLAST结果表明，该序列与花粉特异性相关的硫氧还蛋白氨基酸序列同源性达 89％。
关键词 ：甘蓝 ；显性核不育；eDNA—AFIJ~；差异表达序列
中图分类号 ：S 635 文献标识码 ：A 文章编号 ：0513—353X (2003)06-0668．05
选育可利用的雄性不育系用于生产一代杂种是长期以来国内外遗传育种工作者研究的热点。1979
年中国农业科学院蔬菜花卉所甘蓝育种组从甘蓝原始材料 79．399的 自然群体中获得雄性不育株 ，通
过研究明确其不育性受一对显性核基因控制 ，并且通过选育已经育成可利用的显性雄性不育系u]。在
此基础上进行了该不育基因的 RAID标记 ，并 已经转化 为稳定的 SCAR (Sequence Characterized Ampli．
fled Regions)和 ERPAR (Extended Random Primer Amplifed Region)标记 ，3J。对该甘蓝显性雄性不育材
料花药发育细胞学研究表明，其不育花花药的发育过程中，四分体孢子不能从胼胝质里释放出来，致
使小孢子逐渐发生败育，从而引起雄性不育L4]。说明在四分体发育中，雄性不育基因阻断或抑制了正
常小孢子发育基因的表达 ，从而导致小孢子不能正常发育。有关该显性核不育材料在小孢子发育过程
中基因表达上的差异尚未见报道。利用分子生物学技术 ，对不育基因的表达差异进行研究，从差异表
达的产物中找到与雄性不育基因相关的差异表达片段 ，通过文库的筛选等手段最终达到克隆基因的 目
的是 目前国内外雄性不育研究的重要 内容。eDNA．AFLP技术是研究基因表达的一种快速有效方法 ，与
常规差异显示相比具备许多优点 ，目前已经广泛应用于分子生物学的各个领域【 ~8j。本研究利用该技
术研究甘蓝在小孢子发育中一些与显性核不育相关基因在转录水平上的表达，旨在对显性雄性不育的
机理和小孢子发育研究提供分子生物学依据。
1 材料与方法
1．1 甘蓝材料的准备
试验材料为甘蓝 自交系 23202显性不育回交 B 分离群体 ，青花菜 自交系 B8551及 B8590的显性
雄性不育 回交转育的 BC6代分离群体，均来 自中国农业科学院蔬菜花卉研究所。所用 3个不育系的显
性雄性不育基因均来源于相同甘蓝雄性不育突变株。
1．2 BsA分析
采用 BSA (Bulk Segregation Analysis)的策略，选取分离后代不同发育阶段的花蕾构建不育 eDNA
池和可育 eDNA池。当第一朵花开放时，从花序最低端花蕾开始取样 ，一直到花序顶端的最小可见花
收稿日期：2002—12—06；修回日期 ：2003—03—05
基金项 目：农业部蔬菜遗传与生理重点实验室项目；中一荷联合园艺作物基因组技术实验室资助项 目
*通讯作者，项目主持人。
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蕾，然后将这些花蕾混合 ，共建 6个池 (表 1)。
混合花蕾取样法参见文献 14。
1．3 RNA提取与双链 eDNA的合成
花蕾总 RNA提取采用 Trizol试剂盒 (GIBCO，
Life Technologies)，按 Trizol试剂盒说 明书上 的方
法进行 取 0．1 g混合 花蕾 液氮研磨后加入 1．2
mL Trizol缓 冲液 ，最后 RNA溶 于 20 DEPC水
中。总 RNA用 DNase(AMERSR~M PHARMACIA)
室温处理 30 min后用于 cDNA合成 。
表 1 6个池中材料的来源背景及育性情况
Table1 Background ofthematerialsin six pools
第 l链 的 合 成 采 用 SuperscriptⅡ逆 转 录 酶
(GIBCO、Life Technologies)，方法依照使用说明；第 2链的合成使用 TAKARA Ribonuclease H和 E．coli
DNA Ligase，方法参照 TAKARA生产的 E．coli DNA Ligase使用说明书。合成后的双链 cDNA经氯仿抽
提纯化后溶于 20 超纯水中。
1．4 eD NA．AFLP差异显示
cDNA．AFLP体系及程序参照 Christian等l J的方法，使用 Licor公司生产的 IR2 DNA Analyzer 5200型
测序仪电泳分析 利用荧光标记的 AseI引物和非荧光标记的 TaqI引物 ，其中选用荧光标记引物 8个
和非荧光标记引物 16个 ，共 128个引物组合进行差异片段筛选。
1．5 差异片段回收及克隆测序
由于采用荧光标记引物和 Licor DNA自动测序仪，所 以差异片段无法回收。将产生差异片段引
物组合的 PCR产物在 6％的丙稀酰胺胶上分离 ，通过银染显色 ，银染方法参照文献 [9]。用刀片切
取差异条带 ，浸泡在高盐缓冲液中 (20％乙醇 ，1 tool·L～ LiC1，10 mmol·L Tris)24 h，65℃水浴
2 h，然后氯仿抽提 ，乙醇沉淀后吹干，DNA溶于 40 水 中。取 5 用作模板在相同的 PCR条件
下重新扩 增 ，程 序为 95c 5 min变性 ，94c 30 S，56c 30 S，72c 60 S，30个循 环后 72c 10
min[1O·l
，
扩增产物在 1％的琼脂糖上分离，检验差异片段的大小是否正确，利用 TAKARA公司 PMD18一T
载体克隆差异片段后，由季康生物技术公司代为测序。
1．6 序列比较分析
获得序列利用 BLAST联 网服务 (NCBI，National Center for Biotechnology Services)进行 比较 ，将获
得的差异序列利用 BLAST N和 BLAST X程序与数据库中所有序列进行比较，如没有显著同源性，再
用 BLAST N程序与芸薹属 EST 库中的序列进行比较分析。
2 结果与分析
2．1 甘蓝、青花菜雄性不育系与可育系花蕾发育过程中差异表达基因分析
分析甘蓝显性核不育材料不育与对应可育亲本在花蕾发育过程中差异表达片段 ，提取植株花蕾的
RNA合成 cDNA，利用 AseI 2个选择性碱基荧光标记引物和 TaqI 2个选择性碱基共 128个引物组合 ，
从 6个池 中共扩增出大约 26000条 (大于 100 bp)清晰可见的条带 ，其 中有下列条带类型： I在所有
池中均出现的条带 ，占53．8％，来源于甘蓝与青花菜共有的一些保守基因；1I在甘蓝池中出现，而
在青花菜中不存在的差异 ，占41．6％，是一些甘蓝与青花菜两种作物间存在的背景差异造成的；m
只在青花菜中可育池与不育池存在的差异片段或只在甘蓝不育池与可育池中存在的差异 ，约占 4％，
可能两种基因参与作用，一是只 与青花菜或甘蓝的花蕾发育有关的一类基因；二是甘蓝或青花菜所特
有的与雄性不育表达有关的基因；Ⅳ在青花菜与甘蓝可育与不育池中同时存在的差异表达条带，共
24条 ，占总条带数的 0．28％，即与显性核不育表达相关的片段 ，因为在本试验中无论青花菜还是甘蓝
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的雄性不育均来源于同一个甘蓝雄性不育突变体的
回交转育，为同一个基因所控制。结果见图 1(图
中仅显示 6条Ⅳ类差异条带，其他 18条见表 2)。
在所有可育池与不育池中扩增出的具有共同
差异的条带有两类 ，第一类是扩增质的差异 (有
或无)，模式如图 1，B所示 ；第二类是扩增量的
差异 (条带 的深 或浅 )见图 1，C。由于 cDNA—
AFLP技术显示的是植物在表达水平上的差异 ，所
以无论扩增质的差异还是扩增量的差异 ，均能正
确反映出基因在整个发育 阶段 的表达变化。试验
中一些差异条带 只是在扩增量上存在差异，表明
在不育植株和可育植株在花蕾 的发育过程中，一
些基因在不同发育阶段只是在表达量上存在不同。
本试验优先回收具有扩增质差异的片段 。已经确
认与雄性不育有关的差异片段见表 2。
表 2 与显性核不育相关片段的引物组合、分子量及表现模式
Table 2 The primer combinations，sizes and pattern ofthe
diferential bandsrelatedto dominantmale stermty
A14T12 A16T15 A14T22 A18T13
． ．
A15T12 A18T18
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6⋯ 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
△!垒! 苎
l 2 3 4 5 6
Al5Tl2
r— —了— —
图 1 甘蓝及青花菜雄性不育及可育池花蕾发育中 cDNA-AFLP差异显示图谱 (A)及引物组合 AI6T15(B)
和 AI5T12(c)差异显示部分放大图片
1 BS1(青花菜不育池)；2．BF1(青花菜可育池)；3．BS2(青花菜不育池)；4．BF2(青花菜可育池 )；5．CA (甘蓝不育池)
6．CF(甘蓝可育池) A14T12，A16T15，A14T22，A18T13，A15T12，A18T18代表不同引物组合。
． 1 cDNA-AFLP differential display profile betweea cablxlge and broccolifertile andmale sterileline pools during
theflower bud development(A)and enlarged section ofprofile created by primer combinationAI6T15(B)andAIST12(C)
1．BS1(Broccoli sterile pools)；2．BF1(Broccoli fertile pools)；3．BS2(Broccoli sterile pools)；4．BF2 (Broccoli ferfile pools)；
5．CA (C~ bage sterile pools)；6．CF (Cabbage fertile pools) A14T12，A16T15，A14T22，A18T13，A15T12，A18T18
present primer combination respectly．
2．2 与显性核不育基因表达相关序列分析
由试验材料的遗传背景可以看出，由于采用多代回交的甘蓝为材料 ，不育与可育材料之间的遗传
背景已经相当一致 ，它们之间的差异可以初步认定由雄性不育基因引起。另外同时分析了青花菜显性
核不育回交的两个株系，来验证差异的可靠性。由于 3个不育材料的显性核不育基因均来 自同一雄性
不育突变体 79—399，所以试验6份材料中不育与可育共同的差异是由显性核不育基因表达引起的。选
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取通过引物组合 A16／T15产生的大约为 300 bp左右差异片段 ，暂时命名为 MS10l，回收后用 T载体克
隆后测序，其序列用 BLAST软件与 NCBI数据库 中已知序列进行 同源性分析。序列 比对结果表 明
MS101的序列与拟南芥第 2条染色体 CHR2v07142(X)2序列 (Thioredoxin)同源性为 88％，E值为 8e一64。
进一步进行蛋白水平上的同源性 比较 ，该序列所编码 的蛋 白与硫氧还蛋白的氨基酸序列 同源性为
89％，E值为 1e一34。序列对比结果如图 2。
A
Thioredoxin
M Sr0l
Thioredoxin
MSr0l
Thioredoxin
M Sr0l
Thioredoxin c AAAc
MSr01 GGAAJT『IBA A Ac
B
Thior~loxln
M Sr0l
ATGAAGTCGG11AI~ ATCA
ATGAAGTCGG TIACATCA
G
G
234
234
Gl ISSLI_s3CISPRLISC l阳 PRTLIIY DlNILFIPKKKII~SMIIRCQTSLGIG
slISSLIClcIsPRLIsc J咖FsIPRTLIlslG鄹 NILFfS xl(IPIA RcCITsLGIG
oredoxln lQKWWEKELKPNMKSVTSPQDLl 84
MSr01 lQKWWEKELKPNMKSVTSPQDLI 84
图 2 MSr01与硫氧环蛋白部分碱基序列比较 (A)及氨基酸序列比较 (B)
口表示相同的碱基或氨基酸；一表示相似氨基酸。
№ ．2 Sequence compah~ ofMSr01 and thiorcdoxin at nudeotide and proteinlevel
Amino acids in black boxes(1 1)and underlines( )are identical and similar respectively
3 讨论
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植物雄性不育涉及大量基因的协同表达 ，多数为具有时空顺序的花药特异表达基因，其中大部分
的雄性不育基因在花粉发育早期发生作用。在小孢子发育过程中所必须的某种物质或间接影响小孢子
发育的某种物质发生改变，也会引起植物的雄性不育，同时发生突变基因的转录产物也可能正向或负
向调控着其他一些基因的表达。目前所鉴定的差异片段均出现在可育池中，即所得到的差异序列均与
育性有关。此结果表明甘蓝显性核不育的产生是一些下游的基因表达受到抑制或减弱的结果 ，可能的
原因是在植物花蕾发育过程中，雄性不育基因抑制和阻断了这些基因的表达 ，从而导致一系列参与小
孢子发育的基因表达发生变化 ，最终导致雄性不育。
cDNA-AFLP技术是研究基因表达的一种新方法，有许多优点。由于使用严格的 PCR条件和加接头
的方法，具有较高的重复性；不仅可以快速简单地观察某一时期的基因表达，而且可以同时观察不同时
期的基因表达 ，有利于系统研究基因表达和基因间的相互作用。在本试验中通过对 cDNA-AFLP所获得的
TDF(Transcript Derived Fra~aents)进行分析 ，揭示了花蕾发育过程中一些基因转录水平上的表达和变化
模式 ，利用 BSA的策略，更使我们可以从中发现与雄性不育相关的序列，为雄性不育的机理研究和雄性
不育基因的克隆提供了一条快速有效的途径。同样，利用 cDNA-AFLP技术与 BSA相结合的策略，也是
快速鉴定并克隆表型差异性状基因表达乃至发育基因的有效途径u卜13,15~。
对 MS101序列的测序结果分析表明该序列与小孢子的发育有关 。在小孢子发育过程中，雄性不育
基因阻断或抑制了硫氧还蛋白的正常表达，而该蛋白是小孢子发育中普遍存在的蛋白，若该蛋白不能
正确合成或合成减弱就会阻断小孢子的正常发育，从而引起甘蓝显性核不育，进一步的功能正在验证
中。对该序列的特异性表达则需要进一步通过不同发育时期及不同器官加以验证。因通过 cDNA-AFLP
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技术获得的只是片段而不是完整的 cDNA，所以要克隆完整的基因需要通过 RACE等其他的方法首先
获得全长的 cDNA。利用基因沉默等技术可以从可育株中沉默该基因，检验是否能引起雄性不育 ，从
而对所获得的差异片段进行功能验证 ，目前该试验正在进行 中。
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Revealed by cDNA-Am
Lou Ping ，Wang Xiaowu ，Guusje．Bonnema2，and Fang Zhiyuan
( Institute ofVegetables and Flowers，Chinese Academy ofAgricuhural Sciences，8e0"／~ 100081，Ch／na； Laboratory ofPto~Breed一
， Wageningen Urdversity， Wagerdngen 6700M ，Netherlands)
Abstract： cDNA—AFLP was used to detect diferentially expressed genes during flower bud development of
male sterile and fertile lines of cabbage an d broccoli． Expression profiles were generated around 26，000 cDNA frag—
ments(128 primer combinations)．Transcriptional changes were observed for 24 cDNA fragments，from which，
1 3 were only expressed in fertile buds，while the other 1 1 were upregulated in fertile buds． Sequencing of a 300 bp
diferential fragment amplified by primer combination A16T15 revealed 89％ similarity to the gene thioredoxin，
which is related to pollen development in the Brassica family．
Key words：Cab bage； Dominant male sterility ；cDNA—AFLP； Diferentially expressed genes
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